Summary
Notatet informasjon om hvordan å bruke kontinuerlig flyt hypoksi kamre for å generere atmosfærer med definerte konsentrasjoner av O
Abstract
Oksygen er viktig for alle metazoans å overleve, med en kjent unntak en. Redusert O 2 tilgjengelighet (hypoksi) kan oppstå under tilstander av sykdommen, normal utvikling eller endringer i miljøforholdene 2-5. Forstå de cellulære signalveier som er involvert i respons til hypoksi kan gi ny innsikt i behandlingsstrategier for ulike menneskelige patologi, fra hjerneslag til kreft. Dette målet er hindret, i hvert fall delvis, ved tekniske problemer forbundet med kontrollert hypoksisk eksponering i genetisk mottagelig modellorganismer.
De nematode Caenorhabditis elegans er ideell som en modell organisme for studier av hypoksisk respons, som det er lett å kultur og genetisk manipulere. Videre er det mulig å studere cellulære responser til spesifikke hypoksisk O 2 konsentrasjon uten konfunderende effekter siden C. elegans innhente O 2 (og andre gasser) ved diffusjon, i motsetning til en lettere luftveiene 6. Faktorer kjent for å være involvert i respons på hypoksi er bevart i C. elegans. Den faktiske respons på hypoksi avhenger av den aktuelle konsentrasjonen av O 2 som er tilgjengelig. I C. elegans, utløser eksponering til moderat hypoksi en transcriptional respons formidles hovedsakelig ved HIF-1, de svært bevarte hypoksi-induserbar transkripsjonsfaktor 6-9. C. elegans embryo krever HIF-1 for å overleve i 5,000-20,000 ppm O 2 7,10 . Hypoksi er en generell betegnelse for "mindre enn vanlig O 2". Normoksiske (normal O 2) kan også være vanskelig å definere. Vi generelt anser romluft, som er 210 000 ppm O 2 for å være normoksiske. Imidlertid har det vist seg at C. elegans har et atferdsmessig preferanse for O 2 konsentrasjoner fra 5-12% (50,000-120,000 ppm O 2) 11. I larvae og voksne, HIF-1 virker å hindre hypoksi-indusert diapause i 5000 ppm O 2 12. Men HIF-1 ikke spille en rolle i responsen på lavere konsentrasjoner av O 2 (anoksi, operasjonell definisjon <10 ppm O 2) 13. I anoksi, C. elegans inngår en reversibel tilstand av suspendert animasjon der alt mikroskopisk observerbar aktivitet opphører 10. Det faktum at ulike fysiologiske responser forekommer i forskjellige forhold fremhever betydningen av å ha eksperimentell kontroll over hypoksisk konsentrasjonen av O 2.
Her presenterer vi en metode for bygging og gjennomføring av miljømessige kamre som produserer pålitelige og reproduserbare hypoksisk forhold med definerte konsentrasjoner av O 2. Den stadige strømmen metoden sikrer rask stabilisering av kammeret og øker stabiliteten i systemet. I tillegg til åpenhet ogtilgjengelighet av kamrene tillater direkte visualisering av dyr blir utsatt for hypoksi. Vi ytterligere demonstrere en effektiv metode for å høste C. elegans prøver raskt etter eksponering for hypoksi, som er nødvendig for å observere mange av de raskt-reverserte endringene som skjer i hypoksi 10,14. Denne metoden gir en grunnleggende fundament som lett kan endres for enkelte laboratorium behov, herunder ulike modellsystemer og en rekke gasser.
Protocol
1. Bygging av Environmental Chambers
- Velg den minste rimelig volumet av kammer som kreves for omfanget av prosjektet. Chamber må være laget av gass (O 2) ugjennomtrengelig materiale. Pyrex krystallisering retter, Anaeropack bokser, eller store, støpte akryl bokser (Ellard Instrumentation), kan brukes. Vi har funnet at 9 50 mm plater kan passe i en 100 x 50 Kimex krystallisering parabolen. Glassplater kan brukes som lokk for Pyrex krystallisering retter.
