Orthotopisk tyndtarmstransplantation i rotter

Summary

Tyndtarmstransplantation er blevet en accepteret behandling for patienter med irreversibel intestinal fiasko. Vores eksperimentelle model af orthotopisk tyndtarmstransplantation i rotter tjener som et pålideligt værktøj til at løse den underliggende immunologiske og inflammatoriske processer, der komplicerer intestinaltransplanterede.

Abstract

Tyndtarmstransplantation er blevet en accepteret klinisk mulighed for patienter med korte tarm syndrom og svigt af parenteral ernæring (irreversibel intestinal fiasko). I specialiserede centre forbedrede operative og forvaltning strategier har ført til fremragende kort-og mellemliggende sigt patient og transplantat overlevelse samtidig med høj livskvalitet ^1,3. Til forskel fra mere almindelige transplantation af andre faste organer (dvs. hjerte, lever) mange underliggende mekanismer af transplantatfunktion og immunologiske ændringer induceret af intestinaltransplantation er ikke helt kendt ^6,7. Episoder med akut afstødning, sepsis og kronisk graft svigt er de vigtigste hindringer, som stadig bidrager til mindre gunstige langsigtede resultat og hindrede en mere udbredt beskæftigelse af proceduren på trods af et stigende antal patienter på hjemmebane parenteral ernæring, som potentielt ville drage fordel af en sådan transplantation. Tyndtarmen indeholderet stort antal af passager leukocytterne almindeligvis betegnes som en del af tarmen forbundet lymfoide system (GALT) det er en del af årsagen til det høje immunogenity af intestinal graft. Tilstedeværelsen og tætte nærhed af mange kommensale og patogener i tarmen forklarer sværhedsgraden af ​​sepsis episoder når graft mucosal integritet kompromitteres (for eksempel ved afstødning). At fremme inden for intestinale-og multiorgan transplantation flere data genereret fra pålidelige og gennemførlige dyremodeller er nødvendig. Modellen tilvejebragt heri kombinerer både pålidelighed og gennemførlighed når de er etableret på en standardiseret måde og kan give værdifuld indsigt i de underliggende komplekse molekylære, cellulære og funktionelle mekanismer, der er udløst af intestinale transplantationer. Vi har med succes brugt og forfinet den beskrevne procedure i løbet af mere end 5 år i vores laboratorium ^8-11. Den Jové video-baseret format er især nyttig til at demonstrere den komplekse procedurersesprocedure og undgå de første faldgruber for grupper planlægger at etablere en ortotopisk gnavermodel undersøge intestinaltransplanterede.

Protocol

1. Donor Operation

1. Donoren rotter holdes fastende i 24 timer (fri adgang til vand / glucoseopløsning).
2. For at inducere Isofluran inhalation anæstesi, skal du starte med 2% på standard atomizer, og derefter reducere til 1% efter udførelse laparotomi. Udfør en tå knibe for at kontrollere sedation.
3. Barbere maven og rengør med hud prep 3 gange (Kodan). Derefter udføre en median incision efter subkutan administration af det smertestillende stof.
4. Efter at implantatet er pakket i saltvand gaze, adskille fysiologiske adhæsioner mellem pancreas og colon ascendens forsigtigt med en vatpind (under det kirurgiske mikroskop med 6x forstørrelse).
5. Ligere og opdele ileocecal & ret & midterste kolik fartøjer, der anvender 7-0 silke. Efter colon ascendens er spredt ud til den højre side af den overlegne mesenteriallymfeknuderne vene (SMV), kan ileocecal, højre og midterste kolik fartøjer identificeres til ligering og division med 7-0 bånd.
6. Trække maven opad, således at hele SMV rettes ud og eksponeret. Brug en myg klemme til tilbagetrækning. Klemmen er i besiddelse af modellervoks masse formes i facon efter behov.
7. Ligere og fordele de pancreatico-duodenale vener kommer fra SMV. Alle små pancreatico-duodenale vener stammer fra SMV omhyggeligt skal identificeres, ligeret med 7-0 silke og fordeles inden pankreasvæv kan fjernes fra transplantatet.
8. Ligere og opdele mister bindevæv, herunder alle lymfevejene mellem SMV og den abdominale aorta. Med transplantatet stadig på højre side af underlivet, mister bindevævet herunder alle lymfevejene mellem SMV og den abdominale aorta er tilgængelig. Denne bindevæv skal ligeret under anvendelse af 7-0 silke og opdelt for at undgå postoperativ lymphorrhea fra intestinal graft.
9. Ligere og opdele den rigtige nyrearterie. Efter bindevævet er delt, retten nyrearteriestenose bliver accessible og ligeres og deles med 7-0 silke.
10. Systemisk heparinise rotten med 200 enheder heparin iv via den penile vene.
11. Ligere de marginale arterier, og opdele tyndtarmen ved duodeno-jejunal forbindelse og på den terminale ileum.
12. Aorta ligeres proksimalt til oprindelsen af ​​SMA. Portvenen er transected ved sammenløbet med milten vene. Derefter transplantatet høstes med sin vaskulære pedicle der består af SMA med en aorta segment.

