Summary
Nous démontrons un protocole dans lequel l'administration de l'agent génotoxique azoxyméthane (AOM), suivie de trois cycles de sodium pro-inflammatoire du sulfate de dextran (DSS) rapidement et génère constamment des tumeurs du côlon chez des souris présentant des similitudes morphologiques et moléculaires à celles observées dans la colite humaine associée à un cancer.
Abstract
Les personnes atteintes de la maladie inflammatoire de l'intestin (MICI) comme la maladie de Crohn (MC) ou de rectocolite hémorragique (RCH) sont à risque accru de développer un cancer colorectal (CCR) sur les individus en bonne santé. Ce risque est proportionnel à la durée et l'étendue de la maladie, avec une incidence cumulée atteint 30% chez les personnes ayant de longue date UC avec atteinte colique généralisée. 1 dysplasie colique au cours des MICI et de la colite associée cancer (CAC) sont censés se développer en raison des cycles répétés de lésions des cellules épithéliales et la réparation alors que ces cellules sont baignées dans un milieu de cytokine inflammatoire chronique. 2 Tout cancers spontanés et de la colite associée à partager la qualité des adénocarcinomes étant, la séquence des événements moléculaires qui sous-tendent l'on croit être différent. 3 Ce distinction affirme la nécessité pour les modèles animaux spécifiques du CAC.
Plusieurs modèles de souris existent actuellement pour l'étude de la CAC. Dextran sulfate sodium (DSS), un agent avec des effets toxiques directs sur l'épithélium du côlon, peut être administré dans l'eau potable à des souris dans des cycles multiples pour créer un état inflammatoire chronique. Avec une durée suffisante, certains de ces souris seront développent des tumeurs. 4 Le développement de la tumeur est accélérée dans ce modèle s'il est administré dans un cadre pro-cancérigènes. Ceux-ci incluent des souris porteuses de mutations génétiques dans les voies de la tumorigenèse (APC, p53, Msh2), ainsi que des souris prétraitées avec des agents génotoxiques (azoxyméthane [OMA], le 1,2-diméthylhydrazine [DMH]) 5.
La combinaison de la DSS avec AOM en tant que modèle de la colite associée cancer a gagné en popularité pour sa reproductibilité, la puissance, des prix bas, et la facilité d'utilisation. Même si elles ont un mécanisme commun, AOM a été trouvé pour être plus puissant et stable en solution que DMH. Alors que le développement de tumeurs dans d'autres modèles nécessite généralement plusieurs mois, les souris injectées avec AOM et ensuite traité avec DSS développer des tumeurs adéquates dans uns peu que 7-10 semaines. 6, 7 Enfin, l'OMA et le DSS peut être administré à des souris de n'importe quel fond génétique (knock out, transgéniques, etc) sans croisement d'une souche oncogène spécifique. Ici, nous démontrons un protocole pour l'inflammation axée sur la tumorigenèse du côlon chez des souris en utilisant une seule injection d'AOM suivie de trois cycles de sept jours de DSS sur une période de 10 semaines. Ce modèle induit des tumeurs avec des modifications histologiques et moléculaires ressemblant étroitement à celles qui se produisent chez l'homme CAC et fournit un modèle très précieux pour l'étude de l'oncogenèse et la chimioprévention dans cette maladie 8.
Protocol
1. L'induction du cancer colite associée
- Mettez de côté des cages de sexe et appariés par l'âge 6-8 souris semaines d'âge à être utilisées pour les groupes expérimentaux et de contrôle. Les souris peuvent être étiquetées individuellement avec des marques ou des clips d'oreille queue.
- Au jour 0, le poids de base d'enregistrement et d'injecter par voie intrapéritonéale chaque souris (IP) de 10 mg / kg de solution OMA de travail (1 mg / ml dans une solution saline isotonique, dilué de 10 mg / ml de solution mère dans dH2O conservés à -20 ° C) . Basé sur l'expérience, cette dose peut être ajustée entre 7-14 mg / kg et / ou répétée au début de l'expérience.
Attention: AOM est un agent génotoxique volatile et doivent être manipulés avec soin selon les fiches de sécurité. Les dilutions doivent être préparées dans une hotte chimique, maintenue sur glace, et jetés en suivant des protocoles spécifiques institution.
- Faire de 2,5% (2,5 g/100 ml) DSS dans l'eau distillée et passer à travers un f 0,22 um acétate de celluloseiltre par le vide. Cette dose peut être ajustée entre 1 à 3,5% selon la souche de souris et de l'environnement. Une fois préparée, la solution de DSS peuvent être conservés au réfrigérateur jusqu'à 1 semaine.