- Bor et hull i den valgte kammer og passe med en plast mannlig Luer til slange brodd montering (Cole Parmer). Beslag kan sikres ved pipe fitting eller med epoxy. Installer en tilsvarende tilpasning på motsatt side av beholderen for å tillate gass å strømme inn og ut av kammeret. Hvis mulig, offset hull for å øke turbulent blanding.
- Skaff komprimerte gasstanker med definerte O 2 konsentrasjoner (balansert med N 2) som er sertifisert standard for O 2 content eller, for anoksiske forhold, ren N 2 (<10 ppm O 2). Bruk automatiske Omsjaltingen regulatorer for mer langsiktige studier for å unngå å forstyrre oksygennivå i kamrene.
- Organismebiologi respons på hypoksi har vist seg å være temperaturavhengig 15. Ved å plassere kammeret i en inkubator, kan ulike temperaturer opprettholdes. Temperaturer innenfor en inkubator kan være ujevn og som sådan, er det klokt å gjøre bruk av en temperatur datalogger å stadig måle temperaturen inne i kammeret.
2. Koble Gass til Environmental Chamber
- For alle tilkoblinger, bruker en åttendedel-tommers ytre diameter rør koblet sammen med enten snap kontakter eller Kompresjonskoplinger. Tubing bør være ugjennomtrengelig og unreactive med 2 O, som fluorinert etylen-propylen (FEP) eller nylon (Cole Parmer). For en skjematisk av ferdig oppsett, se figur 1.
- Koble compressede hjulkapslene til en flyt kontroll enheten, for eksempel en masse vannmengdebegrenser (Sierra Instruments) eller rotameter (Aalborg). Pass på at oppstrøms press fra tanken er innenfor rekkevidde av flyt-enheten og slangen Barb beslag. To-trinns regulatorene er vanligvis brukt, med den andre scenen satt til ønsket trykk [Se avsnitt tre for å velge riktig vannmengde]
- Hydrat gassen ved boblende gjennom destillert vann ved hjelp av en gass vask flaske med fritted sylinder, deretter direkte inn i en av de beslag på miljøsiden kammer, slik at andre passende åpen for gass eksos (se figur 1). For kortsiktige studier, beskytter gass hydrering mot plate dessication, men fuktighet monitorering kan være nødvendig for langsiktige studier.
- Dow Corning Vacuum fett kan brukes til å forsegle kammeret. Plasser vekter på lokket i kammeret for å sikre en lufttett. For å bekrefte en tett forsegling og tilstrekkelig strøm, holde et lite basseng med vann i håndflaten yvår gloved hånd til ut feste på kammeret og se etter bobler.
3. Velge Flow Rate
- Forutsatt perfekt blanding, det er 90% gass utveksling av gassformig atmosfære hver gang volumet av kammeret blir erstattet (Fick lov). For eksempel, i en 100 cc kammer med en strømningshastighet på 100 cc / min, vil det opprinnelige huset luften i kammeret erstattes med 90% av ønsket gass etter 1 minutt, og vil asymptotisk nærme komplett utveksling med 90% hvert minutt etterpå.
- Høyere hastigheter og mindre containere vil nå din ønskede oksygenkonsentrasjonen raskere. For 100 x 50 Kimex containere (400 cc), en strømningshastighet på 120 cc / min vil nå 99,9% utveksling på 10 minutter (3 utvekslinger). Dette strømningshastighet er egnet for de fleste oksygen forhold. Så vidt vi vet har det ikke vært en systematisk undersøkelse av hvordan frekvensen av endring av O 2-konsentrasjonen påvirker responsen i C. elegans.
- Worms utsatt for hypoksisk forholdene vanligvis unnslippe overflaten av agar plater. For å forhindre dette, plasserer en ring av palmitinsyre (10 mg / ml i etanol) rundt kanten av platene. Den palmitinsyre vil komme ut av løsningen som etanol fordamper, danner en fysisk barriere. Palmitinsyre barrierer påvirker ikke sats på egglegging, fruktbarhet eller levetid i C. elegans 16,17. Gravende forekommer ikke hyppigere i hypoksisk forhold, er så ytterligere forebyggende tiltak generelt ikke nødvendig.
