Summary
माउस आइलेट अलगाव का एक विस्तृत विवरण स्वस्थानी अग्नाशय ductal और शुद्ध कोलैजिनेज और तटस्थ protease का एक संयोजन के केन्युलेशन छिड़काव की तकनीक का उपयोग वर्णित है.
Protocol
ए सामग्री की जरूरत है: तालिका 1 (अभिकर्मकों) की तैयारी करने से पहले
- HbSS (पी / एस): 100 मिलीलीटर 10x + HbSS 900 मिलीलीटर 2 एच 0 + 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (रेफ्रिजरेटर में संग्रहीत या बर्फ पर रखा).
- 20% BSA शेयर पानी में किया जाता है और aliquoted और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत
- HbSS (BSA): 200 मिलीलीटर 1X HbSS (पी / एस) + 20% BSA के 3 मिलीलीटर (BSA सांद्रता अंतिम 0.3%)
- मध्यम आइलेट: RPMI + 10% FBS + 1% glutamine + 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन
- 1100 Histopaque: 240 मिलीलीटर 1119 + Histopaque 200 मिलीलीटर 1077 Histopaque
- 4-0 (McKesson) सिवनी: 2 ¾ इंच के टुकड़ों में काट और एक 10 सेमी पेट्री डिश में संग्रहीत
- उपकरण: 90 ° ललित विज्ञान उपकरण से संदंश Bend, और संदंश की सभी तीन जोड़े की दाँतेदार दांत के नीचे फ़ाइल. लक्ष्य सुस्त दांत है, उन्हें हटा नहीं है.
- प्रवेशनी / कोलैजिनेज protease मिश्रण के प्रशासन के लिए: 27g साढ़े सुई अंदर, 30 साढ़े अंदरसुई, PE50 टयूबिंग 12 टुकड़े अंदर में कटौती. दोनों सुइयों के एक चिकनी गोल अंत है कि कोई तेज किनारों नीचे फाइल. PE50 टयूबिंग टुकड़ा अंदर 12 के एक छोर में 27g सुई डालें. 30G सुई निकालें आवरण से सरौता की एक जोड़ी के साथ आवरण मुंहतोड़, आवरण मोड़ ¼ हर बार बारी है. सरौता के साथ आवरण से सुई और निकालें PE50 टयूबिंग अन्य अंत में यह विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे डालें. गुत्थी के रूप में आप PE50 टयूबिंग में सुई डालने नहीं टयूबिंग सुनिश्चित. 27g सुई अंत है कि आप Collagenase के सिरिंज देते है.
- Collagenase (सीआई zyme एमए) और तटस्थ Protease (सीआई zyme बीपी). निर्माता के निर्देशों के अनुसार TDE reconstitute. विश्लेषण की बहुत विशिष्ट प्रमाण पत्र के लिए देखें एंजाइम गतिविधि एकाग्रता की गणना. कोलेजन 350.000 पुनर्गठन कोलैजिनेज के अपमानजनक गतिविधि (सीडीए) इकाइयों और 100.000 reconstit तटस्थ protease इकाइयों के एक कुल स्थानांतरणएक शंक्वाकार ट्यूब में uted बी.पी. Protease और HbSS में 15 मिलीलीटर कुल (पी / एस) जलमिश्रित
बी प्रोटोकॉल कदम दर कदम
1. अग्न्याशय के Collagenase / Protease मिश्रण के साथ मुद्रास्फीति
- गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से माउस euthanize, 70% EtOH, किसी भी विच्छेदन कैंची और संदंश के साथ खुला पेट पूरी तरह से गुदा से डायाफ्राम के लिए गुहा के साथ माउस धड़ तर.
- एक विच्छेदन खुर्दबीन के मंच पर माउस रखें.
- काएकुम और आरोही बृहदान्त्र बाहर खींचो और उन्हें अपनी बाईं करने के लिए शरीर गुहा बाहर सेट. निम्न चरणों का एक सारांश के लिए 1 आंकड़ा देखें.
- डायाफ्राम के खिलाफ जिगर की lobes की स्थिति, और वे वहाँ रहना चाहिए अगर शरीर गुहा काफी दूर तक खुला है. यकृत धमनी, पोर्टल शिरा और पित्त नली बंडल घुमावदार संदंश साथ ग्रहणी मनोरंजक जिगर में अग्रणी. घुमावदार संदंश की एक और जोड़ी के साथ, धमनी, नस के तहत पहुँच और वाहिनी बूndle और एक 2 खींच ¾ 4-0 सीवन की धमनी, नस, पित्त नली के तहत टुकड़ा अंदर और यह एक बार टाई और यह तंग पुल के रूप में संभव के रूप में जिगर के करीब.
