Summary
Швы, как правило, необходимы для восстановления тканей во время хирургических процедур. Однако их применение может быть проблематичным, поскольку они являются инвазивными и может привести к повреждению тканей. Изготовление и применение методов романа клей ткани здесь сообщается. Этот клей пленки лазерным активированы и не требуют использования швов.
Abstract
Фотохимический связи тканей (ПТБ) является бесшовной техники для восстановления тканей, которое достигается за счет применения раствора бенгальским розовым (РБ) между двумя 1,2 ткани края. Затем они облучают лазером, который избирательно поглощается РБ. В результате фотохимических реакций, предположительно сшивки коллагеновых волокон в ткани с минимальной 3 производства тепла. В этом докладе РБ была включена в тонких пленках хитозана для изготовления нового клея ткань, которая лазерной активации. Самоклеющиеся пленки на основе хитозана и содержащая ~ 0,1% мас РБ, изготавливаются и связаны с кишечника теленка и крысы большеберцового нервов твердотельный лазер (λ = 532 нм, Fluence ~ 110 Дж / см 2, пятно размером ~ 0,5 см) . Одного столбца тензиометра, сопряжен с персональным компьютером, используется для проверки прочности соединения. RB-хитозан, клеевых соединений твердо в кишечник с прочностью 15 ± 6 кПа (п = 30). Прочность сцепления падает до 2 иplusmn; 2 кПа (п = 30), когда лазер не применяется клей. Анастомоз большеберцового нервов может быть также завершена без использования швов. Роман хитозана клей был изготовлен, что облигации фотохимически в ткани и не требует наложения швов.
Protocol
1. Хитозан клей подготовка
- Порошка хитозана, растворимого в растворе уксусной кислоты; для подготовки раствора уксусной кислоты (2% V / V), добавляют 10 мл ледяной уксусной кислоты до 490 мл деионизированной воды (DI-H 2 O).
- Для приготовления раствора из бенгальским розовым (РБ) (0,01% вес / объем) в уксусной кислоте, весят 5 мг РБ во флакон обернут фольгой, чтобы избежать фотообесцвечивания. Добавить 0,5 мл DI-H 2 O, чтобы растворить порошок затем добавить 49,5 мл уксусного раствора кислоты (описано в разделе 1.1).
- Для получения хитозана раствор (1,7% вес / объем), вес 0,85 г порошка хитозана (средний МВт, 85% степень ацетилирования) и добавьте в 50 мл RB решение уксусной кислоты. Управление получают путем растворения хитозана в растворе уксусной кислоты без РБ.
- Добавить магнитной мешалкой к смеси хитозана и перемешивают при комнатной температуре. Для обеспечения полного растворения компонентов, перемешать хитозанав уксусной кислоте + RB течение двух недель и хитозана в уксусной кислоте в течение 5 дней (контроль). Когда хитозан растворяется, рН раствора возрастает от ~ 2,6 до ~ 3,9. Обратите внимание, что RB плохо растворяется в кислой, и это требует увеличения рН раствора и перемешивания расширенное время, чтобы раствориться.
- Центрифуга решений на 3270 мкг в течение 1 ч и собирают супернатант, используя, например, стерильный 10 мл шприца. Убедитесь в том, чтобы не потревожить осадок примесей. На этом этапе, раствор очищается от примесей и макроскопических нерастворимого вещества.
- Inject (центрифугированных) хитозана решение на плоскую плиту perpex с помощью стерильного шприца. Толщина высушенной пленки зависит от соотношения между обойтись количество раствора и площадь поверхности, над которой решение распространяется. Убедитесь, что решение свободен от пузырьков воздуха и равномерно распределить на плите. Для получения тонких пленок с ~ 13 мкм толщины, инъекционные ~ 1 мл раствора на 12 см 2 поверхностиплощади (размером ~ 3х4 см, рисунок 1а).
- Накройте Perspex плиты с экраном, изготовленный из алюминиевой фольги, например, чтобы избежать фотообесцвечивания решения. Убедитесь, что достаточно вентиляции гарантированно сухой раствор под экраном.
- Оставьте раствор высохнуть при комнатной температуре (25 ° С) и давлении (1 атм) до Полученная пленка не растворяется в воде и не набухает макроскопически. Это обычно достигается через 2 недели.
- Снимите фильмов, тщательно используя тонкий и плоский шпатель: эти пленки могут быть легко снимают с плиты Perspex не повреждая их.
- Измерение толщины пленок с помощью микрометра.