- Au jour 7, la solution de DSS offre à des souris que leur eau potable. Environ 250 ml / cage sera nécessaire chaque fois DSS nouveau est prévu pour un maximum de 5 souris / cage, mais ce ne sont que des estimations et peuvent varier selon le type de bouteilles d'eau utilisées dans votre animalerie.
- Pour assurer un approvisionnement continu du DSS pendant sept jours, la solution de DSS doit être remplacé dans des bouteilles propres trois fois (tous les 2-3 jours) au cours de cette période. Certains chercheurs de mesurer la quantité de DSS consommés avant de remplacer avec la nouvelle solution en tant que mesure de l'exposition.
- Au jour 14, passez cages dos à l'eau potable standard pour deux semaines.
- Répétez les étapes (1,4) - (1,6) aux jours 28 et 49 pour fournir un deuxième et troisième cycle du MAS. Un SSD «cycle» se compose d'une semaine de DSS dans l'eau potablesuivies de 2 semaines d'exercice régulier (autoclave) de l'eau.
2. Colite évaluation clinique et la progression tumorale
- Les souris doivent être pesés / a observé 2-3 fois par semaine. La perte de poids pour cent par rapport au niveau de référence est utilisé comme mesure indirecte de la gravité colite. Des évaluations régulières de saignement rectal, diarrhée ou prolapsus peut être faite en fonction des objectifs expérimentaux et déclarés conformément aux systèmes de notation différents. 9, 10
- Une perte de poids de jusqu'à 10% avec 2-3 jours de la diarrhée et des saignements rectaux on peut s'attendre dans la semaine qui suit un cycle complet de DSS (observation quotidienne peut être utile au cours de cette immédiat après-DSS période).
Il est possible que certaines souris ne peut pas la récupérer; souris perdent plus de 20% de leur poids sont moins susceptibles de survivre et peut exiger l'euthanasie précoce. Une injection IP unique de 0,5 à 1,0 ml de solution saline dans ces souris peut être une mesure utile de soutien en vue de corriger flui le volume d perdus à cause de la diarrhée.
3. Endoscopie murin (facultatif)
- Endoscopie la suite de la deuxième ou troisième cycle de DSS peut être effectuée pour confirmer la croissance tumorale in vivo avant le sacrifice. Comme l'AOM / DSS modèle est assez fiable dans la production de tumeurs, cette étape n'est généralement pas nécessaire. Seuls quelques souris doivent évaluée à l'aide de cette méthode, car elle a le potentiel de perturber tumeurs de la souris 11.
- Anesthésier la souris avec la sédation par inhalation ou par injection.
- Après la souris est anesthésié, fixez la souris sur un bord plat avec du ruban adhésif à la queue et la poitrine.
- Avancer l'endoscope murin dans le rectum de la souris doucement à l'aide du sérum physiologique pour gonfler et irriguer pour améliorer la vision intraluminal et supprimer les contenus fécaux. (Notez que l'endoscopie peut également être effectuée à l'aide d'insufflation d'air comme une alternative à la solution saline et cette technique peut offrir une visualisation améliorée de la tumeur. 12)
- Le jour 70, chaque souris AOM / DSS traité devrait héberger de multiples tumeurs du côlon et être prêt pour l'évaluation. Cette date peut être reportée semaines à plusieurs mois si les tumeurs plus volumineuses sont souhaitées. (Il faut noter que les souris avec un prolapsus rectal sévère devrez peut-être être euthanasiés tôt pour éviter une gêne excessive pour les animaux comme pour les comités de protection des animaux.)
- Avant l'autopsie, individuellement euthanasier les souris avec luxation cervicale et l'isoflurane (ou autre méthode approuvée institutionnellement). Poids final et d'autres mesures peuvent être faites en ce moment.
- Posez la souris avec sa face ventrale exposée sur une planche à découper. Couvrir l'abdomen avec de l'éthanol à 70% pour prévenir les poils de contaminer le contenu abdominal lors de l'extraction du côlon.
- Utilisez une pince pour saisir la ligne médiane de l'abdomen et faire une petite incision pour exposer le péritoine.
- Étendre cette incision de chaque côté de l'abdomen le long de la margi côtièren.
- Utiliser des ciseaux pour couper à travers le bassin de sorte que les deux points peuvent être récoltés vers le bas à la jonction anorectale. Ceci est important car une blessure colite DSS est le plus grand au niveau du rectum distal et, en conséquence, cette région est la plus grande du développement tumoral.
