Summary
Ponteggi elettrofilate possono essere trattati post-produzione per applicazioni di ingegneria tissutale. Qui si descrivono i metodi per la filatura ponteggi complessi (da spinning consecutivi), per rendere più spessi (da ponteggi multi-layering che utilizza il calore o vapore ricottura), per ottenere la sterilità (produzione asettica o di post produzione la sterilizzazione) e per il raggiungimento di adeguate proprietà biomeccaniche.
Abstract
Electrospinning è un metodo comunemente usato e versatile per la produzione di ponteggi (spesso biodegradabile) per l'ingegneria tissutale 3D. 1, 2, 3 Molti tessuti in vivo sottoposti a distensione biassiale in varia misura come la pelle, della vescica, pavimento pelvico e anche il palato duro come i bambini crescere. Nel produrre scaffold per questi scopi è necessario sviluppare scaffold di adeguate proprietà biomeccaniche (sia ottenuta senza o con cellule) e che sono sterile per uso clinico. Il focus di questo articolo non è come stabilire i parametri di electrospinning di base (in quanto vi è un'ampia letteratura sul electrospinning), ma su come modificare spun messaggio ponteggi produzione per renderli adatti per scopi di ingegneria dei tessuti - qui spessore, proprietà meccaniche e la sterilizzazione (necessaria per uso clinico) sono considerati e si descrivono anche come le cellule possono essere coltivate sui ponteggi e sottoposto a deformazione biassiale per condizionare loro per applicazioni specifiche.
Elettrofilatura tende a produrre fogli sottili, come il collettore elettrofilatura diventa rivestiti con fibre isolanti diventa un cattivo conduttore tale che le fibre non deposito su di esso. Quindi si descrive approcci per produrre strutture più spessi da calore o vapore ricottura aumentando la forza di ponteggi, ma non necessariamente l'elasticità. Filatura sequenziali di scaffolds di polimeri diversi per raggiungere ponteggi complessi è anche descritto. Metodologie di sterilizzazione può influire negativamente sulla resistenza e l'elasticità di ponteggi. Mettiamo a confronto tre metodi per il loro effetto sulle proprietà biomeccaniche su ponteggi elettrofilati di poli lattico-co-glicolico (PLGA).
Imaging di cellule su ponteggi e la valutazione della produzione della matrice extracellulare (ECM) proteine da parte delle cellule è descritto su ponteggi. Coltura di cellule su ponteggi in vitro in grado di migliorare la forza scaffold e elasticità, ma il tessuto di ingegneria alla letteraturare dimostra che le cellule spesso non riescono a produrre ECM appropriato quando coltivato in condizioni statiche. Ci sono alcuni sistemi commerciali disponibili che permettono di cellule di coltura su ponteggi in regime di condizionamento dinamici -. Un esempio è la ElectroForce Bose 3100 che può essere usato per esercitare un programma di condizionamento su cellule in impalcature tenute con grip meccaniche entro un supporto camera riempita 4 Un approccio ad un bioreattore coltura cellulare budget per la distorsione controllata in 2 dimensioni è descritto. Abbiamo dimostrato che le cellule possono essere indotte a produrre elastina in queste condizioni. Infine valutazione delle proprietà biomeccaniche di ponteggi trasformati in coltura con o senza cellule è descritto.
Protocol
1. Electrospinning delle fibre casuali e Allineato
Electrospinning crea belle reti di fibrosi utilizzando potenziale elettrico per disegnare una soluzione di polimero verso un collettore a terra. Collettori possono essere in forme molto numerosi e può essere statico o, più comunemente, rotante. Il solvente evapora prima soluzione arriva al collettore e il getto solidifica in una fibra.
Ogni polimero richiede un insieme di condizioni per produrre un determinato tipo di fibra. La concentrazione del polimero, del solvente, la distanza tra la soluzione pompata e il collettore a terra, la differenza di potenziale tra i due, la velocità del collettore rotante, la portata, temperatura e umidità sarà tutti influenzare electrospinning. Ci sono molti studi descrivono la selezione dei parametri di elettrofilatura e come questi effetti sui ponteggi prodotte diametro delle fibre (ad esempio, la morfologia, e orientamento). 5, 6, 7, 8In questi esperimenti sono stati fatti girare scaffold in base alle condizioni selezionate nei nostri studi precedenti. 2, 9
I seguenti metodi sono adatti per la produzione di ponteggi elettrofilate da PLGA, poli acido lattico (PLA), poli-ε caprolattone (PCL) e poli idrossibutirrato-co-idrossivalerato (PHBV) usando un raccoglitore rotante come mostrato in Figura 1. Durante il solvente diclorometano (DCM) viene utilizzato. Il metodo qui produce microfibroso PLGA, PLA e PCL e nanofibrous PHBV patibolo con micro-perle di dimensioni ('collana di perle' morfologia).
