Orthotopic tynntarm Transplantasjon i rotter

Summary

Tynntarm transplantasjon har blitt en akseptert behandling for pasienter med irreversible intestinal svikt. Vår eksperimentell modell av orthotopic tynntarm transplantasjon i rotter fungerer som en pålitelig verktøy for å håndtere underliggende immunologisk og inflammatoriske prosesser som komplisere tarmtransplantasjon.

Abstract

Tynntarm transplantasjon har blitt en akseptert klinisk alternativ for pasienter med kort tarm syndrom og svikt i parenteral ernæring (irreversibel intestinal svikt). I spesialiserte sentre forbedret operativ og administrerende strategier har ført til utmerket kort og mellomlang sikt pasient og pode overlevelse samtidig som det gir høy livskvalitet ^1,3. I motsetning til i de mer vanlige transplantasjon av andre faste organer (dvs. hjerte, lever) mange underliggende mekanismene organfunksjon og immunologiske forandringer indusert av tarmtransplantasjon er ikke helt kjent ^6,7. Episoder med akutt avvisning, sepsis og kronisk graft svikt er de viktigste hindringene fortsatt bidrar til mindre gunstige langsiktige utfall og hindre en mer utbredt anvendelse av prosedyren tross et økende antall pasienter på hjemmebane parenteral ernæring som ville potensielt ha nytte av en slik transplantasjon. Tynntarmen inneholderet stort antall passasjer leucocytes ofte referert til som en del av tarmen forbundet lymfesystemet (GALT) dette blir en del av årsaken til det høye immunogenity av intestinal pode. Tilstedeværelsen og nærhet av mange commensals og patogener i tarmen forklarer alvorlighetsgraden av sepsis episoder gang pode mucosal integritet blir kompromittert (for eksempel ved avvisning). Å fremme feltet av intestinal-og multiorgan transplantasjon mer data generert fra pålitelige og gjennomførbare dyremodeller er nødvendig. Modellen gir her kombinerer både pålitelighet og gjennomførbarhet gang etablert på en standardisert måte og kan gi verdifull innsikt i de underliggende komplekse molekylære, cellulære og funksjonelle mekanismer som utløses av tarmtransplantasjon. Vi har med hell brukt og videreutviklet den beskrevne prosedyren over mer enn 5 år i vårt laboratorium ^8-11. Den Jove video-basert format er spesielt nyttig for å demonstrere komplekse procedure og unngå innledende fallgruver for grupper som planlegger å etablere en orthotopic gnager modell etterforsker tarmtransplantasjon.

Protocol

1. Donor Drift

1. Donor rotte bør holdes fastende i 24 timer (fri adgang til vann / glukose-løsning).
2. Å indusere isofluran innånding anestesi, start med 2% på standard atomizer, og deretter redusere til 1% etter å ha utført laparotomi. Utfør en tå knipe for å sjekke sedasjon.
3. Barbere magen og rengjør med hud prep 3 ganger (Kodan). Deretter utfører en median innsnitt etter subkutan administrering av den analgetiske.
4. Etter pode er innpakket i saltvann gjennomvåt gasbind, skiller de fysiologiske sammenvoksninger mellom bukspyttkjertelen og stigende kolon forsiktig med en Q-tip (under kirurgisk mikroskop med 6x forstørrelse).
5. Ligere og dele ileocecal & rett og midten kolikk fartøy med 7-0 silke. Etter den stigende kolon er spredt ut til høyre side av den overlegne mesenteric venen (SMV), kan ileocecal, høyre og midtre kolikk fartøy identifiseres for ligation og divisjon med 7-0 bånd.
6. Trekke magen oppover, slik at hele SMV er rettet ut og utsatt. Bruk en mygg klemme for tilbaketrekking. Klemmen holdes av plasticine massen formet til form etter behov.
7. Ligere og dele pancreatico-duodenal årer kommer fra SMV. Alle små pancreatico-duodenal årer stammer fra SMV må nøye identifisert, ligert med 7-0 silke og delt før pankreasvevet kan fjernes fra transplantatet.
8. Ligere og dele miste bindevev inkludert alle lymfekar mellom SMV og abdominal aorta. Med pode fortsatt på høyre side av magen, mister bindevevet inkludert alle lymfekar mellom SMV og abdominal aorta er tilgjengelig. Dette bindevev må ligeres hjelp 7-0 silke og delt for å unngå postoperative lymphorrhea fra intestinal pode.
9. Ligere og dele den rette nyrearteriestenose. Etter bindevevet er delt, blir den rette nyrearteriestenose accessible og ligeres og delt med 7-0 silke.
10. Systemisk heparinise rotta hjelp 200 IE heparin iv via penis vene.
11. Ligere de marginale arterier, og dele tynntarmen ved duodeno-jejunal krysset og ved terminalen ileum.
12. Aorta ligeres proksimalt til opprinnelsen til SMA. Portvenen er transektert ved samløpet med splenogen vein. Deretter pode høstes med sin vaskulær pedicle bestående av SMA med aorta segmentet.