2. Backtable Procedure

1. Perfundere transplantatet under anvendelse af 3 ml af University of Wisconsin-opløsning (UW) ved 4 ° C via aorta ledning og overrisle tarmlumen fra jejunal ende med 30 ml Uro-Nebacetin N opløsning ved 4 ° C (lumen vanding er obligatorisk) .

Umiddelbart efter ekstraktion af transplantatet, er den aortiske ledningen anvendes til perfusion med 3 ml afkølet UW opløsning. Til dette en 20 G iv kateter påen 10 ml sprøjte anvendes. Perfusatet bemærkes at strømme frit ud fra den delte portale vene. For intestinal skylning med Nebacetin, er en 50 ml sprøjte anvendes.

2. Opbevares transplantatet i UW-opløsning ved 4 ° C under fremstillingen af ​​modtageren.

3. Modtager Operation

1. Modtageren rotter holdes fastende i 24 timer (fri adgang til vand / glucoseopløsning).
2. For at inducere Isofluran inhalation anæstesi, skal du starte med 2% på standard atomizer, og derefter reducere til 1% efter udførelse laparotomi. Udfør en tå knibe for at kontrollere sedation.
3. Barbere maven og rengør med hud prep 3 gange (Kodan). Udfør derefter en median incision efter subkutan administration af carprofen 5 mg / kg sc til intraoperativ analgesi.
4. Pak modtageren bowel i normalt saltvand gaze og placere den på modtagerens bryst.
5. Åbn retroperitoneum ligeud med Q-tip og udsætte abdomiNAL aorta og inferior vena cava lige under de renale fartøjer ned til niveauet af iliaca skibe, om nødvendigt også anvende microscissors. Ligere de små lumbale og spinal tribuaries fra aorta og vena cava ved hjælp af 7-0 silke at undgå blodtab. (For at gøre dette, skal du ændre den kirurgiske mikroskop zoom til 16x).
6. Cross-clamp aorta og IVC under den venstre renale fartøjer proksimalt og over bækkenforgreningen distalt ved hjælp af mikrokar-clips. Kun én klemme bruges proksimalt samt distalt at klemme begge fartøjer samtidigt. Incise begge skibe fortil ved hjælp af en microknife og udvaske resterende blod.
7. Opret en ende-til-side anastomose mellem transplantatet aortasegment og modtagerens infrarenale aorta ved anvendelse af en kontinuerlig 10-0 prolene sutur .. Indledningsvis er implantatet placeret på højre side af underlivet (lederen af ​​rotte placeret ved 12:00) for at udføre bagvæggen sting i den arterielle anastomose og binding af den nedre ophold sutur. Thda er transplantatet overgivet til venstre side af abdomen (lederen af ​​rotte placeret ved 09:00) for at blotlægge og suturere den forreste væg af anastomosen.
8. En end-to-side anastomose mellem graft portal vene og modtagerens IVC udføres ligeledes ved at køre suturer hjælp 10-0 prolene. Med rotte stadig ligger sidelæns (hoved i klokken 9 position), er transplantatet anbragt på venstre side af underlivet og en nedre ophold sutur er anbragt. Anastomosen startes med bagvæggen inde i beholderen. Efter den nedre ophold suturen er bundet, kan forvæggen masker udføres udefra.
9. Fjern de distale klemmer først, efterfulgt af de øverste klemmer. Enhver anastomotiske blødningen er under kontrol ved direkte tryk under anvendelse af Q-tips. Transplantatet bør kontrolleres for lige og hurtig reperfusion.
10. Kirurgisk fjernelse af hele modtagerens tyndtarmen efter ligering af mavens fartøjer. Modtagere gennemgå subtotal enterectomy, bevare 2-3 cm af proximal jejunum og 1 cm distal ileum.
11. Gendan enterisk kontinuitet ved proximal (jejuno-jejunostomi) og distal (ileo-ileostomi) ende-til slut tarm anastomoser ved hjælp af en afbrudt etlags-sutur med 6-0 Monocryl. Cirka 16 suturer for at færdiggøre de anastomoser.
12. Overrisle bughulen med normal saltopløsning, indtil ren. Indgiv 2 ml normalt saltvand intraperitonealt for væske udskiftning. Luk derefter maven ved hjælp af en kontinuerlig sutur med 3-0 Vicryl for muskel lag plus en kontinuerlig hud sutur.
13. I den postoperative periode blev rotterne holdes fastende (med adgang til vand og glucoseopløsning) i yderligere 24 timer og derefter genstartes på standard rottefoder og vand ad libitum. Analgesi med carprofen skal indgives i 3 dage (se dosering nedenfor).