- घुमावदार संदंश के दो जोड़े का उपयोग सावधानी से ग्रहणी हड़पने और पित्त papilla पर ग्रहणी जुड़ी वाहिनी मिल. संदंश की एक टोंग प्रयोग और पित्त नली papilla के करीब के तहत संयोजी ऊतक सही अग्न्याशय के माध्यम से प्रहार. अपने संदंश जल्दी अंग के माध्यम से एक छेद बनाने के प्रहार और फिर डाल संदंश के दोनों चिमटे के माध्यम से और 4-0 सीवन के एक और 2 ¾ इंच टुकड़ा हड़पने के माध्यम से और यह टाई एक बार और यह एक छोटी सी सर्कल खींच, लेकिन खींच तंग मत.
- 90 ° संदंश और उत्तम Vannas कैंची बदलें. 90 ° संदंश के साथ, ध्यान से चुटकी और छोटी आंत खींच पित्त नली तक तना हुआ है. आंत में खुला कैंची छुरा और फिर एक प्रस्ताव के साथ काटने कैंची के साथ papilla भर में एक क्षैतिज कटौती करें. केवल ओ बनाने की कोशिशपूर्वोत्तर papilla से पित्त नली dislodging बिना papilla में कटौती.
- हालांकि अभी भी 90 डिग्री संदंश के साथ आंत पकड़, पित्त नली में प्रवेशनी पित्त नली की लंबाई आधा करने के लिए, डालने और फिर धीरे प्रवेशनी चारों ओर तंग सीवन खींच.
- कोलैजिनेज / protease मिश्रण के 2.0 मिलीलीटर के साथ एक 3 मिलीलीटर सिरिंज भरें और एक धीमी, स्थिर गति से प्रवेशनी में सुई.
- अग्न्याशय की मुद्रास्फीति के बाद पूरा हो गया है, पित्त नली से प्रवेशनी को हटाने और घुमावदार संदंश और घुमावदार वसंत कैंची का उपयोग करने के लिए उतरते बृहदान्त्र में शुरू करने और संयोजी ऊतक snipping के रूप में आप आंतों खींच फुलाया अग्न्याशय हटाने. आंतों से अग्न्याशय को दूर करने के लिए आगे बढ़ें जब तक आप पित्त नली तक पहुँचने के लिए, तो तिल्ली से अग्न्याशय निकालने के लिए, तो पेट और फिर उदर गुहा की आंत से. दूर sutures snipping द्वारा हटाने खत्म करो. एक 50 मिलीलीटर HbSS के 5 मिलीलीटर युक्त ट्यूब अग्न्याशय जोड़ें(पी / एस). इस ट्यूब बर्फ पर होना चाहिए.
- ऊपर चार जानवरों के लिए एक जानवर के लिए प्रक्रिया को दोहराएँ. इष्टतम परिणामों के लिए, एक समय में केवल चार pancreata अलग कर देना. आम तौर पर है, जबकि पहले चार 37 डिग्री सेल्सियस पानी में स्नान कर रहे हैं, हम एक और चार pancreata और बढ़ा देते हैं.
2. अग्न्याशय पृथक्करण
- 50 मिलीलीटर ट्यूबों जिसमें एक 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में pancreata रखें.
- धीरे ट्यूब रॉक और ऊतक हदबंदी के लिए जांच करने के लिए, यकीन है कि ऊतक के अलावा आसानी से आता है, तो ज़ुल्फ़ ट्यूबों 12 बार जब आप ढक्कन द्वारा ट्यूब धारण कर रहे हैं.
- एक मिनट के लिए 290 XG HbSS (BSA) (यह एक कम राशि का हो सकता है, कितना centrifugation कदम के लिए ट्यूब संतुलन के लिए आवश्यक है के आधार पर कर सकते हैं) का कोई भी अधिक 30 मिलीग्राम और अपकेंद्रित्र जोड़ें.
- तैरनेवाला Aspirate ध्यान और नीचे तैरनेवाला (2-3 मिलीग्राम) की एक छोटी राशि के रूप में सेल गोली को बाधित करने के लिए नहीं छोड़.
- का उपयोग करते हुए एक 30 मिलीलीटर सिरिंज attac14G सुई hed, HbSS (बीएसए) के कोई 10 से अधिक मिलीलीटर जोड़ने और निलंबन aspirate ऊपर और नीचे 2 बार.