- Rivestire la rotazione mandrino collettore con foglio di alluminio, con il lucido / lucido rivolto verso l'esterno. Il nostro mandrino era di 20 cm di larghezza e 10 cm di diametro.
- Preparare le soluzioni di polimero; PLA, PCL e PHBV sono costituiti come una soluzione al 10% in peso in DCM. PLGA è costituita come una soluzione 20% in peso in DCM.
- Luogo 4 siringhe di 5 ml di volume su una pompa a siringa. Le siringhe sono caricati a contain 5 ml del polimero ciascuno con 20 ml in totale.
- Per PLA, PCL e PHBV utilizzare una portata di 40 μLmin -1 per siringa.
- Per PLGA utilizzare una portata di 30 μLmin -1 per siringa.
- Per PLA, PCL e PLGA utilizzare una distanza di lavoro di 17 cm dalla punta dell'ago a mandrino.
- Per PHBV utilizzare una distanza di lavoro di 10 cm dalla punta dell'ago al mandrino.
- Caricare gli aghi della siringa per 17.000 V (73.030 P, Genvolt, Shropshire, Regno Unito) e electrospin dalla distanza appropriata sul mandrino foglio di alluminio verniciato.
- Per fibre casuali ruotare il mandrino a 200 rpm.
- Per fibre allineate ruotare il mandrino a 1000 rpm.
- Le impalcature possono essere memorizzati sul foglio di alluminio in condizioni secche. Stoccaggio raccomandata è in un contenitore sigillato a 4 ° C in presenza di essiccante. Nella nostra esperienza ponteggi rimangono stabili per almeno 4 mesi (forse molto più lungo) in queste condizioni (non siamo a conoscenza di puGli studi su prestabilite condizioni di conservazione a lungo termine per ponteggi).
2. Produzione di ponteggi complessi Spinning sequenziali
Filatura sequenziali fornisce un metodo per combinare le proprietà di materiali differenti per creare un materiale che ha la migliore di entrambe le proprietà. PHBV produce un appartamento, denso, foglio fragile mentre PLA o PCL filatura produce lastre a bassa densità elastiche. Entrambi i materiali sostenere l'adesione delle cellule. Consecutivamente filatura questi risultati materiali in un denso membrana impermeabile alle cellule che è elastica.
- Impostare il rig electrospinning ai sensi dell'articolo 1, con le condizioni PHBV filatura.
- Electrospin PHBV come sopra.
- Senza cambiare il foglio di alluminio, electrospin un secondo polimero on-top utilizzando i parametri e le condizioni normali per questo polimero (ad esempio 17 cm tamburo a spillo, 17000 V, 200 rpm per PLA). Questo processo additivo costruisce un doppio strato di scaffold produrre un doppio strato.
3. Produzione di ponteggi multistrato da ricottura Livelli Diversi Insieme
- Le impalcature, possono essere stratificate attraverso l'uso di calore ricottura. Per fare questo 4 fogli di PLGA sono disposti uno sopra l'altro e poi ricotto termicamente a 60 ° C per 3 ore.
- Le impalcature possono anche essere ricotti con vapore ricottura. Qui 4 fogli di PLGA sono posti uno sopra l'altro e sospesa 2 cm al di sopra di un pool di DCM (10 ml) per 1 ora. Questa operazione viene eseguita in un contenitore sigillato a temperatura ambiente.
4. Produzione asettica e sterilizzazione Postproduzione di ponteggi elettrofilate
- Asettica produzione impalcatura può essere ottenuta elettrofilatura in un ambiente asettico di una cappa a flusso laminare all'interno di un ambiente sterile. Per fare questo polimeri o sterili di grado medicale o polimeri sterilizzati mediante incubazione in DCM può essere utilizzato. Una volta sciolto, polimeri sono elettrofilate su una pellicola sterile come avvoltoterilised mandrino. Ponteggi vengono trattati in modo asettico. La sterilità è verificato incubando i campioni del patibolo in antibiotico senza mezzi di crescita per il periodo appropriato.
- Per la disinfezione etanolo (questo è di uso sperimentalmente, ma non è riconosciuta una metodologia di sterilizzazione che possono essere prese in clinica) ponteggi vengono posizionati brevemente (15 min) in 70% v / v di etanolo in acqua distillata. Per pratici fini sperimentali è generalmente sufficiente per disinfettare scaffold in modo che possano poi essere combinati con successo cellule coltivate.
- Per ponteggi sterilizzazione acido peracetico sono immersi in acido peracetico (0,1% v / v in tampone fosfato salino (PBS)) ed incubato per 3 ore a temperatura ambiente, come descritto in Selim et al. 9
- Per sterilizzazione gamma ponteggi vengono irradiate con una dose di 3 kGy utilizzando una sorgente di cesio come descritto in Selim et al. 9
5. Test biomeccanico di ponteggi
- Le impalcature sono tagliati in rettangoli 5 mm x 20 mm, misurato per spessore mediante un micrometro, e posto in uno strumento Bose ElectroForce 3100. Questa macchina applica una forza di 0-22 N fino a uno spostamento di 6mm e trame contro il carico di spostamento come una sollecitazione / deformazione curva. Questo permette al modulo di Young e elasticità essere calcolato.
