Summary
Denna uppsats beskriver hur du använder kontinuerligt flöde hypoxi kamrar för att skapa atmosfärer med definierade koncentrationer av O
Abstract
Syre är nödvändigt för alla metazoer att överleva, med en känd undantag 1. Minskad O 2 tillgänglighet (hypoxi) kan uppstå vid tillstånd av sjukdom, en normal utveckling eller förändringar i miljöförhållanden 2-5. Förstå de cellulära signalvägar som är involverade i svar på hypoxi skulle kunna ge nya insikter om behandlingsstrategier för olika mänskliga sjukdomar, från stroke till cancer. Detta mål har hindrat, åtminstone delvis, av tekniska svårigheter i samband med kontrollerad hypoxisk exponering i genetiskt mottagliga modellorganismer.
Nematoden Caenorhabditis elegans är idealiskt lämpad som en modell organism för studium av hypoxisk respons, eftersom det är lätt att odla och genetiskt manipulera. Dessutom är det möjligt att studera cellulära svar på specifika hypoxiska O 2 koncentrationer utan störande effekter eftersom C. elegans få O 2 (och andra gaser) genom diffusion, i motsats till en förenklad andningsorganen 6. Faktorer som är kända att vara inblandade i svaret på hypoxi bevaras i C. elegans. Den faktiska svar på hypoxi beroende på den specifika koncentration av O 2 som är tillgänglig. I C. elegans, framkallar exponering för måttliga hypoxi en transkriptionell svar förmedlas till stor del av HIF-1, högt bevarade hypoxi-inducerbar transkription faktor 6-9. c. elegans embryon kräver HIF-1 för att överleva i 5,000-20,000 ppm O2 7,10 . Hypoxi är en allmän term för "mindre än normalt O 2". Normoxi (normal O 2) kan också vara svårt att definiera. Vi anser generellt rumsluft, vilket är 210.000 ppm O 2 för att vara normoxi. Emellertid har det visat sig att C. elegans har en beteendevetenskaplig föredrar O 2 halter från 5-12% (50,000-120,000 ppm O 2) 11. I Larvae och vuxna, HIF-1 verkar för att förhindra hypoxi-inducerad diapause i 5000 ppm O2 12. Emellertid spelar HIF-1 inte en roll i svaret till lägre koncentrationer av O 2 (anoxi, operationell definition <10 ppm O2) 13. I anoxi, C. elegans ingår ett reversibelt tillstånd av skendöd där alla mikroskopiskt iakttagbara verksamhet upphör 10. Det faktum att olika fysiologiska reaktioner förekommer i olika förhållanden belyser vikten av att ha experimentell kontroll över hypoxiska koncentrationen av O 2.
Här presenterar vi en metod för konstruktion och genomförande av miljökammare som producerar tillförlitliga och reproducerbara hypoxiska förhållanden med definierade koncentrationer av O 2. Den kontinuerliga flödesmetoden säkerställer snabb ekvilibrering av kammaren och ökar stabiliteten hos systemet. Dessutom är öppenhet ochtillgängligheten av kamrarna möjliggör direkt visualisering av djur som utsätts för hypoxi. Vi visar dessutom en effektiv metod för att skörda C. elegans prover snabbt efter exponering för hypoxi, vilket är nödvändigt för att observera många av de snabbt omvända förändringar som sker i hypoxi 10,14. Denna metod ger ett grundläggande fundament som lätt kan modifieras för enskilt laboratorium behov, inklusive olika modellsystem och en mängd olika gaser.
Protocol
1. Konstruktion av Miljökammare
- Välj den minsta rimliga volymen hos kammaren krävs för omfattningen av projektet. Kammaren måste göras av gas (O 2) ogenomträngligt material. Pyrex kristallisation rätter, Anaeropack lådor, eller stora gjutna akryl lådor (Ellard Instrumentation), kan användas. Vi har funnit att 9 50 mm plattor kan passa i en 100 x 50 Kimex kristallisationsskål. Glasplattor kan användas som lock för Pyrex kristallisation rätter.