2. Backtable Prosedyre

1. Perfuse graftet med 3 mL University of Wisconsin-løsning (UW) ved 4 ° C via aorta ledning og vanne intestinal lumen fra jejunal enden med 30 ml Uro-Nebacetin N løsning ved 4 ° C (lumen vanning er obligatorisk) .

Umiddelbart etter utpakking graftet blir aorta ledningen brukes for perfusjon med 3 ml kjølt UW oppløsning. For dette, en 20 g IV kateter påen 10 ml sprøyte brukes. Perfusatet bør observeres å strømme ut fritt fra delt portvenen. For intestinal irrigasjon med Nebacetin, blir en 50 ml sprøyte som brukes.

2. Oppbevar pode i UW-løsning ved 4 ° C under forberedelsen til mottakeren.

3. Mottaker Drift

1. Mottakeren rotte bør holdes fastende i 24 timer (fri adgang til vann / glukose-løsning).
2. Å indusere isofluran innånding anestesi, start med 2% på standard atomizer, og deretter redusere til 1% etter å ha utført laparotomi. Utfør en tå knipe for å sjekke sedasjon.
3. Barbere magen og rengjør med hud prep 3 ganger (Kodan). Deretter utfører en median snitt etter subkutan administrasjon av Carprofen 5 mg / kg sc for intraoperativ analgesi.
4. Pakk mottakeren tarm i fysiologisk saltvann gjennomvåt gasbind og plassere den på mottakerens brystet.
5. Åpne retroperitoneum rett ut med Q-tips, og utsett abdomiNAL aorta og vena cava inferior like nedenfor renale fartøyer ned til nivået av iliac fartøy, om nødvendig også bruke microscissors. Ligere de små lumbale og spinal tribuaries fra aorta og vena cava bruker 7-0 silke å ​​unngå blodtap. (For å gjøre dette ved å endre kirurgisk mikroskop zoom til 16x.)
6. Cross-klemme aorta og IVC under venstre nyre fartøy proksimalt og over iliaca bifurcation distalt ved hjelp microvessel klipp. Bare én klaven benyttes proksimalt samt distalt for å klemme både fartøy samtidig. Incise begge fartøyene anteriorly ved hjelp av en microknife og vaske ut gjenværende blod.
7. Lag en ende-til-side anastomose mellom pode aorta segmentet og mottakerens infrarenal aorta ved hjelp av en kontinuerlig 10-0 Prolene sutur .. Initialt er transplantatet plassert på høyre side av abdomen (leder av rotte plassert på 12:00) til å utføre bakveggen masker av arteriell anastomose og binde av nedre oppholdet sutur. Thno er pode slått over til venstre side av abdomen (leder av rotte plassert på 9:00) for å avsløre og suturere frontveggen av anastomose.
8. En ende-til-side anastomose mellom pode portvenen og mottakerens IVC utføres på samme måte ved å kjøre sting ved hjelp 10-0 Prolene. Med rotte fortsatt liggende sidelengs (hode i ni-stilling), er pode plassert på venstre side av abdomen og en lavere opphold sutur er plassert. Anastomose startes med bakveggen fra inne i beholderen. Etter den nedre oppholdet sutur er bundet, kan frontveggen masker utføres fra utsiden.
9. Fjern de distale klemmer først, etterfulgt av de øvre klemmer. Enhver anastomotisk blødning er kontrollert av direkte press med Q-tips. Transplantasjonen bør sjekkes for lik og rask reperfusjon.
10. Resect hele mottakerens tynntarmen etter ligation av mesenteric fartøy. Mottakere gjennomgå delsum enterectomy, bevare 2-3 cm av proximal jejunum og 1 cm distale ileum.
11. Gjenopprette enteric kontinuitet ved proksimal (jejuno-jejunostomy) og distal (ileo-ileostomi) ende-til ende intestinal anastomoser med en avbrutt ett-lags sutur med 6-0 Monocryl. Ca 16 sting for å fullføre anastomoser.
12. Vanne bukhulen med fysiologisk saltvann til rent. Administrer 2 ml fysiologisk saltvann intraperitonealt for væske erstatning. Deretter lukker magen med en kontinuerlig sutur med 3-0 Vicryl for muskel lag pluss en kontinuerlig hud sutur.
13. I den postoperative perioden rottene bør holdes fastende (med tilgang til vann og glukoseoppløsning) for en annen 24-timers deretter startet på standard rotte Chow og vann ad libitum. Analgesi med karprofen bør administreres i 3 dager (se dosering nedenfor).