- Вырезать клей в прямоугольной полосы с чистым резким ножницами и поместить их между стерильные предметные стекла, чтобы сохранить свою плоскую форму. Оберните слайды в алюминиевую фольгу для легкой защиты и храните их при комнатной температуре. Этикетка клея или без РБ как «роза клей" или "хитозан adhesIve "соответственно.
- Выросла клейкие пленки можно стерилизовать с использованием этанола (90%) или гамма-излучением (0,1 кГр / ч в течение 24 ч) 4,5.
2. Клей оптического затухания
- Исправить розы клей внутри кварцевой кювете.
- Запишите свои ослабленные спектра в диапазоне 400 - 800 нм с использованием двухлучевой спектрофотометр 4.
- Предполагая справедливость закона Бера, рассчитать длину затухания клея следующим образом: I = I 0 e-Ax, где I 0-интенсивность падающего пучка, 1 / является длина затухания, а х толщина пленки.
- Повторите шаги с 2,1 до 2,3 для хитозан клея, чтобы служить в качестве контроля.
3 В Vitro приложений. Лазерная ткани Bonding на кишка
- Кишечника Harvest теленка сразу после эвтаназии животных и хранить при температуре -80 ° C.
- Перед использованием размораживания и гидрат тиСГУП, погружая его в DI-H 2 O в течение 10 мин.
- Пополам ткани в разделах (2 х 1 см) с помощью лезвия № 10 под операционным микроскопом (x10). Держите разделов влажной использовании DI-H 2 O.
- Принесите разрез пни близко друг к другу (конца в конец). Протрите излишки воды с поверхности с помощью ватного советы.
- Поместите розу клейкой ленты (10 х 6 мм) через разрез на слой серозной с microforceps обеспечения полного контакта с кишечником (рис. 2).
- Ткани адгезия клея розы активируется с диодной накачкой твердотельный лазер, который связан с многомодового оптического волокна (диаметр сердцевины 200 мкм) 4.
- Установите уровень мощности лазера 180 мВт и облучения клей для ~ 6 мин с размером пятна луча ~ 5 мм, используя параметры приведены в таблице 1. Spot-облучения клей обеспечения того, чтобы каждое пятно облучают в течение ~ 5 секунд до перемещения луча на соседние места. Tего процедура гарантирует, что лазерный луч сканирует всей поверхности клеем несколько раз.
- Чтобы оценить прочность ткани связи, зажим образца калиброванный одного тензиометра колонки (Instron, MA, USA) с использованием механических захватов. Перемещение ручки на 22 мм / мин до двух тканей отдельные пни 4.
- Поместите розу клей на ткань, как описано в пункте 3.5. Не облучения образца и измерения силы ткани связи, как описано в пункте 3.8. Этот пример служит в качестве контроля.
4 В приложение Vivo. Большеберцового нерва анастомоз
- Sedate крыс Вистар изофлураном / O 2 смеси (4% во время индукции, 2% в последующий период) 5. Подкожно вводят Buprenex (0,03 мг / кг), чтобы обеспечить интраоперационной анальгетической активности и облегчить возможные боли или дискомфорта.
- Следующие хирургические процедуры должны проводиться в операционный микроскоп (x10). Сделайте косой кожеРазрез длиной около 3 см в спинно-боковой части правого бедра и разоблачить большеберцового нерва с мышечной расщепления подход через ягодичные мышцы 2.
- Частично анализировать и обрезать адвентиции большеберцового нерва использованием прямой микро-ножниц и поглощают избыток влаги стерильной марлей или ватным советы.
- Вырезать большеберцового нерва с микро-ножниц.
- Установите стерильной хитозана полосы (размером 5 х 4 мм) под большеберцового нерва с использованием микро-щипцы.
- Приблизительное нерва пни конца в конец с микро-щипцы над полосой клея розы.
- Полоса полной мере соблюдает нерв формирования воротник, который может помочь с вращением нерва во время лазерного облучения полосы.
- Активировать выросли клей с лазерным как описано в шагах 3,6) и 3,7).
- Обрезать избыточного выросли клей с воротником управлением нерва.
- Закройте мышц и кожи с пятью швами 3-0 5. Стандартные послеоперационные процедуры восстановления следует придерживаться в том числе ежедневный осмотр для зияние или гноя и обезболивающее администрации, если это необходимо.