- Borra ett hål i den valda kammaren och passar med en plast Luer att slanganslutning koppling (Cole Parmer). Beslag kan säkras genom rörkoppling eller med epoxi. Installera ett liknande passande på den motsatta sidan av behållaren för att tillåta gas att strömma in i och ut ur kammaren. Om möjligt motverka hål för att öka turbulent blandning.
- Skaffa komprimerade gasbehållare med definierade O 2 halter (balanserad med N 2) som är certifierade standard för O 2 COntent eller, för anoxiska betingelser, ren N 2 (<10 ppm O2). Använd automatisk omkoppling regleringsmyndigheter för långsiktiga studier för att undvika störningar i de syrehalterna i kamrarna.
- Organismens svar på hypoxi har visat sig vara temperaturberoende 15. Genom att placera den kammare i en inkubator, kan olika temperaturer upprätthållas. Temperaturer inom en inkubator kan vara ojämn och som sådan är det klokt att använda en temperatur datalogger att konstant mäta temperaturen inne i kammaren.
2. Ansluta gasen till miljökammaren
- För alla anslutningar, använd en åttondel-tums yttre diameter rör förbundna med antingen snäppkontaktdonen eller klämringskoppling. Slangen vara ogenomtränglig och icke-reaktiv med O 2, såsom fluorerad etylenpropylen (FEP) eller nylon (Cole Parmer). För en schematisk bild av den kompletta konfigurationen, se figur 1.
- Anslut compressade gastankar till ett flöde styranordning, såsom en massflödesstyrenhet (Sierra Instruments) eller rotameter (Aalborg). Säkerställa att uppströms tryck från tanken är inom området av flödet anordningen och slanganslutning kopplingar. Två-stegs regulatorer används i allmänhet, med det andra steget in på önskat tryck [Se avsnitt tre för val av lämplig flödet]
- Hydrat gasen genom att bubbla genom destillerat vatten med hjälp av en flaska gas tvätt med frittat cylinder, därefter direkt till en av fästanordningar på miljön kammaren, medan den andra kopplingen öppen för avgasflödet (se figur 1). För korttidsstudier, skyddar gas fukt mot plattan uttorkning, men luftfuktigheten övervakning kan vara nödvändig för långtidsstudier.
- Dow Corning Vakuum Fett kan användas för att försegla kammaren. Ställe vikter på locket hos kammaren för att säkerställa en lufttät tätning. För att bekräfta en tät förslutning och tillräckligt flöde håller en liten pool av vatten i handflatan yvårt behandskade hand till UT montering på kammaren och kontrollera bubblor.
3. Välja Flöde
- Under antagande av perfekt blandning, finns det 90% gasutbyte av den gasformiga atmosfären varje gång volymen av kammaren är ersatt (Ficks lag). Till exempel, i en 100 cc kammare med en flödeshastighet av 100 cm ^ / min, kommer den ursprungliga huset luften i kammaren ersätts med 90% av önskad gas efter 1 minut, och kommer asymptotiskt närma fullständigt utbyte av 90% per minut därefter.
- Högre flöden och mindre behållare kommer att nå önskade syrekoncentration snabbare. För 100 x 50 Kimex behållare (400 cm ^), en flödeshastighet av 120 cm ^ / min når 99,9% utbyte på 10 minuter (3 byten). Detta flöde är lämplig för de flesta mängd syre. Så vitt vi vet har det inte funnits en systematisk undersökning av hur graden av förändring av O 2-koncentration påverkar svaret i C. elegans.
- Maskar som utsätts för hypoxiska betingelser fly vanligen på ytan av agarplattor. För att förhindra detta, placera en ring av palmitinsyra (10 mg / ml i etanol) runt kanten av plattorna. Den palmitinsyra kommer ut ur lösning när etanol avdunstar och bildar en fysikalisk barriär. Palmitinsyraoljor hinder påverkar inte graden av äggläggning fruktsamhet eller livslängd i C. elegans 16,17. Gräva inte sker oftare i hypoxiska förhållanden, är så ytterligare förebyggande åtgärder inte erfordras i allmänhet.