Representative Results

Normal postoperativ kurs

Det transplanterte dyr bør komme seg raskt fra prosedyren under en varme-lampe for ca 1 time. Hypotermi er en viktig årsak til postoperativ mortalitet og bør omhyggelig unngått intra-og postoperativt. Intraoperativ væsketap må erstattes av sc injeksjon av 2,5 ml normal saltoppløsning pluss 2,5 ml Glukose 5% hver 8 timers for første 24 hr. Rottene bør også ha fri tilgang til glukose (eller gel diett) og vann po for første 24-timers postoperativt. Etter denne perioden skal de gjenvinne normal fôring atferd med fri tilgang til standard rotte chow og vann ad libitum. Smerte er kontrollert av administrering av karprofen 5 mg / kg sc daglig i tre dager, med det første skuddet som skal administreres ved anestesi induksjon. Perioperativ antibiotikaprofylakse er bare nødvendig i den allogenic innstillingen, og kan administreres i 5-7 dager (Ampicillin 15 mg / kg sc, q. 12 t). Genereltutseende, pels tilstand samt mucosal utseende bør være normal. Etter POD en aktivitetsnivået skal gå tilbake til preoperativ status, foreslår apathic eller unormal atferd tidlig kirurgiske komplikasjoner. Etter innledende tap av opptil 20% av kroppsvekten rottene vil begynne å få vekten igjen rundt postoperative dag 6-8, og vil ha nådd omtrent 90% av deres preoperativ vekten normalt rundt postoperativ dag 14 (i Isogene innstillingen uten avvisning).

Postoperative komplikasjoner

Som nevnt ovenfor, en oppblåst mage, apathic atferd, seponering av fôring og endring i generelle utseende (ruffled pels, sekresjon fra øynene) bør vurderes som symptomer på mulige komplikasjoner. Dyrene bør sees av kirurgen og en veterinær. Forhold som dehydrering, inflammatorisk tilstand på grunn av peritonitt, ileus grunnet stenose i tarmen anastomose må nok smertestillende medikamenter og andre være regelend ut og behandlet. Dersom dyret ikke gjenopprette til tross for behandling, må seponering av eksperimentet bli vurdert fra sak til sak i henhold til bruk dyreforsøk forskrifter.

Figur 1a. Instrumenter.
1. Mikroskop (LEICA)
2. Anestesi apparater (EICKEMEYER)

Figur 1b. Instrumenter.
3. Shaver
4. Elektronisk skalpell (GEIGER)
5. Kirurgiske tang
6. DeBakey tang buet
7. Buede tang liten
8. Mikro tang buet
9. Micro tang rak 1
10. Micro tang rett 2
11. Micro nålholderen
12. Nålholderen
13. Mygg klemme
14. Saks en
15. Saks 2
16 år. Microscissors
17. Micro Skalpell