Representative Results

Normal postoperativ kursus

De transplanterede dyr bør komme sig hurtigt fra proceduren under en varmelampe i ca 1 time. Hypotermi er en væsentlig årsag til postoperativ dødelighed og bør omhyggeligt undgås intra-og postoperativt. Intraoperative væsketab skal udskiftes ved sc injektion af 2,5 ml normalt saltvand plus 2,5 ml Glucose 5% hver 8. time i de første 24 timer. Rotterne skal også have fri adgang til glucoseopløsning (eller gel kost) og vand po for de første 24 timer postoperativt. Efter denne periode bør de genvinde normal fodring adfærd med fri adgang til standard rottefoder og vand ad libitum. Smerter styres af administration af carprofen 5 mg / kg sc dagligt i tre dage, med første skud skal indgives i narkosemiddel. Perioperativ antibiotisk profylakse er kun nødvendig i den allogene omgivelser, og kan indgives i 5-7 dage (ampicillin 15 mg / kg sc, q. 12 hr). Generaludseende, pels tilstand samt slimhinde udseende bør være normal. Efter POD 1 aktivitetsniveauet bør vende tilbage til præoperative status, apathic eller unormal adfærd antyder tidligt kirurgiske komplikationer. Efter indledende tab på op til 20% af kropsvægten rotterne vil begynde at tage på i vægt igen omkring postoperative dag 6-8 og vil have nået omkring 90% af deres præoperative vægt normalt omkring postoperative dag 14 (i den isogene indstilling uden afvisning).

Postoperative komplikationer

Som anført ovenfor, en udspilet mave, apathic adfærd, ophør af fodring og ændringer i generelle udseende (pjusket pels, sekretion fra øjnene) bør betragtes som symptomer på eventuelle komplikationer. Dyrene skal ses af kirurgen og en dyrlæge. Betingelser som dehydrering, inflammatorisk tilstand på grund af peritonitis, ileus på grund af stenose af tarmen anastomose skal utilstrækkelig smertestillende medicin og andre kan være reglend ud og behandlet. Hvis dyret ikke er normaliseret på trods af behandling, skal seponering af forsøget vurderes fra sag til sag i henhold til anvendelsen dyreforsøgsstatistikker regler.

Figur 1a. Instrumenter.
1. Mikroskop (Leica)
2. Anæstesi apparat (EICKEMEYER)

Figur 1b. Instrumenter.
3. Shaver
4. Elektronisk skalpel (GEIGER)
5. Kirurgiske tang
6. DeBakey pincet buet
7. Buede tang small
8. Micro pincet buede
9. Micro pincet lige 1
10. Micro pincet lige 2
11. Micro nåleholder
12. Nåleholder
13. Mosquito klemme
14. Saks 1
15. Saks 2
16. Microscissors
17. Micro Skalpel