- Generer synkroniserte populasjoner av bleking Gravid voksne i en liten dråpe alkalisk blekemiddel løsning på unseeded nematode vekstmedier (NGM) plater 18. I motsetning til vanlige store batch hypoklorittoppløsninger bleking protokoller, plukke 1-100 dyr i en dråpe blekemiddel løsning på overflaten av en NGM plate, deretter la kloroppløsning å absorbere inn på platen
- Unngå å utsette bleket embryoene hypoksi, da dette kan redusere levedyktighet 13. Å samle unge embryoer (2-4 celler), kan Gravid voksne bli hakket i et lite volum av vann med et barberblad og embryoer flyttet til plater av munnen pipette for senere eksponering for hypoksi.
- Generer synkroniserte populasjoner av bleking Gravid voksne i en liten dråpe alkalisk blekemiddel løsning på unseeded nematode vekstmedier (NGM) plater 18. I motsetning til vanlige store batch hypoklorittoppløsninger bleking protokoller, plukke 1-100 dyr i en dråpe blekemiddel løsning på overflaten av en NGM plate, deretter la kloroppløsning å absorbere inn på platen
- Tett plater på miljøområdet kammeret. Kontroll dyr bør holdes i normoksiske (hus luft) ved samme temperatur som behandlet ormer. Det er ingen observerbar forskjell mellom prøvene igjen i huset luft og de opprettholdt i en identisk kammer med huset luft strømmer over dem. Initiere gasstrømmen og opprettholde eksponering for ønsket tid. For å sikre ensartethet i rampe, sørg for åerstatte vannet i gassen vask flasken før eksponering.
- Til analysen overlevelse av embryo, la ormer å utvikle for 48 timer etter retur til romluft, og da skal de være fjerde stadium larver / dag én voksne. Resultat for overlevelse, sensurere noen ormer som ikke kan forklares.
- For å visualisere dyrene utsettes for hypoksi, flytte ormer til et fall på M9 på en 22 mm 2 dekkglass, og invertere på en pute av 2% agarose i M9 18. Om nødvendig levamisole (25 mm) eller natriumazid (10 mm) kan brukes som bedøvelse. Natriumazid og levamisole kan forvirre noen observasjoner på grunn av toksisitet og bør judiciously brukes 19.
5. Rask Harvest-av hypoksi-eksponerte Worms (Eksempel: Utarbeidelse av prøver for HIF-1 Western Analysis)
Mange hypoksi-induserte effektene er raskt reverseres ved retur til romluft, inkludert gjenopptakelse av eggproduksjonen 12, fosforylering av mitotiske epitoperi embryogenese 13 og nedbrytning av HIF-1 protein 9,20. Rask isolasjon av dyr eksponert for hypoksi er nødvendig for å oppnå reproduserbare effekter i disse forholdene. Med dette oppsettet kan dyr bli slaktet og frosset i flytende nitrogen på mindre enn to minutter. Mens hanskerom hypoksi kamre tillater manipulering av prøver i anoksiske forhold, deres kostnader og praktiske for andre forhold enn anoksi begrense deres nytte.
- Grow Bristol N2 ormer på 4 10 cm høy vekst (HG) plater til et flertall av de ormene er gravid voksne 18. Vask ormer til en 15 mL konisk rør som inneholder en 1:05 basisk blekemiddelløsning og inkuber med rotasjon til ormer begynner å oppløse, ikke mer enn 5 minutter 9. Vask ormene tre ganger med M9, spinning nede på 1500 xg mellom hver vask uten bremsing.
- Plate bleket embryoer inn på 8 150 mm NGM plater og la utvikle seg til L4 larver (~~~HEAD=NNS 48 timer for Bristol N2 ved 22 ° C).Flytt platene til miljø-kamre og utsettes for hypoksisk (1000 ppm, 5000 ppm) og anoksiske (N2) vilkårene for 4 timer. Eksponeringstider vil variere avhengig av eksperimentell design. Mens eksponering for hypoksi har en umiddelbar effekt på graden av egglegging, to celler embryoer dør etter 16-18 timer med eksponering 12. Med denne hypoksi kammeret oppsettet, er den nedre grensen for eksponering begrenset av frekvensen av atmosfæren utveksling nødvendig for å oppnå likevekt.