- Generera synkroniserade befolkningar genom blekning gravida vuxna i en liten droppe av alkalisk lut lösning på oympade media nematodtillväxt (NGM) plattor 18. I motsats till vanliga stor sats hypokloritblekmedlet protokoll, plocka 1-100 djur i en droppe av blekmedel på ytan av en platta NGM, låt sedan bleklösning att absorbera in i plattan
- Undvik att utsätta blekt embryon till hypoxi, eftersom detta kan minska lönsamheten 13. Att samla unga embryon (2-4 celler), kan gravida vuxna hackas i en liten volym av vatten med ett rakblad och embryon flyttade till plattor i munnen pipett för efterföljande exponering för hypoxi.
- Generera synkroniserade befolkningar genom blekning gravida vuxna i en liten droppe av alkalisk lut lösning på oympade media nematodtillväxt (NGM) plattor 18. I motsats till vanliga stor sats hypokloritblekmedlet protokoll, plocka 1-100 djur i en droppe av blekmedel på ytan av en platta NGM, låt sedan bleklösning att absorbera in i plattan
- Täta plattor på miljöområdet kammaren. Kontroll djur skall hållas i normoxi (hus luft) vid samma temperatur som behandlas maskar. Det är ingen märkbar skillnad mellan prov kvar i huset luften och de upprätthålls i ett identiskt kammare med huset luft som strömmar över dem. Initiera gasflöde och bibehålla exponering för önskad tid. För att säkerställa enhetlighet i ramp, se till attersätta vatten i gasen tvättflaska före exponering.
- För att analysera överlevnad av embryon, tillåter maskarna att utveckla under 48 h efter återgång till rumsluft, vid vilken punkt de bör vara fjärde larvstadiet / dag en vuxna. Betyg för överlevnad, censurera alla maskar som inte kan redovisas.
- Att visualisera djur exponerade för hypoxi, flytta maskar att en droppe av M9 på en 22 mm täckglas 2 och invertera på en dyna av 2% agaros i M9 18. Om så är nödvändigt, levamisol (25 mM) eller natrium-azid (10 mM) kan användas som anestetikum. Natriumazid och levamisol kan förbrylla några iakttagelser på grund av toxicitet och bör klokt användas 19.
5. Snabb Skörd av hypoxi-exponerade Worms (Exempel: Beredning av prover för HIF-1 Western analys)
Många hypoxi-inducerade effekter snabbt reverseras vid återgång till rumsluften, bland annat återupptagandet av äggproduktion 12, fosforylering av mitotiska epitoperi embryogenes 13 och nedbrytning av HIF-1-proteinet 9,20. Snabb isolering av djur exponerade för hypoxi erfordras för att erhålla reproducerbara effekter vid dessa tillstånd. Med denna inställning kan djuren skördas och fryses i flytande kväve på mindre än två minuter. Medan handskfack hypoxi kammare medger manipulering av prover i syrefria förhållanden, deras kostnader och praktiska För andra förhållanden än syrebrist begränsar deras användbarhet.
- Odla Bristol N2 maskar på 4 10 cm hög tillväxt (HG) plattor tills en majoritet av maskar är gravida vuxna 18. Tvätta maskar till en 15 ml koniskt rör innehållande en 1:5 alkalisk lut-lösning och inkubera med rotation tills maskar börja upplösas, inte mer än 5 minuter 9. Tvätta maskarna tre gånger med M9, spinning ner på 1500 xg mellan varje tvätt utan bromsning.
- Plate blekt embryon på 8 150 mm NGM plattor och låt utvecklas till L4 larver (ca 48 timmar för Bristol N2 vid 22 ° C).Flytta plattor till miljö-kammare och utsättas för hypoxisk (1.000 ppm, 5.000 ppm) och anoxiska (N2) Villkor för 4 timmar. Exponeringstider kommer att variera beroende på experimentets utformning. Trots att exponering för hypoxi har en omedelbar effekt på graden av äggläggning två cellembryon dör efter 16-18 timmars exponering 12. Med denna hypoxi kammare installationen är den nedre gränsen för exponering begränsas av graden av atmosfären utbytet som krävs för att uppnå jämvikt.