Figur 1c. Instrumenter.
18. Microclamps
19. Canulas og Q-tips (ikke vist)
20. Sprøjter (50 ml, 10 ml, 2,5 ml, 1 ml)

Figur 1c. Instrumenter.
21. UW opløsning graft opbevaring
22. Antibiotika (Uro-nebacetin N) for graft lumen kunstvanding
23. UW for graft perfusion
24. Normalt saltvand
25. Fad med normalt saltvand (til backtable)

Figur 2. Gennemsnitlig postoperative vægt (kumulative data). Figur 2 viser den gennemsnitlige postoperative vægt efter orthotopisk tyndtarmstransplantation. Efter indledende tab på op til 20% af legemsvægten rotterne begynder at tage på i vægt igen omkring postoperative dag 6-8 og vil have nået 90% af deres preopstrument vægt normalt omkring postoperative dag 14 (i den isogene indstilling uden afvisning / immunosuppression). Figur 2 viser vægttab data, ikke overlevelse, det faldende antal ledige dyr til at måle vægttab skyldes først og fremmest sacrifing af dyr til forsøg.

Figur 3. Bugspytkirtelvævet (pil) skal fjernes fra colon.

Figur 4. Efter ligering og dividere mister bindevæv herunder alle lymfevejene mellem SMV og den abdominale aorta, er ret nyrearterien (pil) fordelt silke ligaturer.

Figur 5. Perfusion af transplantatet med UW opløsning via aorta ledning.

Figur 6. Efter fremstilling af modtagerens vena cava og aorta skibene udsættes, klar til fastspænding.

Figur 7. Cross klemmen udføres på vena cava og aorta samtidigt under anvendelse microclamps.

Figur 8. (A) aorto-aortiske anastomose udføres under anvendelse ophold suturer. (B) Efter afslutning af aorto-aortiske anastomose vil portocaval anastomose udføres næste. Den lavere ophold sutur er allerede på plads.

Figur 9. (A) portocaval anastomose startes efter den anden ophold sutur er på plads. (B) Efter completion af portocaval anastomose.

Fig. 10. Efter fjernelse af klemmerne transplantatet reperfuses godt.

Figur 11. (A) Anbringelse af ophold suturer for tarmen anastomose. (B) Afsluttet tarm anastomose.

Discussion

Mens intestinaltransplanterede modeller i rotter er blevet beskrevet så tidligt som i 1970'erne ⁵ mest af de nyligt anvendte modeller involverer heterotop intestinaltransplantation hjælp af forskellige teknikker ^13. Mens heterotopiske procedurer generelt har den fordel lettere mikrokirurgiske teknikker og lettere tilgængelighed af transplantatet til bedømmelse, heterotop intestinaltransplantation har den store ulempe, at der ikke tages hensyn til de forskellige vekselvirkninger mellem transplanterede tyndtarm og dets funktionelle aspekter som kontraktil aktivitet og mucosal barrierefunktion, der karakteriserer en orthotopisk transplantat i forbindelse med en lang række kommensale og patogener. Vores gruppe har fået en stor oplevelse med de heri beskrevne ortotopisk model og vores resultater tyder på, at mange af de specifikke ændringer forårsaget af inflammatoriske og adaptive immunrespons skal vurderes i sammenhæng med den funktionelle properties af det transplanterede tyndtarm ligesom kontraktilitet og mucosal integritet. Det skal bemærkes, gør det anastomotiske teknikker, der anvendes her ikke omfatter brugen af arterielle eller venøse manchetter, hvoraf nogle har vist sig at lette proceduren og reducere den kritiske varm iskæmi tid, især i modeller af multivicerale transplantation ^12,14. Selv om det kan være nødvendigt at anvende manchet teknikker i gnavermodeller for multivicerale transplantation, den complicative potentiale manchetterne har fået os til at undgå lignende teknikker i denne model af enkelt intestinaltransplanterede. Vi har ikke forsøgt at bruge portal dræning teknikker i denne model. Ud over at være teknisk udfordrende (den lille portvenen diameter kunne føre til venøse udstrømning problemer), hvilket ville gøre hele modellen vanskeligere at - det er et faktum, at i klinisk intestinaltransplantation systemisk dræning anvendes i de fleste tilfælde. Således Den beskrevne teknik REFLECTS klinisk praksis kombineres med teknisk gennemførlighed. Portal dræning af transplantaterne har ikke vist sig at være forbundet med overlegne resultater i flere kliniske og eksperimentelle studier ^2,4. Tilstrækkeligt korte iskæmi tider på omkring 35 minutter, der er nødvendige for en stabil dyr overlevelse kan opnås efter afslutningen af ​​indlæringskurven for denne model.