- Etikett en 1,5 mL microfuge tube og en 15 ml konisk tube for hver eksperimentell prøve. Worms utsatt for hypoksi er mer sannsynlig å holde seg til sidene av røret ved innhøstingen. For å forhindre dette, sted 100 mL av 1% natrium dodecyl sulfat (SDS) i hver 15 ml konisk tube. Hvis SDS hemmer nedstrøms applikasjoner, storfe serum albumin (BSA) kan brukes for å hindre stikker. Rutinemessig bruk av SDS eller BSA ikke synes å ha en tydelig forskjell. Tilsett 50 mL av 2x protein loading dye (4% SDS, 10% 2-Mercaptoethanol og enspore av bromphenol blå i 30% glyserol (w / v)) til 1,5 ml microfuge tube. Ha en Dewar av flytende nitrogen klar.
- Tid trinnene etter fjerning ormene fra hypoksi og posten. Fjern lokket til hypoksisk kammeret, ta en prøve plate, og forsegle kammeret. Bruk destillert vann for å vaske ormer på en nylon filter og hell deretter inn i 15 ml konisk tube. Snurr ormer ned i en stasjonær sentrifuge ved 1500 xg i 15-20 sekunder med brems.
- Bruk en støvsuger for å fjerne det meste av supernatanten fra røret, slik at ormen pellet urørt.
- Ved hjelp av en pipette, flytte ormen pellet i 50 mL til 1,5 ml microfuge tube. Tett røret og dyppe i flytende nitrogen.
- Gjenta til alle prøvene har vært isolert. Følg disse prosedyrene for hus luft kontroll prøver for konsistens. Prøver kan oppbevares ved -20 ° C.
6. Representative Resultater
Organismebiologi effekter av hypoksi kan seesved å undersøke levedyktigheten til voksenlivet av C. elegans (Figur 2). Embryoer lagt av vill-type Bristol (N2) og HIF-1 (ia04) sletting mutanter er alle overleve i huset luft O 2 konsentrasjon (210 000 ppm O 2). N 2 ormer er i stand til å tilpasse seg og overleve til voksen alder i 5000 ppm O 2, mens HIF-1 embryoer ikke er levedyktig. Dette viser at HIF-1 er avgjørende for å tilpasse seg de skiftende nivåer av oksygen tilgjengelig i omgivelsene 10. Verken N2 eller HIF-1 dyr kan overleve eksponering for 1000 ppm O 2.
Visualisering orm direkte i hypoksi er mulig med bruk av en dissekere omfang og klar beholder (figur 3). Ved direkte plassere hypoksi kammer på dissekere omfang, er det ikke behov for å fjerne ormer fra hypoksi å observere organismebiologi reaksjoner. Omfanget kan utstyres med fluorescens illumation (som i figur 3
Figur 1. Eksempel på Hypoksi kammer. Retning gasstrømmen er angitt med piler. Gass lagres i komprimerte gasstanker med definerte O 2 konsentrasjon (1) og en to-trinns regulator er festet (2). Gass går i bunnen av målerøret (3), går ut av toppen på riktig vannmengde. Gass strømmer så inn i boblen kolben (4), fuktighetsgivende gassen (sikre riktig tilkobling av boble kolbe ved å observere bobler). Hydrert gass går deretter inn i hypoksi kammeret ved tilsiget ventilen (5), utsette prøvene for hypoksi. Gassen til slutt åpninger inn i rommet gjennom en eksos hull boret i kammeret.
Figur 2. Levedyktighet av embryo utsatt til 1000 ppm 2 O, 5000 ppm O
Figur 3. Visualisering av C. elegans i hypoksi med mikroskopi. Worms er utsatt for hypoksi ved hjelp av metodene som er skissert. Den gjennomsiktige miljø kammeret (konstruert med en Pyrex krystallisering tallerken og glass plate) er plassert direkte på scenen av en dissekere omfang. To visninger er vist, en inkludert hele gasstrømmen satt opp, den andre med bare kammeret på mikroskopet scenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne metoden gir en strategi for å bygge en hypoksisk miljø som gjør det mulig for miljøer med presise konsentrasjoner av oksygen å bli opprettholdt i laboratoriet. Disse kamrene gir en enkel metode for å utsette organismer til bestemte lave konsentrasjoner av O 2 og overvåke de molekylære og fysiologiske utganger. Den miljømessige kammeret beskrevet er montert av lab i stedet for kommersielt kjøpt og kan dermed endres for å passe behovene til forsøket.