- Etiketten en 1,5 ml mikrofugrör och en 15 ml koniskt rör för varje experimentellt prov. Maskar som utsätts för hypoxi är mer benägna att hålla fast vid sidorna av röret under skörd. För att förhindra detta ställe 100 | il av 1% natriumdodecylsulfat (SDS) i varje 15 ml koniskt rör. Om SDS inhiberar efterföljande tillämpningar, bovint serumalbumin (BSA) kan användas för att förhindra klibbning. Rutinmässig användning av SDS eller BSA verkar inte ha en uppenbar skillnad. Tillsätt 50 pl av 2x proteinladdning färgämne (4% SDS, 10% 2-merkaptoetanol och enspår av bromfenolblå i 30% glycerol (vikt / volym)) till 1,5 ml mikrofugrör. Har en Dewar av flytande kväve redo.
- Tid stegen efter avlägsnande av maskarna från hypoxi och rekord. Ta bort locket till hypoxiska kammaren, ta ett prov platta och återförslut kammaren. Använd destillerat vatten för att tvätta maskar på ett nylonfilter och häll sedan i 15 ml koniska rör. Snurra maskarna i en stationär centrifug vid 1500 xg under 15-20 sekunder med broms.
- Använda ett vakuum för att avlägsna det mesta av supernatanten från röret och lämnar masken pelleten orörd.
- Med hjälp av en pipett, flytta masken pelleten i 50 pl till 1,5 ml mikrofugrör. Försegla röret och nedsänka i flytande kväve.
- Upprepa tills alla prover har isolerats. Följ dessa förfaranden för hus luft kontrollprover för konsistens. Prover kan lagras vid -20 ° C.
6. Representativa resultat
Organismbiologi effekterna av hypoxi kan sesgenom att undersöka lönsamheten till vuxenlivet av C. elegans (Figur 2). Embryon som av vild-typ Bristol (N2) och HIF-1 (ia04) deletionsmutanter överlever alla i huset luften O 2 koncentrationer (210.000 ppm O 2). N 2 maskar kan anpassa sig och överleva till vuxen i 5.000 ppm O 2, medan HIF-1 embryon är livskraftiga. Detta visar att HIF-1 är nödvändig för anpassning till de förändrade nivåer av syre finns i miljön 10. Varken N2 eller HIF-1 djur kan överleva exponering för 1.000 ppm O 2.
Visualisera mask direkt på hypoxi är möjligt med användning av en dissektionsmikroskop och klar behållare (figur 3). Genom direkt placering av hypoxi kammaren på dissektionsmikroskop, finns det inget behov av att avlägsna de maskar från hypoxi att observera organismbiologi reaktioner. Omfånget kan vara försedd med fluorescens illumation (såsom i figur 3
Figur 1. Exempel på Hypoxi kammaren. Riktningen för gasflödet indikeras med pilar. Gas lagras i komprimerad gas tankar med definierade O 2 koncentrationer (1) och en tvåstegs regulator bifogas (2). Gasen kommer in i botten för flödet rör (3), som lämnar toppen på den korrekta flödet. Gasen strömmar därefter in i bubblan kolven (4), hydratisering gasen (säkerställa korrekt anslutning av bubblan kolv genom att observera bubblor). Hydratiserad gas passerar därefter in i hypoxi kammaren vid inloppsventilen (5), att utsätta proverna för hypoxi. Gasen ventilerna slutligen in i rummet genom ett avgassystem hål borrat i kammaren.
Figur 2. Livskraft embryon utsätts till 1.000 ppm O 2, 5.000 ppm O
Figur 3. Visualisering av C. elegans i hypoxi med mikroskopi. Worms utsätts för hypoxi med de beskrivna metoderna. Det transparenta miljökammare (konstruerat med en pyrex kristallisationsskål och glasplåten) placeras direkt på stadiet av en dissektionsmikroskop. Två vyer visas, en innefattande hela gasflödet inrättat, den andra med enbart kammaren på mikroskopställningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna metod uppvisar en strategi för att konstruera en hypoxisk miljö som tillåter för miljöer med exakta koncentrationer av syre som skall bibehållas i laboratoriet. Dessa kammare tillhandahålla en enkel metod för att exponera organismer till specifika låga koncentrationer av O 2 och övervaka de molekylära och fysiologiska resultat. Den omgivande kammaren beskrivits monteras genom labbet stället för kommersiellt inköpt och kan således modifieras för att passa behoven av experimentet.