5. Представитель Результаты
Фильмы, которые получили яркие розы в цвету, тонкие и имеют гладкую поверхность (рис. 1). Они также являются гибкими и могут быть свернуты в трубки малого диаметра, не вызывая слезы или любых других видимых повреждений (рис. 1б). Клей роза имеет два пика поглощения при 530 и 562 нм, зеленый лазер, таким образом, сильно поглощается клея и соответствующей длины затухания на длине волны 532 нм составляет ~ 12 мкм (рис. 3). В отличие от хитозана фильмы без РБ затухает слабо лазерные (1 / ~ 162 мкм), вероятно, из-за рассеяния. Как видно из спектров сюжет, что никаких существенных агрегации РБ происходит в фильмах.
Выросла клеевых соединений твердов кишечнике при лазерном облучении (рис. 2) достижение типичная максимальная нагрузка при выходе из строя 0,9 ± 0,4 Н (п = 30). Прочность сцепления оценивается как максимальная нагрузка, деленная на клейкой поверхности, а именно 15 ± 6 кПа (п = 30). Необлученных розы клей связанных значительно меньше ткани (2 ± 2 кПа, п = 30, непарный т-тест р <10 6). В естественных условиях анастомоза большеберцового нерва была успешно достигнута в результате применения и устойчивость клея розы в сочетании с зеленым лазером. Неделю после операции, оперированных нерв был в непрерывности и ремонт сила была 17 ± 9 кПа (п = 10).
Рисунок 1.) RB-хитозан решение литье на плоской Perspex плиты (плиты толщиной ~ 5 мм). График бумага находится под плиту для облегчения сухих литых шаг. Нерастворимые в воде Fилм получается две недели после литья. B) клей роза является гибкой и может быть развернута в небольшой цилиндр.
Рисунок 2. Клея розы связан с кишечника теленка после лазерного облучения. Равномерного облучения наносится на клей RB в тканях связи, однако выбранные места показаны в этой картине, чтобы показать фото-отбеливающий эффект лазера на клей.
Рисунок 3. Спектр поглощения (в условных единицах) клея розы показывает два пика при 530 и 562 нм. Зеленый лазер (λ = 532 нм), таким образом, сильно поглощается клея во время лазерного воздействия. Хитозан клей без РБ поглощает плохо лазерного луча.
| п | Мощность (Вт) | Время (с) | Fluence (Дж / см 2) | I (Вт / см 2) | Максимальная нагрузка / площадь (кПа) | ||
| Клей + лазерный | 30 | 60 ± 10 | 0,18 ± 0,03 | 365 ± 5 | ~ 110 | ~ 0,9 | 15 ± 1 |
| Клей | 30 | 60 ± 10 | Не Доступно | Не Доступно | Не Доступно | Не Доступно | 2 ± 2 |
Таблица 1. Legend. п, номер пробы; площадь, площадь поверхности роза клея (среднее ± максимальная ошибка); мощность, мощность лазера (средняя максимальная погрешность ±); Время, время облучения (средняя максимальная погрешность ±); Fluence, средняя плотность энергии лазера, I, оценкам, IRRadiance; Максимальная нагрузка / площадь, максимальная нагрузка при выходе из строя отремонтированного ткани, деленная на клейкой поверхности, (среднее ± SE).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Выросло производство клея на основе простых сухих литых процесс, хотя роспуск РБ в кислом рН требует длительного перемешивания раствор хитозана. Важно, чтобы решение высыхают, пока не станет нерастворимых в воде пленку. Это происходит, когда содержание воды весом ~ 10% в высушенной пленки 6. Нерастворимые фильмах обычно получают через 2 недели после сухого литья при стандартных условиях давления и температуры (~ 25 ° C и ~ 1 атм). Механизм ткани связи пока не ясно, хотя было отмечено, что RB диффундирует из клея в соседние ткани, что позволяет лазеру фото-активировать его эффективность в тканях интерфейс. Это может быть предположение, что RB способность производить синглетного кислорода, при облучении светом, может играть роль в сшивания ткани коллагена и хитозана через их аминогруппы 7,8. Недавнее исследование на клей розы показал также, что максимальная температура достигнута в ходе тисСу-клеевого соединения составляет ~ 32 ° C, поддерживающие гипотезу о фотохимический процесс 4. Другие методы бесшовной для восстановления тканей в настоящее время исследованы несколько исследовательских групп. Лазерная сварка тканей (ЛТВ), например, был успешно применен в офтальмологической хирургии Pini и др. 9. В общем, хотя, LTW может вызвать термическое повреждение тканей, как температура может достигать 