- D'autres tissus tels que les ganglions lymphatiques mésentériques peuvent également être récoltés à cette époque.
5. Préparation du Colon pour l'analyse macroscopique
- En utilisant une aiguille 18G gavage attachée à une seringue de 5 ml, rincer le côlon avec de la glace-froid tampon phosphate salin (PBS) de telle sorte que le fluide sort dans le sens physiologique. Si les tissus du côlon sera utilisé pour l'ARN ou de protéines à base de l'analyse, il peut être conservé au froid en utilisant des plateaux de travail pré-réfrigérés.
- Ouvrez le côlon rougeur longitudinalement le long de son mésentère et de la peinture sur le plateau froid. Les tumeurs sont plus facilement visualisées lorsque le colon est placé sur une surface sombre. Alternativement, 1% de colorant bleu Alcian peut être appliqué à mettre en lumière tumors. Évaluer le nombre et la taille de la tumeur avec une règle ou un pied à coulisse numérique.
- Petites sections de tissu normal adjacent de la tumeur et peut être excisé à ce point pour une analyse ultérieure par l'ARN, les protéines, ou immunohistochimie (IHC) les méthodes, laissant une partie du côlon restant pour l'évaluation histologique.
La photographie numérique des échantillons bruts du côlon immédiatement après l'étape 5.2 peut être utile pour une analyse précise de la charge tumorale, surtout si une partie importante des colons sont excisées pour d'autres formes d'analyse tel que décrit ci-dessus. La charge tumorale (%) peut être calculé comme zone tumorale / région du côlon totale utilisant des logiciels libres tels que ImageJ.
6. Préparation du Colon pour l'évaluation histologique
- Appliquer formol à 10% au côlon restant sur le plateau froid via une seringue ou d'un doigt. Permettant de fixer le tissu pendant au moins 30 secondes de cette manière faciliter le transfert dans le bassin de fixation. Assurez-vous de formol résiduel wiped off avant de peindre un colon ouverture du nouveau sur le même plateau.
- Transfert colons dans un bassin rempli de formol à 10% et de cerner les bords.
- Après 3 h de fixation, de transférer deux points à 70% d'éthanol. Colons peuvent être conservés dans l'éthanol à 70% indéfiniment.
- Trois sections longitudinales du côlon (proximal, moyen, distal / rectum) peuvent être stabilisés dans de la gélose à 2% et soumis pour inclusion dans la paraffine. Assurer que le côlon proximal et distal du colon / rectum sont orientés d'une manière uniforme pour chaque souris.
- Dysplasie dommages crypte, et l'inflammation peut être décrite et évaluée par une personne expérimentée selon des protocoles précédemment publiés. 10, 13-15 Les souris peuvent être sacrifiés avant 70 jours si l'expérimentateur est intéressé par la détection précoce des événements dysplasiques.
7. Les résultats représentatifs
Le modèle AOM / DSS décrit ici permet au chercheur de générer de manière fiable les tumeurs du côlon chez la souris.La croissance tumorale dans ce modèle est directement influencée par le processus inflammatoire associée. Gravité colite doivent être surveillés cliniquement par suite de la perte de poids et la présence de diarrhée / selles sanglantes (Figure 2). Ces signes de la maladie ont tendance à commencer le 5 e jour du cycle DSS et pendant quatre jours ou plus après DSS est retiré. Rarement, les souris avec une charge importante tumeur rectale peuvent développer un prolapsus rectal. Après la diarrhée DSS deuxième ou troisième cycle peut devenir persistante. Typiquement tumeurs sont présents et identifiables par coloscopie murin avant le troisième cycle de DSS (figure 3). Plus de temps et un troisième des résultats DSS dans les grandes tumeurs au moment de la récolte (figure 4). Utilisez de l'application topique Alcian bleuissement peut être utilisé pour mettre en évidence des tumeurs (figure 5). Des photographies de tumeurs du côlon aidera à générer des mesures de tumeurs qui peuvent être utilisés pour comparer quantitativement la production de la tumeur, et la tailleentre les groupes expérimentaux (figure 6). Fixes et embarqués paraffine spécimens du côlon peut alors être évalué pour l'histologie ou à l'utilisation de la coloration immunohistochimique (figure 7 et 8).