En distinkt fördel med denna metod är det kontinuerliga flödet konstruktion. Detta eliminerar de svårigheter som normalt påträffas med bibehållande av låga koncentrationer av O 2 i kamrarna när den externa O 2-koncentrationen är mycket högre (210 tusen ppm O2 i luften i rummet). Alternativet är en stoppat flöde metod, i vilken en hypoxisk miljö upprätthålls i en förseglad kammare. Även små läckor, som kan vara svåra att upptäcka, preventilera upprätthållande av hypoxiska betingelser med användning av stoppat flöde metoder. Det kontinuerliga flödet metoden börser kontinuerligt luften i kammaren med den definierade syrekoncentrationen i den komprimerade luften tanken och underhåller ett positivt tryck som förhindrar läckage från att störa de hypoxiska förhållanden.
Skaffa exakta, pre-blandade syre koncentrationer från gasleverantören löser ett svårt problem med hypoxi. Det är ganska svårt att mäta extremt låga koncentrationer av O 2. De flesta O 2 sensorer är diffusion begränsade och ganska dyr. Eftersom O 2 diffunderar långsamt, kan mätning av låga O 2 halter vara långsam eller felaktig 21. I motsats härtill är det ganska lätt att generera gasblandningar genom att mäta vikten av gaser. Blandningarna vi regelbundet köper är certifierade standard ligga inom 2% O 2-innehåll i den önskade blandningen.
Denna metod kan användas för att framkalla observerbar hypoxia-inducerade förändringar både på organismbiologi och molekylär nivå. Även om denna metod beskriver överlevnad analyser och snabba hela larven isolering för molekylär experiment, det finns mängder nedströms avläsning som skulle kunna användas. Till exempel tillåter denna konstruktion för riktning visualisering av maskar i hypoxi för studium av realtid beteende och ändringar reporterkonstruktioner. Att visualisera maskar med ett dissektionsmikroskop, montera kammaren med genomskinliga lådor med liten volym och minimal höjd. Hela kammaren kan placeras på skärande omfattning och är lätt att manövrera för optimal visualisering (se figur 3). Det skulle också vara möjligt att observera prover vid högre förstoring med användning av perfusionskammare med ett inverterat mikroskop. Detta kräver en viss anpassning av kamrarna för att samverka det med slang som normalt används för gasflöde och bestämma en lämplig flöde. De representativa visade resultaten skrapa endast ytan av experimentell possibimuner, vilket hypoxi har visat att påverka cellulära system från DNA-syntes till protein nedbrytning 22,23.
Den praktiska naturen hos denna metod är inte begränsad till C. elegans. Så länge som lämplig storlek kammare används, är denna metod lätt kan anpassas till nästan vilken modellsystem. För anpassning till flytande medium eller cellodling, syre diffusionskonstanter i lösning, avgasning av plast och tid till jämvikt i kultur måste tas i beaktande, och det kan vara mest lämpligt att använda O 2 genomsläppliga odlingsplattor 24,25.
Det är möjligt att modifiera kamrarna som presenteras i detta protokoll för användning med andra gaser. Till exempel kan kamrarna anpassas för att tillhandahålla en anoxisk miljö enbart genom att utelämna O 2 i den komprimerade gasen tankar som används för att skapa en hypoxi kammare (varvid resten är fylld med kvävgas). Detta har möjliggjort för observation av C. elegans i suspavslutades animering (data ej visade) 10,13,26. Små ändringar måste göras utifrån egenskaperna hos den använda gasblandningen. Sammansättningen av det rör som används för att röret gas in i och ut ur kammaren kan behöva varieras. Vissa plaster är genomsläppliga för CO 2, medan andra inte är kompatibla med frätande gaser som har svavelväte (H 2 S) 16,26. En lista över kompatibla plaster kan hittas på Cole-Parmer hemsida.