- फ़िल्टर एक प्लास्टिक चाय का झरनी के माध्यम से एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में सेल का मिश्रण है और एक और 10 मिलीलीटर HbSS (BSA) के साथ कुल्ला.
- 2 मिनट के लिए 330 XG पर अपकेंद्रित्र.
- पसाना तैरनेवाला और ट्यूबों पलटना करने के लिए 1 मिनट के लिए एक शोषक कागज तौलिया पर नाली.
- 10 मिलीलीटर ठंड histopaque 1100 में प्रत्येक ट्यूब Resuspend.
- 10 मिलीलीटर HbSS (BSA) के साथ histopaque ढ़कें और 18 मिनट के लिए 900 XG अपकेंद्रित्र.
- सतह पर तैरनेवाला के पूरे 20 मिलीलीटर एक बड़े बोर 25 मिलीलीटर pipet का उपयोग कर निकालें और एक औंधा 70 सुक्ष्ममापी फिल्टर के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला से गुजारें.
- एक 10 सेमी पेट्री डिश में फिल्टर के माध्यम से 10 मिलीलीटर आइलेट मीडिया pipetting जबकि यह सही पक्ष पकवान पर पकड़ islets कुल्ला.
- प्रयोग के लिए तैयार है जब तक एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में islets संस्कृति. आमतौर पर, islets हाथ उठाया जाता है और अनुभव करने के लिए पहले से गिनाimentation.
3. प्रतिनिधि परिणाम
आइलेट पैदावार,, आकारिकी, और गुणवत्ता सामान्य आइलेट अलगाव की सफलता का न्याय करने के लिए प्रयोग किया जाता मानकों हैं. हमारे हाथ में, औसत C57BL / 6 माउस से आइलेट पैदावार 150-250 इस प्रोटोकॉल (2 तालिका देखें) का उपयोग islets की रेंज में हैं, और अनुकूलित सिग्मा प्रकार इलेवन कोलैजिनेज का उपयोग कर प्राप्त आंकड़ों के तुलना कर रहे हैं. हालांकि, पैदावार माउस इस्तेमाल तनाव और माउस की उम्र पर निर्भर करते हुए भिन्न हो सकती हैं. जानवरों हम रोजगार के अधिकांश 8-16 सप्ताह की आयु सीमा में इस प्रोटोकॉल कई माउस उपभेदों पर परीक्षण किया गया है C57BL / 6 (180-250 islets / माउस), CD1 (200-300 islets / माउस), 129 / सहित, बी -6 (200-300 islets / माउस), BLKS-db/db (120-200 islets / माउस), इशारा (10 सप्ताह पुरानी, 100-150 islets / माउस), और इशारा SCID (100-150 islets / माउस ). विशिष्ट आइलेट morphology चित्रा 2 में दिखाया गया है, जिसमें islets एक अपेक्षाकृत समान आकार के साथ आकार आयताकार दौर है (हालांकि आकार uniformity तनाव से भिन्न करने के लिए तनाव कर सकते हैं). चित्रा 3 हमारे ग्लूकोज उत्तेजित C57BL / 6 islets माउस पृथक से इंसुलिन स्राव के विशिष्ट विश्लेषण TDES बनाम सिग्मा प्रकार इलेवन कोलैजिनेज शुद्ध का उपयोग करने से पता चलता है. आमतौर पर, एक 25 मिमी ग्लूकोज कि 6-20 बार 2.5 मिमी ग्लूकोज में मनाया है कि तुलना में अधिक है पर एक इंसुलिन उत्तेजना में उच्च गुणवत्ता आइलेट तैयारी का परिणाम है. अन्य आवेदन भी अलग islets की गुणवत्ता का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और इन perifusion तकनीक, Ca 2 + 11 अन्य के बीच इमेजिंग (Fura2 के साथ), और रिवर्स प्रतिलेखन पीसीआर, का उपयोग शामिल है.
चित्रा 1. एक सारांश पित्त नली का केन्युलेशन के.
चित्रा 2. 24 घंटा निम्नलिखित अलगाव C57BL / 6 islets की विशिष्ट उपस्थिति छवियाँ. एक में हासिल किया गया40X बढ़ाई verted खुर्दबीन.