Figure 1. Schéma de l'OMA et de l'administration DSS. AOM (10 mg / kg) est injecté au jour 0. Au début de la deuxième semaine (jour 7), la solution de DSS 2,5% est administré à des souris dans leur eau potable. Sept jours de DSS est suivie de deux semaines de l'eau en autoclave. Deux autres cycles de DSS sont administrés avant le sacrifice.
Poids de la souris Figure 2. Par rapport au niveau de référence au cours de l'OMA et de l'administration DSS. Notez que dans la semaine suivant chaque cycle DSS, souris los % e 5-10 de leur poids corporel. La perte de poids dans cette expérience est un marqueur de substitution de la gravité colite.
Figure 3. Vue de tumeurs dans le côlon distal par murin endoscopie au jour 50 de l'AOM / DSS traitement. Notez les masses polypoïdes multiples obstruant la lumière du côlon distal (b, c) par rapport à la normale du côlon (a).
Figure 4. Longitudinalement ouvert côlon de souris illustrant l'aspect macroscopique des tumeurs. Notez la charge tumorale élevée dans la partie distale du côlon / rectum (à gauche en haut), et la texture caractéristique ondulé du côlon proximal (image de droite supérieure) avec la croissance des tumeurs peu. Une vue de près de la partie distale du côlon montre de nombreuses tumeurs de différentes tailles (ci-dessous).
Les tumeurs Figure 5. Mis en évidence par l'application de Alcian bleuissement. Noter comment le colorant souligne la texture normale du côlon, ainsi que les bords de chaque tumeur individuelle. Une telle coloration peut être utile dans la mesure précise des zones tumorales par règle ou mesure numérique.
Figure 6. Répartition représentative du nombre moyen de tumeurs par souris traitées avec l'AOM / DSS. Noter que la majorité des tumeurs sont situées dans le côlon distal et sont <2 mm.
Figure 7. Inclus en paraffine des coupes longitudinales du côlon à cassette (ci-dessus) d'uned sur la diapositive après coloration H & E (ci-dessous). Notez que Alcian résiduelle bleuissement n'interfère pas avec H & E coloration. Une grosse tumeur est encerclé sur l'image de la diapositive (encerclée). Les appellations «distal», «moyen» et «proximal» résultent de la coupe la totalité du côlon par tiers entre le caecum et l'anus.
Figure 8. Histologie Représentant d'une tumeur résultant de l'AOM / DSS administration dans le côlon distal. H & E, BrdU, et β-caténine lames colorées à 50X (panneau supérieur) et 400X (panneau inférieur), respectivement démontrer les changements dysplasiques similaires à adénocarcinomes du côlon humain.
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Discussion
Le traitement des souris avec l'OMA et le DSS rapidement et efficacement des modèles humaine colite associée au cancer. Hypothèses concernant les facteurs héréditaires contribuent à la colite cancers associés peut être facilement étudiée sur des souris génétiquement modifiées. 13, 16 variante, l'effet des cibles pharmacologiques dans la colite associée à un cancer peut être étudiée en utilisant des souris sauvages.
Bien que ce modèle est très apprécié par ceux qui s'intéressent à l'étude du développement des tumeurs du côlon dans le cadre de l'inflammation, des limitations existent. L'étendue de la maladie observée chez les souris de ce modèle peut varier considérablement selon la souche de souris et les conditions de logement (mise en cage, l'alimentation, le microbiote, etc.) Suzuki et al. al ont rapporté que des souris Balb / c femelles étaient plus sensibles à l'AOM / DSS, suivie (par ordre décroissant d'incidence tumorale et la multiplicité) C57BL/6N, C3H/HeN, et les souris. DBA/2N 17 expériences impliquant des DSS et AOM seul à 129 / souris Sv prédirait un modele taux de réponse au traitement combiné, similaire à C57/BL6J souris 18, 19. Ainsi, des expériences pilotes peut être nécessaire pour déterminer les protocoles de dosage les plus efficaces en fonction des installations et des ressources disponibles. Alors que AOM / DSS tumeurs dans le côlon ressemblent histologiquement cancers colorectaux humains, ils ne présentent que rarement des métastases. Au niveau moléculaire, les altérations de β-caténine, la COX-2 et iNOS, mais pas p53 ont été rapportés. 20 Kanneganti et al. al. donne un aperçu complet de modèles alternatifs pour l'induction de l'ACE pour les personnes intéressées 5.