Orthotopisk tyndtarmstransplantation ifølge denne protokol kan læres af en microsurgically erfaren forsker efter at have udført cirka 30-40 procedurer. Visualiseringen som opnås ved Jové format giver mulighed for direkte visuel observation og nøjagtig gengivelse af de anvendte teknikker, som muligvis fører til hurtigere etablering af fremgangsmåden og mindre dyr offer. Kritiske punkter bløder, koldt og varmt iskæmi tid og tarm anastomotisk stenose / insufficiens. Den kolde iskæmi tid i denne eksperimentelle indstilling er ikke så afgørende som varm ischemia tid, men bør ikke overstige 45 minutter. Den varme iskæmi tid bør være omkring 35 minutter og heller ikke overstige 45 minutter, da det kan medføre højere postoperative dødelighed. Den ideelle donor og modtager vægt er omkring 200 g, fordi mindre rotter ikke tåle proceduren godt og vægt over 300 g er forbundet med overdreven intraabdominale fedt. Rotterne tabe op til 20% af kropsvægten i den direkte postoperative periode, men skal begynde at tage på i vægt igen efter 6-8 dage postoperativt (fig. 2). Daglige helbredsundersøgelser (årvågenhed, pels og slimhinder udseende, vægt, afføring kvalitet og frekvens) bør udføres indtil dyret aflives. Vi anbefaler daglig indgivelse af antibiotika og smertelindring i mindst de første tre dage som beskrevet ovenfor. Efter første praksis, navnlig for mikrovaskulære og tarm anastomoser denne model giver pålidelig og stabil langsigtet overlevelse på omkring 80-90% i den isogene indstilling. I allogenic indstilling overlevelse er generelt lavere, afhænger hovedsageligt af immunologiske fænomener som akut og kronisk afstødning og kan variere meget alt efter det immunsuppressive regime brugt og afprøvet.

Tekniske noter: Donor operation tid bør være omkring 45 minutter. Modtageren operation bør ikke meget overstige 1,5 timer. En varmepude bør anvendes rutinemæssigt for at undgå hypotermi i modtageren. For let vaskulær adgang, kan den laterale halevene på modtageren skal kanyle ved begyndelsen af ​​proceduren under anvendelse af en 22 G intravenøst ​​kateter. Vanding af de intestinale lumen, som beskrevet ovenfor kan ikke være nødvendigt, at undlade dette trin har til vores viden nogen negativ indvirkning på udfald og dødelighed.

Animal undersøgelse krav: Dyrene blev holdt i henhold til gældende love og bestemmelser i Forbundsrepublikken Tyskland, State Nordrhein-Westfalen. De bilagsnumre, hvorunder than eksperimenter blev godkendt kan rekvireres fra den tilsvarende forfatter.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
University of Wisconsin (UW) solution (ViaSpan)	Bristol-Myers Squibb
Uro-Nebacetin N solution	Nycomed	6967855
Ampicillin	Ratiopharm
Carprofen (Rimadyl)	Pfizer
Prolene 10-0 unresorbable suture	Ethicon
Monocryl 6-0 resorbable suture	Ethicon
Vicryl 3-0 resorbable suture	Ethicon
i.v. Catheter G 20 1.1x33 mm	Braun
i.v. Catheter G 22 0.9x25 mm	Braun
Kodan Skin Prep	Schülke
NaCl 0.9% Infusion solution	Braun
Curved forceps small	FineScienceTools	11009-13
Micro forceps curved	AESCULAP	BD 333
Micro forceps curved	AESCULAP	FD281R
Micro forceps straight 1	WPI	5
Micro forceps straight 2	WPI	2
Micro needle holder	WPI	14081
Micro scissors	FineScienceTools	15006-09
Micro scalpel	MANI	Ophthalmic knife
Micro clamps	AESCULAP	FB329R