En klar fordel med denne metoden er det kontinuerlig flyt design. Dette eliminerer de vanskelighetene som normalt oppstår med å opprettholde lave konsentrasjoner av O 2 i kamre når den eksterne O 2-konsentrasjonen er mye høyere (210 000 ppm O 2 i luften i rommet). Alternativet er en stoppet-flow metoden, der en hypoksisk miljø opprettholdes i en forseglet kammer. Selv små lekkasjer, som kan være vanskelige å oppdage, preventilere vedlikehold av hypoksisk forhold ved hjelp stoppet-flow metoder. Den kontinuerlige flyten metoden kontinuerlig børsene luften i kammeret med det definerte oksygenkonsentrasjonen i komprimert luft tank og opprettholder et positivt press som hindrer lekkasjer fra forstyrre hypoksisk forholdene.
Innhenting nøyaktige, pre-blandede oksygenkonsentrasjoner fra gassleverandøren løser et annet vanskelig problem med hypoksi. Det er ganske vanskelig å måle ekstremt lave konsentrasjoner av O 2. De fleste O 2 sensorer er diffusjon begrenset og ganske dyrt. Fordi O 2 diffunderer sakte, kan måle lave O 2 konsentrasjoner være treg eller unøyaktig 21. I kontrast er det ganske lett å generere gassblandinger ved å måle vekten av gasser. De blandinger vi jevnlig kjøper er sertifisert standard for å være innenfor 2% O 2-innholdet i den ønskede blanding.
Denne metoden kan brukes til å lokke fram observerbare hypoxia-indusert forandringer både på organismebiologi og molekylært nivå. Selv om denne metoden skisserer overlevelses analyser og rask hele ormen isolasjon for molekylære eksperimenter, det finnes utallige nedstrøms avlesninger som kunne brukes. For eksempel lar dette designet for retningen visualisering av ormer i hypoksi for studier av sanntids atferd og endringer reporter konstruksjoner. For å visualisere ormer med en dissekere omfang, montere kammer med gjennomsiktige bokser med lite volum og minimal høyde. Hele kammer kan plasseres på dissekere omfang og er lett manøvrerbare for optimal visualisering (se figur 3). Det vil også være mulig å observere prøver ved høyere forstørrelse ved hjelp av perfusjon kamre med en invertert mikroskop. Dette krever noen tilpasning av kamrene å grensesnittet det med rør som normalt brukes for gass flow, og bestemme en passende mengde. De representative resultatene vist bare skraper i overflaten av eksperimentelle possibiPensjonsforpliktelser, som hypoksi har vist seg å påvirke cellulære systemer fra DNA syntese til protein degradering 22,23.
Den praktiske natur denne metoden er ikke begrenset til C. elegans. Så lenge passende størrelse kammer brukes, er denne metoden lett kan tilpasses nesten alle modell system. For tilpasning til flytende medier eller cellekultur, oksygen diffusjon konstanter i løsning, outgassing fra plast og tid til å stabilisere seg i kulturen må tas i betraktning, og det kan være mest hensiktsmessig å bruke O 2 permeable kultur plater 24,25.
Det er mulig å modifisere kamrene presenteres i denne protokollen for bruk med andre gasser. For eksempel kan kamre tilpasses for å gi en anoksisk miljø bare ved å utelate den O 2 i den komprimerte gasstanker brukt til å lage en hypoksi kammer (med balansen blir fylt med nitrogen). Dette har åpnet for observasjon av C. elegans i Suspendte animasjon (data ikke vist) 10,13,26. Små modifikasjoner må gjøres basert på egenskapene til gassblandingen som brukes. Sammensetningen av slangen som brukes til rør gass inn og ut av kammeret må kanskje være variert. Noen plast er gjennomtrengelig for CO 2, mens andre er ikke kompatible med korrosive gasser som har hydrogensulfid (H 2 S) 16,26. En liste over kompatible plast kan bli funnet på Cole-Parmer nettside.