Figur 1c. Instrumenter.
18 år. Microclamps
19. Canulas og Q-tips (ikke avbildet)
20. Sprøyter (50 ml, 10 ml, 2,5 ml, 1 ml)

Figur 1c. Instrumenter.
21. UW-løsning for pode lagring
22. Antibiotika (Uro-nebacetin N) for pode lumen vanning
23. UW for pode perfusjon
24. Fysiologisk saltvann
25. Tallerken med fysiologisk saltvann (for backtable)

Figur 2. Gjennomsnittlig postoperativ vekt (kumulative data). Figur 2 viser gjennomsnittlig postoperativ vekt etter orthotopic liten tarm transplantasjon. Etter innledende tap av opptil 20% av kroppsvekten rottene begynner å få vekten igjen rundt postoperative dag 6-8, og vil ha nådd 90% av preop dereserative vekten normalt rundt postoperativ dag 14 (i Isogene innstillingen uten avvisning / immunsuppresjon). Figur 2 representerer vekttap data, ikke overleve, minkende antall tilgjengelige dyr å måle vekttap skyldes hovedsakelig sacrifing av dyr for eksperimenter.

Figur 3. Pankreasvevet (pil) må fjernes fra tykktarmen.

Figur 4. Etter ligering og dele miste bindevev inkludert alle lymfekar mellom SMV og abdominal aorta, rett nyrearteriestenose (pil) delt mellom silke ligaturer.

Figur 5. Perfusjon av graftet med UW løsningen via aortic ledning.

Figur 6. Etter utarbeidelse av mottaker vena cava og aorta skipene er utsatt, klar for å feste.

Figur 7. Cross klemme utføres på vena cava og aorta samtidig med microclamps.

Figur 8. (A) aorto-aorta anastomose er utført ved hjelp stay suturer. (B) Etter fullførelse av aorto-aorta anastomose vil portocaval anastomose utføres neste. Den lavere opphold sutur er allerede på plass.

Figur 9. (A) portocaval anastomose startes etter det andre oppholdet suturen er på plass. (B) Etter completion av portocaval anastomose.

Figur 10. Etter fjerning av klemmene graftet reperfuses godt.

Figur 11. (A) Plassering av opphold suturer for tarmen anastomose. (B) Fullført tarm anastomose.

Discussion

Mens intestinal transplantasjon modeller i rotter har blitt beskrevet så tidlig som i 1970ies ⁵ mest av de nylig ansatt modeller innebære heterotopiske tarmtransplantasjon ved hjelp av ulike teknikker ^13. Mens heterotopiske prosedyrer generelt har fordelen av enklere mikrokirurgisk teknikk og lettere tilgjengelighet av graftet for vurdering, har heterotopiske tarmtransplantasjon den store ulempen ved ikke å ta hensyn til flere interaksjoner av det transplanterte tynntarmen og dets funksjonelle aspekter som kontraktile aktivitet og mucosal barriere funksjon som kjennetegner en orthotopic pode i sammenheng med et stort rekke commensals og patogener. Vår gruppe har fått en stor opplevelse med her beskrevet orthotopic modell og våre funn tyder på at mange av de konkrete endringer forårsaket av inflammatoriske og adaptive immunresponser må vurderes i sammenheng med den funksjonelle proeiendommer av det transplanterte tynntarmen som kontraktilitet og mucosal integritet. Av notatet, gjør anastomotisk teknikker her inkluderer ikke bruk av arterielle eller venøse mansjetter, noen som har vist seg å lette prosedyren og redusere den kritiske varm iskemi tid, spesielt i modeller av multivisceral transplantasjon ^12,14. Selv om det kan være nødvendig å ansette cuff teknikker i gnagere modeller av multivisceral transplantasjon, den complicative potensialet i håndjern har ført oss til å unngå lignende teknikker i denne modellen av én tarmtransplantasjon. Vi har ikke forsøkt å bruke portal drenering teknikker i denne modellen. Bortsett fra å være teknisk utfordrende (den lille portvenen diameter kan føre til venøse utstrømmende problemer), noe som ville gjøre hele modellen vanskeligere å etablere - det er et faktum at i klinisk tarmtransplantasjon systemisk drenering blir brukt i de fleste av tilfellene. Således, den beskrevne teknikken reflekterer klinisk praksis kombinert med teknisk gjennomførbarhet. Portal drenering av grafts har ikke vist seg å være assosiert med overlegne resultater i flere kliniske og eksperimentelle studier ^2,4. Tilstrekkelig korte iskemi tider rundt 35 minutter nødvendige for stabil dyr overlevelse kan oppnås etter fullført læringskurve for denne modellen.