Pour augmenter la reproductibilité des résultats, nous recommandons que les souris de différentes origines génétiques (comme le WT et le gène knock spécifique sur les souris) être co-cage dans une exempts d'agents pathogènes spécifiques (SPF) installation 3-4 semaines avant le début de l'expérience, ce qui est particulièrement important si les souris ont été récemment livrés à partir d'une installation d'élevage commercial. Bien que tout sexe et âge comparable souris peut être utilisée, wous avons constaté les résultats les plus cohérents avec toutes les souris femelles. AOM solutions mères ne devraient pas être utilisés si plus d'un an, et il est important d'éviter de multiples cycles gel-dégel de ces solutions. La gravité de colite peuvent être affectés par le type d'alimentation de la souris utilisé aussi bien comme source DSS; ces facteurs doivent être conservés cohérente entre les expériences. Nous avons observé la turbidité dans des bouteilles DSS laissés dans les cages de souris pour de longues périodes (> 4 jours) évocateurs d'une contamination, d'où, de réfrigération et de préparer DSS frais au début de chaque administration devra éviter cette complication. Si quelques tumeurs développer ou souris meurent prématurément, et Neufert. al. dans leur résumé du protocole OMA / DSS fournir un excellent tableau des conseils de dépannage 6.
Une fois l'AOM / DSS technique pour le développement de la colite associée à un cancer est maîtrisée, diverses différentes investigations complémentaires de ces souris peuvent être effectuées. 21 L'expression du candidatgènes peuvent être étudiés dans les sections tumorales vs sans tumeur du côlon par amplification par PCR quantitative de l'ARN extrait. Parce que le MAS lui-même peut interférer avec ce processus, nous vous recommandons de poly-A de purification avant l'amplification. 22 parties de côlon peut être surgelés à étudier pour l'expression des protéines par western blot. Les enquêteurs de la colite associée au cancer pourraient être intéressés par des repères visuels de la prolifération cellulaire. À cette fin, AOM / DSS souris traitées peuvent être injectés avec de la bromodésoxyuridine (BrdU) 90 min avant le sacrifice, immunohistochimie pour ces documents noyaux marqués et les zones dans le côlon avec le plus grand prolifération épithéliale, tant au sein de sections de tumeurs et sans tumeur. 23
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été financé en partie par DK089016 et L30 RR030244 (MAC), CA153036 (AS) et P30-DK52574 (pour le Core Washington University digestif recherche sur les maladies). ACI a un Howard Hughes Medical Institute médicale Fellow formation à la recherche.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J Mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Azoxymethane (AOM) | Sigma Aldrich | A5486-100MG | Stock solution: dilute to 10 mg/ml in distilled water to be kept at -20 °C as 0.5 - 1 ml aliquots. Working solution: dilute stock to 1 mg/ml in isotonic (0.9%) saline |
| Dextran Sulfate Sodium (DSS) | TdB Consultancy | DB001 | MW 40 kDa (36-50 kDa preparations from other sources are acceptable; The same lot should be used for a single experiment)6 |
| Coloview miniendoscopic system | Karl Storz | Multiple | See Becker et al. for detailed explanation of equipment and setup.11 |
| TPP Rapid FILTERMAX 500 ml Bottle-Filter, 0.22 μm PES | Midwest Scientific | TP99500 | Any standard tissue culture filter is acceptable |
| Ethyl Alcohol 200 Proof ASC/USP | Pharmaco-AAPER (or other) | 11ACS200 | Dilute to 70% in distilled water |
| Isoflurane, USP | Butler Animal Health Supply | 4029405 | Place mouse in glass jar with gauze or a small cloth soaked in anesthetic |
| 18G Straight Gavage Needle | Braintree Scientific | N-008 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma Aldrich | P5493 | Dilute to 1X (0.01 M) in distilled water |
| Cold Tray (Tissue Tek II Cold Plate) | Fisher Scientific | NC9491941 | Store at -20 °C |
| ImageJ Software | NIH (free download) | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | |
| Formaldehyde (37%) | Fisher Scientific | F79-500 | Dilute to 10% in PBS |
| BD Bacto Agar | Fisher Scientific | DF0140-01-0 | Use hotplate to create 2% solution in distilled water |
| Miltex Eye Dressing Forceps | MedPlus Inc. | 18-780 | |
| Miltex Eye Scissors | MedPlus Inc. | 18-1430 | Curved points prevent damage to colon during opening. |
| Alcian Blue 8GX (powder) | Sigma Aldrich | A5268 | Add 1 g powder to 100 ml 3% acetic acid (3 ml glacial acetic acid + 97 ml distilled water) |
| 1 mL Tuberculin syringe with attached 26 G x 3/8 in intradermal bevel needle | BD | 305946 | For injection of AOM |
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