65-75 ° C при облучении лазером. Цианакрилатный клей также применяются в клинике для закрытия кожных ран вместо швов, тем не менее, они, как правило, не используются для внутреннего ремонта органа из-за их токсичности 10. Хотя розы клей (~ 15 кПа) имеет более высокую прочность сцепления клея, чем фибрина (~ 8 кПа) 11, цианакрилатные клеи-прежнему обеспечивают сильные адгезии (~ 150 кПа) 12. Толщина клеевого роза требует особого внимания в процессе изготовления: толстый клей (≥ 20 мкм) бы, например, предотвратить лазерныхот достижения ткани интерфейс и ослабит прочность сцепления из-за чрезмерного поглощения лазерного бенгальским розовым. Клей тонким (<10 мкм), с другой стороны, приведет к увеличению освещенности и лазерного влияние на клей ткани интерфейс. Тем не менее, следует соблюдать осторожность в уменьшении толщины пленки, чтобы предотвратить чрезмерный нагрев тканей при лазерном облучении. Клей розы вызывает никаких существенных цитотоксическое действие на фибробласты человека 4 и имеет, таким образом, перспективным использование в ремонте мягких тканей внутри организма, таких как кишечник и периферических нервов. Этот клей также может найти применение в тканевой инженерии: она может быть интегрирована, например, в повязку с внеклеточной матрицы для восстановления тканей и улучшения заживления раны без помощи швов 13. Следует отметить, что мы не наблюдали существенных побочных эффектов, в том числе локализованные воспаления, которые будут связаны с этой процедурой.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом исследований UWS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich | 632-69-9 | |
| Chitosan (medium MW) | Sigma-Aldrich | 10318AJ | |
| Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | 08050051 | 2% v/v in DI water |
| Magnetic stirrer | Heidolph | MR Hei-Mix S | |
| Centrifuge | Beckman Coulter Inc. | Allegra X-12R | |
| Spectrophotometer | Varian Inc., Agilent | Cary 4000 UV-Visible | |
| Laser | CNI Laser | MGL-532 | |
| Micrometer | Mitutoyo | Series 227 | |
| Surgical microscope | Carl Zeiss, Inc. | OPMI |
References
- O'Neill, A. C., Winograd, J. M. Microvascular anastomosis using a photochemical tissue bonding technique. Lasers Surg. Med. 39, 716-722 (2007).
- Yao, M., Yaroslavsky, A. Phototoxicity is not associated with photochemical tissue bonding of skin. Lasers Surg. Med. 42, 123-131 (2010).
- Lauto, A., Mawad, D. Photochemical Tissue Bonding with Chitosan Adhesive Films. Biomedical Engineering OnLine. 9, 47 (2010).
- Chan, B. P., Kochevar, I. E. Enhancement of porcine skin graft adherence using a light-activated process. J. Surg. Res. 108, 77-84 (2002).
- Lauto, A., Faster, L. J. Sutureless nerve repair with laser-activated chitosan adhesive: a pilot in vivo study. Photomed. Laser Surg. 26, 227-234 (2008).
- Lauto, A., Hook, J. Chitosan adhesive for laser tissue repair: in vitro characterization. Lasers Surg. Med. 36, 193-201 (2005).
- Au, V., Madison, S. A. Effects of singlet oxygen on the extracellular matrix protein collagen: oxidation of the collagen crosslink histidinohydroxylysinonorleucine and histidine. Arch. Biochem. Biophys. 384, 133-142 (2000).
- Encinas, M. V., Rufs, A. M. Xanthene dyes/amine as photoinitiators of radical polymerization: A comparative and photochemical study in aqueous medium. Polymer. 13, 2762-2767 (2009).
- Pini, R., Rossi, F. A new technique for the closure of the lens capsule by laser welding. Ophtalmic Surgery Lasers & Imaging. 39, 260-2626 (2008).
- Wieken, K., Angioi-Duprez, K., Lim, A. Nerve anastomosis with glue: comparative histologic study of fibrin and cyanoacrylate glue. J. Reconstr. Microsurg. 19, 17-20 (2003).
- Menovsky, T., Beek, J. F. Laser, fibrin glue, or suture repair of peripheral nerves: a comparative functional, histological, and morphometric study in the rat sciatic nerve. J. Neurosurg. 95, 694-699 (2001).
- García, P., Jorge, H. E. Comparative study of the mechanical behavior of a cyanoacrylate and a bioadhesive. J. Mater. Sci. Mater. Med. 15, 109-115 (2004).
- Lauto, A. Integration of extracellular matrix with chitosan adhesive film for sutureless tissue fixation. Lasers Surg. Med. 41, 366-371 (2009).