Orthotopic tynntarm transplantasjon i henhold til denne protokollen kan læres av en microsurgically erfaren forsker etter å ha utført ca 30-40 prosedyrer. Visualisering som oppnås ved JOVE formatet tillater direkte visuell observasjon og nøyaktig gjengivelse av de sysselsatte teknikker som muligens fører til raskere etablering av metoden og mindre dyreofring. Kritiske punkter blør, kald og varm iskemi tid og tarm anastomotisk stenose / insuffisiens. Den kalde iskemi tid i denne eksperimentelle innstillingen er ikke så avgjørende som varm ischemia tid, men bør ikke overstige 45 minutter. Den varme iskemi tid bør være rundt 35 minutter, og heller ikke overstige 45 minutter, da dette kan føre til høyere postoperativ mortalitet. Den ideelle giver og mottaker vekten er rundt 200 g fordi mindre rotter ikke tåler behandlingen godt og vekt over 300 g er forbundet med overdreven intraabdominal fett. Rottene tape opp til 20% av kroppsvekten i direkte postoperative perioden men bør begynne å få vekten igjen etter 6-8 dager etter operasjonen (figur 2). Daglig helsesjekk (årvåkenhet, pels og slimhinner utseende, vekt, krakk kvalitet og frekvens) bør utføres før dyret er slaktet. Vi anbefaler daglig administrasjon av antibiotika og analgesi i minst de tre første dagene som beskrevet ovenfor. Etter innledende praksis, spesielt av mikrovaskulær og tarm anastomoser, gir denne modellen pålitelig og stabil langsiktig overlevelse på rundt 80-90% i Isogene innstillingen. I allogenic innstilling overlevelse er generelt lavere, avhenger i hovedsak av immunologiske fenomener som akutt og kronisk avvisning og kan variere mye etter det immunsuppressive regimet brukt og testet.

Tekniske informasjoner: donor driftstid skal være ca 45 minutter. Mottakeren bør ikke mye overstige 1,5 timer. En varmepute bør brukes rutinemessig for å unngå nedkjøling i resipienten. For enkel vaskulær tilgang, kan det laterale halevenen av mottakeren bli kanylert ved begynnelsen av prosedyren ved hjelp av en 22 g venekateter. Vanning av intestinal lumen, som beskrevet ovenfor, kan ikke være nødvendig, utelate dette trinnet må etter vårt kjennskap ingen negative effekter på resultat og dødelighet.

Dyrestudie krav: Dyrene ble holdt i henhold til søker lover og forskrifter i Forbundsrepublikken Tyskland, State Nordrhein-Westfalia. De bilagsnumre under hvilke than eksperimenter ble godkjent kan fås fra tilsvarende forfatteren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
University of Wisconsin (UW) solution (ViaSpan)	Bristol-Myers Squibb
Uro-Nebacetin N solution	Nycomed	6967855
Ampicillin	Ratiopharm
Carprofen (Rimadyl)	Pfizer
Prolene 10-0 unresorbable suture	Ethicon
Monocryl 6-0 resorbable suture	Ethicon
Vicryl 3-0 resorbable suture	Ethicon
i.v. Catheter G 20 1.1x33 mm	Braun
i.v. Catheter G 22 0.9x25 mm	Braun
Kodan Skin Prep	Schülke
NaCl 0.9% Infusion solution	Braun
Curved forceps small	FineScienceTools	11009-13
Micro forceps curved	AESCULAP	BD 333
Micro forceps curved	AESCULAP	FD281R
Micro forceps straight 1	WPI	5
Micro forceps straight 2	WPI	2
Micro needle holder	WPI	14081
Micro scissors	FineScienceTools	15006-09
Micro scalpel	MANI	Ophthalmic knife
Micro clamps	AESCULAP	FB329R