For giftige gasser gassen utløpet fra kammeret må ventileres inn i en sertifisert avtrekksskap og hensiktsmessig personlig verneutstyr, som detektorer, må benyttes. I tillegg bør EH & S offiserer rådspørres før du begynner på et eksperiment ved hjelp av potensielt farlige gasser. Etsende gasser kan også kreve spesiell oppmerksomhet. For eksempel kan H 2 S korroderer mange av plast som brukes i standard slange materiale samt messing beslaget vil korrodere. Vi generelt sørge for at alle våteTed plast er Kalrez eller tilsvarende i instrumentene som brukes med H 2 S. Visse gasser kan samhandle med urenheter i vann fra springen, så DiH 2 0 bør brukes i boblen kolben. Spesielle hensyn vedrørende Glass kan også være nødvendig, for eksempel, nødvendiggjør H 2 S utstyr med fuktede O-ringer.
Både organismebiologi og molekylære forandringer er observert bruk av eksperimenter som kan gjennomføres på en dag. Denne evnen til å raskt introdusere prøver å hypoksi gir et verdifullt verktøy i felt fra aldring og kreft til utvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi takker medlemmene av Miller lab for diskusjon og kritisk lesing av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av en ny etterforsker pris fra Nathan Shock Center of Excellence i Grunnleggende biologi Aldring til DLM og National Institutes of Health prisen R00 AG030550 til DLM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tubing (FEP and PTFE) | Cole Parmer Tygon | YO-95821-00 (1/8" FEP) 06605-27 (1/16 x 1/8" PTFE)’ R-3603 | |
| Compression fittings | Seattle Fluid Systems | 06363-58 (M. coupler 1/16") 06363-62 (F. coupler 1/16") 06363-60 (M. coupler 1/8") 06363-61 (F. coupler 1/8") | |
| Flow tube | Aalborg | PMR3-010073 (3 output) PMR1-013520 (1 output) | |
| Mass flow controller | Sierra Instruments | 810S-L-DR-2-OV1-SK1-V1-S1 (Mass Trak) C100L-DD-2-OV1-SV1-PV2-V1-SO-C10 (Smart Trak 2) | |
| Compressed gas tank | AirGas | Made to order | |
| Plastic male Luer to hose barb fittings | Cole Parmer | 45505-41 (500 series 1/16") | |
| Cast acrylic boxes | Ellard Instrumentation | Made to order | |
| Pipe fittings (Brass or stainless steel) | Seattle Fluid Systems | B-402-1 (1/4" nut) B-200-3 (1/8" union tee) B-400-set (1/4" ferrules) B-QM2-B1-200 (QM Body QC) B-200-1-2 (1/8 x 1/8" male conn) | |
| Dow Corning Vacuum Grease | Sigma-Aldrich | Z273554 | |
| AnaeroPack box | Misubishi Gas Chemical Company | R684004 (0.4 liter) R685025 (2.5 liter) R685070 (7.0 liter) | |
| Pyrex gas wash bottle | Sigma-Aldrich | CLS31770500C (500 mL) CLS31770250C (250 mL) CLS31770125C (125 mL) | |
| Palmitic acid | Sigma-Aldrich | P0500 | |
| Goat anti-mouse IgG-horseradish peroxidase | Southern Biotechnology Associates | 1032-05 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminsecent Substrate | Pierce Chemical | 34077 | |
| 100 x 50 glass crystallization dishes | Kimax Kimble | 23000 |
References
- Danovaro, R. The first metazoa living in permanently anoxic conditions. BMC Biology. 8, 30 (2010).
- Birner, P. Overexpression of Hypoxia-inducible Factor 1 alpha Is a Marker for an Unfavorable Prognosis in Early-Stage Invasive Cervical Cancer. Cancer Research. 60, 4693-4696 (2000).
- Harris, A. L. Hypoxia - a key regulatory factor in tumour growth. Nat. Rev. Cancer. 2, 38-47 (2002).
- Ramirez-Bergeron, D. L. Hypoxia affects mesoderm and enhances hemangioblast specification during early development. Development. 131, 4623-4634 (2004).