चित्रा 3. ग्लूकोज उत्तेजित C57BL / 6 islets इंसुलिन स्राव 24 घंटा निम्नलिखित अलगाव, 100 islets 1 घंटा के लिए एक 12-अच्छी तरह से पकवान में 37 ° क्रेब्स - घंटी में सी HEPES बफर 2.5 मिमी ग्लूकोज युक्त समाधान incubated रहे थे. आइलेट्स तो एक अतिरिक्त घंटा, जिसके बाद तैरनेवाला इंसुलिन माप के लिए एकत्र किया गया था के लिए 2.5 मिमी ग्लूकोज पर थे क्रेब्स - घंटी HEPES स्थानांतरित दो साइट immunospecific एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख (एलिसा) (क्रिस्टल रसायन) का उपयोग. एक ही islets क्रेब्स घंटी HEPES बफर 25 मिमी ग्लूकोज युक्त समाधान के लिए बाद में स्थानांतरित कर दिया गया है, और मध्यम में इंसुलिन रिलीज एलिसा द्वारा ऊष्मायन के 1 घंटे के बाद मापा गया था.
Discussion
इस प्रोटोकॉल में, हम cannulation, कोलैजिनेज छिड़काव, और murine अग्न्याशय की हदबंदी के लिए हमारी प्रक्रिया में वर्णित है islets के Langerhans को अलग करने के लक्ष्य के साथ. तकनीकी तौर पर, हमारे विधि, एक बार में महारत हासिल है, अग्न्याशय अलगाव के लिए 4 पशु euthanizing के मिनट के भीतर की अनुमति है, करना चाहिए और 1 घंटे द्वारा एक एकल जानवर से islets के अलगाव में परिणाम चाहिए. तकनीक की तीव्रता हमें islets से एक विशिष्ट खंड में 12 चूहों को अलग करने के लिए अनुमति देता है, जिससे 3000 islets के अलगाव में जिसके परिणामस्वरूप.
अन्य प्रोटोकॉल कि कोलैजिनेज कच्चे तेल की तैयारी का उपयोग के विपरीत, हमारे प्रोटोकॉल शुद्ध proteases, सीआई zyme Collagenase एमए और सीआई zyme बी.पी. Protease का उपयोग. TDE तैयारियाँ कि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं की स्थिरता में बदलाव की आवश्यकता है कि प्रत्येक स्थल है और व्यक्तिगत रूप से परीक्षण किया जा अनुकूलित सामान्य उपयोग से पहले. यह बहुत कुछ करने के लिए बहुत परिवर्तनशीलता हमें पुरी के उपयोग पर विचार करने के लिए नेतृत्वVitaCyte से fied TDES. ये बेहद शुद्ध TDES संवेदनशील प्रतिदीप्ति लेबल सब्सट्रेट assays के उपयोग सहित कई तरीकों से होती हैं. प्रतिदीप्ति सीडीए परख Collagenase के विभिन्न रूपों है कि आणविक अपमानजनक देशी कोलेजन में अलग कैनेटीक्स के प्रति संवेदनशील है. ऐतिहासिक पेप्टाइड सब्सट्रेट assays कोलैजिनेज की एक अधूरी मूल्यांकन प्रदान करते हैं. कई तरीकों से कोलैजिनेज निस्र्पक बहुत सारे के बीच अधिक से अधिक एंजाइम गतिविधि सुनिश्चित करता है.
हमारे घर में कोलैजिनेज व्यावसायिक रूप से उपलब्ध तैयारी की एक किस्म का उपयोग परीक्षण के आधार पर, हमने पाया है कि शुद्ध एंजाइम संयोजन प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य बहुत कुछ करने के लिए बहुत कुछ परिणाम सामने आए. इस आवेदन में अत्यधिक शुद्ध और कठोर होती TDES का उपयोग कर के प्रमुख लाभ एक बार इष्टतम एंजाइम की संरचना को परिभाषित किया जाता है, बहुत बहुत प्रदर्शन स्थिरता का आश्वासन दिया है. यह स्थिरता बहुत योग्यता के श्रम गहन प्रक्रिया आम तौर पर आवश्यक समाप्तकच्चे तेल या समृद्ध कोलैजिनेज उत्पादों के लिए. शुद्ध TDES भी संरचना के अतिरिक्त संशोधनों को सक्षम करने के लिए और विभिन्न माउस उपभेदों से बरामद islets की उपज और गुणवत्ता में सुधार. चूहों के विभिन्न प्रकारों से रिपोर्टिंग islets के अलगाव के लिए इष्टतम एंजाइम रचनाओं और अधिक प्रभावी ढंग से सूचित किया जा सकता है. यह, बारी में, संसाधनों और प्रयोगात्मक डिजाइन में सुधार लचीलापन अधिक उत्पादक उपयोग करने के लिए होता है.