För giftiga gaser gasutloppet från kammaren måste ventileras i ett certifierat dragskåp och lämpligt personlig skyddsutrustning, såsom detektorer, måste användas. Dessutom bör EH & S officerare höras innan något experiment med potentiellt farliga gaser. Korrosiva gaser kan också kräva särskild uppmärksamhet. Till exempel kan H2S-korrodera många av de plaster som används i standard slangmaterialet liksom mässing korroderar. Vi generellt se till att alla våtaTed plast är Kalrez eller motsvarande i instrument som används med H 2 S. Vissa gaser kan interagera med orenheter i kranvatten, så DIH 2 0 skall användas i bubblan kolv. Särskilda överväganden om glas kan också krävas, till exempel, kräver H 2 S utrustning med våta O-ringar.
Både organismbiologi och molekylära förändringar observeras att utnyttja experiment som kan genomföras på en dag. Denna förmåga att snabbt införa prover till hypoxi ger ett värdefullt verktyg i fält från åldrande och cancer till utveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar medlemmar Miller lab för diskussion och kritisk läsning av manuskriptet. Detta arbete stöddes av en ny utredare utmärkelse från Nathan Shock Center of Excellence i Basic Biology of Aging till DLM och National Institutes of Health utmärkelse R00 AG030550 till DLM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tubing (FEP and PTFE) | Cole Parmer Tygon | YO-95821-00 (1/8" FEP) 06605-27 (1/16 x 1/8" PTFE)’ R-3603 | |
| Compression fittings | Seattle Fluid Systems | 06363-58 (M. coupler 1/16") 06363-62 (F. coupler 1/16") 06363-60 (M. coupler 1/8") 06363-61 (F. coupler 1/8") | |
| Flow tube | Aalborg | PMR3-010073 (3 output) PMR1-013520 (1 output) | |
| Mass flow controller | Sierra Instruments | 810S-L-DR-2-OV1-SK1-V1-S1 (Mass Trak) C100L-DD-2-OV1-SV1-PV2-V1-SO-C10 (Smart Trak 2) | |
| Compressed gas tank | AirGas | Made to order | |
| Plastic male Luer to hose barb fittings | Cole Parmer | 45505-41 (500 series 1/16") | |
| Cast acrylic boxes | Ellard Instrumentation | Made to order | |
| Pipe fittings (Brass or stainless steel) | Seattle Fluid Systems | B-402-1 (1/4" nut) B-200-3 (1/8" union tee) B-400-set (1/4" ferrules) B-QM2-B1-200 (QM Body QC) B-200-1-2 (1/8 x 1/8" male conn) | |
| Dow Corning Vacuum Grease | Sigma-Aldrich | Z273554 | |
| AnaeroPack box | Misubishi Gas Chemical Company | R684004 (0.4 liter) R685025 (2.5 liter) R685070 (7.0 liter) | |
| Pyrex gas wash bottle | Sigma-Aldrich | CLS31770500C (500 mL) CLS31770250C (250 mL) CLS31770125C (125 mL) | |
| Palmitic acid | Sigma-Aldrich | P0500 | |
| Goat anti-mouse IgG-horseradish peroxidase | Southern Biotechnology Associates | 1032-05 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminsecent Substrate | Pierce Chemical | 34077 | |
| 100 x 50 glass crystallization dishes | Kimax Kimble | 23000 |
References
- Danovaro, R. The first metazoa living in permanently anoxic conditions. BMC Biology. 8, 30 (2010).
- Birner, P. Overexpression of Hypoxia-inducible Factor 1 alpha Is a Marker for an Unfavorable Prognosis in Early-Stage Invasive Cervical Cancer. Cancer Research. 60, 4693-4696 (2000).
- Harris, A. L. Hypoxia - a key regulatory factor in tumour growth. Nat. Rev. Cancer. 2, 38-47 (2002).
- Ramirez-Bergeron, D. L. Hypoxia affects mesoderm and enhances hemangioblast specification during early development. Development. 131, 4623-4634 (2004).