- Staff, F. E. Wheel-well Stowaways Risk Lethal Levels of Hypoxia and Hypothermia. Human Factors and Aviation. 44, 1-5 (1997).
- Shen, C., Powell-Coffman, J. A. Genetic Analysis of Hypoxia Signaling and Response in C. elegans. Annals of the New York Academy of Sciences. 995, 191-199 (2003).
- Shen, C., Nettleton, D., Jiang, M., Kim, S. K., Powell-Coffman, J. A. Roles of the HIF-1 Hypoxia-inducible Factor during Hypoxia Response in Caenorhabditis elegans. Journal of Biological Chemistry. 280, 20580-20588 (2005).
- Wang, G. L., Jiang, B. H., Rue, E. A., Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92, 5510-5514 (1995).
- Epstein, A. C. R. C. elegans EGL-9 and Mammalian Homologs Define a Family of Dioxygenases that Regulate HIF by Prolyl Hydroxylation. Cell. 107, 43-54 (2001).
- Nystul, T. G., Goldmark, J. P., Padilla, P. A., Roth, M. B. Suspended Animation in C. elegans Requires the Spindle Checkpoint. Science. 302, 1038-1041 (2003).
- Gray, J. M. Oxygen sensation and social feeding mediated by a C. elegans guanylate cyclase homologue. Nature. 430, 317-322 (2004).
- Miller, D. L., Roth, M. B. C. Elegans Are Protected from Lethal Hypoxia by an Embryonic Diapause. Current Biology. 19, 1233-1237 (2009).
- Padilla, P. A., Nystul, T. G., Zager, R. A., Johnson, A. C. M., Roth, M. B. Dephosphorylation of Cell Cycle-regulated Proteins Correlates with Anoxia-induced Suspended Animation in Caenorhabditis elegans. Molecular Biology of the Cell. 13, 1473-1483 (2002).
- Hu, C. -J., Wang, L. -Y., Chodosh, L. A., Keith, B., Simon, M. C. Differential Roles of Hypoxia-Inducible Factor 1{alpha} (HIF-1{alpha}) and HIF-2{alpha} in Hypoxic Gene Regulation. Molecular and Cellular Biology. 23, 9361-9374 (2003).
- Treinin, M. HIF-1 is required for heat acclimation in the nematode Caenorhabditis elegans. Physiological Genomics. 14, 17-24 (2003).
- Miller, D. L., Roth, M. B. Hydrogen sulfide increases thermotolerance and lifespan in Caenorhabditis elegans. PNAS. 104, 20618-20622 (2007).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans. Cell Stress Chaperones. 8, 1-7 (2003).
- Salceda, S., Caro, J. Hypoxia-inducible Factor 1α (HIF-1α) Protein Is Rapidly Degraded by the Ubiquitin-Proteasome System under Normoxic Conditions. Journal of Biological Chemistry. 272, 22642-22647 (1997).
- Theilacker, J. C., White, M. J. Diffusion of Gases in Air and Its Affect on Oxygen Deficiency Hazard Abatement. AIP Conference Proceedings. 823, 305-312 (2006).
- Chua, B., Kao, R. L., Rannels, D. E., Morgan, H. E. Inhibition of protein degradation by anoxia and ischemia in perfused rat hearts. Journal of Biological Chemistry. 254, 6617-6623 (1979).
- Probst, G., Riedinger, H. Jr, Martin, P., Engelcke, M., Probst, H. Fast Control of DNA Replication in Response to Hypoxia and to Inhibited Protein Synthesis in CCRF-CEM and HeLa Cells. Biological Chemistry. 380, 1371-1382 (1999).
- Semenza, G. L., Sen, C. K. Oxygen Sensing. 381, Academic Press. (2004).
- Chan, K., Roth, M. B. Anoxia-Induced Suspended Animation in Budding Yeast as an Experimental Paradigm for Studying Oxygen-Regulated Gene Expression. Eukaryotic Cell. 7, 1795-1808 (2008).
- Nystul, T. G., Roth, M. B. Carbon monoxide-induced suspended animation protects against hypoxic damage in Caenorhabditis elegans. PNAS. 101, 9133-9136 (2004).