वहाँ कई महत्वपूर्ण कदम है कि हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए आइलेट isolations के परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं कर रहे हैं. 1 एंजाइम तैयारी के छिड़काव के दौरान अग्न्याशय की प्रभावी मुद्रास्फीति प्राप्त करने की आवश्यकता है. यह महत्वपूर्ण है सिरिंज पर कोमल बल के साथ मुद्रास्फीति को शुरू करने के लिए, और अग्न्याशय फुलाते के रूप में बल में वृद्धि. यह उपयोगी है आंतों कदम है और मुद्रास्फीति के दौरान अग्न्याशय लिफ्ट इतना है कि कोलैजिनेज पूरे अंग perfuses. एक और महत्वपूर्ण कदम बल के साथ जो एक ट्यूबों afte हिलाता हैr ऊष्मायन 37 ° C (2.2 कदम). हमने पाया है कि अग्न्याशय ट्यूब की टोपी के खिलाफ कड़ी मिलाते islets के विखंडन का कारण बनता है, लेकिन इस कदम पर यांत्रिक हदबंदी के बिना किसी भी रूप में, आइलेट पैदावार में नाटकीय रूप से गिर सकता है. यह भी जरूरी है कि सिरिंज (2.5 कदम) के साथ हदबंदी चरण के दौरान, एक मध्यम स्तर के बल सवार के साथ ऊपर और नीचे गति के दौरान लागू किया जाता है, यह फ़िल्टरिंग कदम (2.6) से पहले पर्याप्त ऊतक हदबंदी सुनिश्चित करता है, जहां बहुत कम ऊतक चाय का झरनी फिल्टर पर बनाए रखा जाना चाहिए. अंत में, पिछले कदम सावधानी से पालन करें histopaque fractionated islets के पूरे 20 मिलीलीटर की आकांक्षा है. हालांकि islets histopaque और HbSS की इंटरफेस पर आम तौर पर कर रहे हैं, हमने पाया है कि हम islets खो जब हम केवल इंटरफ़ेस को दूर करने की कोशिश है, बजाय, अब हम एक बड़े बोर 25 मिलीलीटर pipet का उपयोग पूरे 20 मिलीलीटर हटाने. हम उल्टे 70 सुक्ष्ममापी फिल्टर (2.11 कदम) के माध्यम से निस्पंदन ग के लिए समाप्त करने की जरूरत हैबार बार islets entrifuge दूर histopaque धोने.
Disclosures
एनडीएस, सैट, और RGM खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है. लेखक AGB VitaCyte द्वारा नियोजित है. लेखक RCM VitaCyte में एक स्वामित्व हित है.
Acknowledgments
इस काम के हिस्से में NIH अनुदान DK060581 R01, DK083583 R01 (RGM करने के लिए दोनों) द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||
| 10X HBSS | Life Technologies | 14065 | |||||||||
| RPMI | Fisher Scientific | 10-040 | |||||||||
| BSA | Sigma Aldrich | any | |||||||||
| Histopaque 1077 | Sigma Aldrich | 10771 | |||||||||
| Histopaque 1119 | Sigma Aldrich | 11191 | |||||||||
| 4-0 Suture 100 yd roll | McKesson | 451521 | |||||||||
| 14 g blunt end needle | Fisher Scientific | 14-8216M | |||||||||
| Vannas Superfine Sciss | Fisher Scientific | 501778 | |||||||||
| Curved Spring Scissors | Fisher Scientific | 14127 | |||||||||
| Curved Forceps (2) | Fisher Scientific | 15914G | |||||||||
| Curved forceps (for 90 °) | Fine Science Tools | 11052-10 | |||||||||
| 27G 1/2 inch needle | Fisher Scientific | 305109 | |||||||||
| 30G 1/2 inch needle | Fisher Scientific | 305106 | |||||||||
| PE tubing | Becton Dickinson | 427411 | |||||||||
| Collagenase MA | Vitacyte, LLC | 001-2030 | |||||||||
| BP Protease | Vitacyte, LLC | 003-1000 | |||||||||
| 3 ml syringe | Fisher Scientific | 309585 | |||||||||
| 30 ml syringe | Fisher Scientific | 309650 | |||||||||
| 70 μm filter | Fisher Scientific | 352350 | |||||||||
| 10 cm2 Petri Dish | Fisher Scientific | 351005 | |||||||||
| Plastic tea strainer | Any kitchen supply | ||||||||||
| Table 1. Reagents and Equipment | |||||||||||
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Table 2. Average islet yields (±SD) using different TDE lots* *Data represent average islet yields from at least 10 mice. Lot numbers in parentheses |
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References
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