- Staff, F. E. Wheel-well Stowaways Risk Lethal Levels of Hypoxia and Hypothermia. Human Factors and Aviation. 44, 1-5 (1997).
- Shen, C., Powell-Coffman, J. A. Genetic Analysis of Hypoxia Signaling and Response in C. elegans. Annals of the New York Academy of Sciences. 995, 191-199 (2003).
- Shen, C., Nettleton, D., Jiang, M., Kim, S. K., Powell-Coffman, J. A. Roles of the HIF-1 Hypoxia-inducible Factor during Hypoxia Response in Caenorhabditis elegans. Journal of Biological Chemistry. 280, 20580-20588 (2005).
- Wang, G. L., Jiang, B. H., Rue, E. A., Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92, 5510-5514 (1995).
- Epstein, A. C. R. C. elegans EGL-9 and Mammalian Homologs Define a Family of Dioxygenases that Regulate HIF by Prolyl Hydroxylation. Cell. 107, 43-54 (2001).
- Nystul, T. G., Goldmark, J. P., Padilla, P. A., Roth, M. B. Suspended Animation in C. elegans Requires the Spindle Checkpoint. Science. 302, 1038-1041 (2003).
- Gray, J. M. Oxygen sensation and social feeding mediated by a C. elegans guanylate cyclase homologue. Nature. 430, 317-322 (2004).
- Miller, D. L., Roth, M. B. C. Elegans Are Protected from Lethal Hypoxia by an Embryonic Diapause. Current Biology. 19, 1233-1237 (2009).
- Padilla, P. A., Nystul, T. G., Zager, R. A., Johnson, A. C. M., Roth, M. B. Dephosphorylation of Cell Cycle-regulated Proteins Correlates with Anoxia-induced Suspended Animation in Caenorhabditis elegans. Molecular Biology of the Cell. 13, 1473-1483 (2002).
- Hu, C. -J., Wang, L. -Y., Chodosh, L. A., Keith, B., Simon, M. C. Differential Roles of Hypoxia-Inducible Factor 1{alpha} (HIF-1{alpha}) and HIF-2{alpha} in Hypoxic Gene Regulation. Molecular and Cellular Biology. 23, 9361-9374 (2003).
- Treinin, M. HIF-1 is required for heat acclimation in the nematode Caenorhabditis elegans. Physiological Genomics. 14, 17-24 (2003).
- Miller, D. L., Roth, M. B. Hydrogen sulfide increases thermotolerance and lifespan in Caenorhabditis elegans. PNAS. 104, 20618-20622 (2007).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans. Cell Stress Chaperones. 8, 1-7 (2003).
- Salceda, S., Caro, J. Hypoxia-inducible Factor 1α (HIF-1α) Protein Is Rapidly Degraded by the Ubiquitin-Proteasome System under Normoxic Conditions. Journal of Biological Chemistry. 272, 22642-22647 (1997).
- Theilacker, J. C., White, M. J. Diffusion of Gases in Air and Its Affect on Oxygen Deficiency Hazard Abatement. AIP Conference Proceedings. 823, 305-312 (2006).
- Chua, B., Kao, R. L., Rannels, D. E., Morgan, H. E. Inhibition of protein degradation by anoxia and ischemia in perfused rat hearts. Journal of Biological Chemistry. 254, 6617-6623 (1979).
- Probst, G., Riedinger, H. Jr, Martin, P., Engelcke, M., Probst, H. Fast Control of DNA Replication in Response to Hypoxia and to Inhibited Protein Synthesis in CCRF-CEM and HeLa Cells. Biological Chemistry. 380, 1371-1382 (1999).
- Semenza, G. L., Sen, C. K. Oxygen Sensing. 381, Academic Press. (2004).
- Chan, K., Roth, M. B. Anoxia-Induced Suspended Animation in Budding Yeast as an Experimental Paradigm for Studying Oxygen-Regulated Gene Expression. Eukaryotic Cell. 7, 1795-1808 (2008).
- Nystul, T. G., Roth, M. B. Carbon monoxide-induced suspended animation protects against hypoxic damage in Caenorhabditis elegans. PNAS. 101, 9133-9136 (2004).