6. Visualizzando Celle ponteggi e valutazione della produzione ECM
Le celle possono essere colorati con coloranti fluorescenti vitali che permettono di vedere le cellule sulle impalcature come essi attribuiscono, migrare e proliferare. Cultura post la presenza di cellule su ponteggi può essere determinato mediante colorazione per nuclei delle cellule con 4 ',6-Diamidino-2-fenilindolo dicloridrato (DAPI). La produzione di ECM dalle cellule sul ponteggio può essere valutata mediante colorazione delle cellule per una serie di proteine ECM compreso elastina, come illustrato in questo esempio. Tutti i ponteggi utilizzati sono stati misurati ad unaspessore di almeno 0,2 mm e tagliare in quadrati di 1,5 cm x 1,5 cm prima della semina.
In questi studi fibroblasti cutanei umani sono utilizzati in tutto a causa del loro ruolo nella ricostruzione dei tessuti molli, che è il nostro principale interesse di ricerca del laboratorio.
Le cellule sono ottenute da campioni di pelle da pazienti sottoposti a chirurgia elettiva per la riduzione del seno o addominoplastica (il consenso è stato dato per il loro tessuto da utilizzare per scopi di ricerca). I tessuti sono raccolti ed utilizzati in forma anonima sotto licenza Tissue Research Bank 12.179. I tessuti vengono lavate con PBS contenente streptomicina (0,1 mg / ml) e penicillina (100 UI / ml) e amfotericina B (0,5 mg / ml). Campioni di tessuto sono incubati in 0,1% w / v tripsina e 0,1% di glucosio in PBS (12-18 ore, 4 ° C). Il derma è staccata, tritata finemente e incubate con 10 ml di collagenasi (0,5% w / v in DMEM e 10% FCS, 37 ° C per 18 ore). Centrifugazione dei suspens cellula con conseguenteione (400 g per 10 min), produce un pellet di cellule che possono essere coltivate e subcoltivate in DMEM supplementato con siero fetale di vitello (FCS, 10% v / v), streptomicina (0,1 mg / ml), penicillina (100 UI / ml) e amfotericina B (0,5 mg / ml). Fibroblasti solo di passaggio 4-9 vengono utilizzati negli esperimenti.
- Fibroblasti dermici umani, una volta confluenti in un T75 (EasyFlask, Nunc, New York, USA) sono seminate con l'aggiunta di tripsina / EDTA (5 ml, 5 mg / ml di tripsina, 2 mg / ml in soluzione salina EDTA), incubando per 5 minuti a 37 ° C. La sospensione viene centrifugata per 10 minuti (150 g). Le cellule vengono risospese in 5 ml di DMEM (supplementato con FCS (10% v / v), streptomicina (0,1 mg / ml), penicillina (100 UI / ml) e amfotericina B (0,5 mg / ml)) e contati utilizzando un emocitometro, e la concentrazione viene regolato per la semina. Le cellule sono normalmente seminate a 50.000 cellule per pozzetto.
- Se necessario, prima di semina le cellule sul patibolo, le cellule possono essere pre-etichettati con CellTracker rosso o verde. La cellas sono lavato con 3 x 5 ml di PBS. Una soluzione di 10 mM in CellTracker privo di siero, cellule appropriate, medio (10 ml) è aggiunto e le cellule sono incubate per 45 minuti a 37 ° C. Dopo l'incubazione, le cellule vengono lavate in 3 x 5 ml di PBS seguente cui essi vengono seminate su ponteggi. A seguito di tale superficie delle matrici possono essere esposte in un microscopio ImageExpress Axon (Molecular Devices, Sunnyvale, USA) a λex nm 570-620 nm λem (CellTracker rosso) e 480 nm λex - 533 nm λem (CellTracker verde). Per studiare la penetrazione di cellule approfondire scaffold un microscopio confocale multifotone può essere utilizzato. Questo può raggiungere circa 200 micron penetrazione nella maggior parte scaffold con o senza cellule.
- Campioni post coltura sono fissati in 1 ml di formaldeide 3,7% in PBS a 37 ° C per 20 minuti e poi lavato con 3 x 1 ml di PBS.
- 200 pl di anticorpi elastina primari vengono aggiunti a ciascun campione (5% v / v in PBS, coniglio anti-umane ela alfastagno, AbDserotec, Kidlington, UK) e incubate a 37 ° C per 30 minuti.
- I campioni sono lavato con 3 x 1 ml di PBS e poi incubate in una soluzione di anticorpo secondario (0,5% v / v di capra anti-IgG di coniglio (FC): FITC) in PBS contenente DAPI (1 pg / ml) per 30 minuti.
- Successivamente i campioni vengono lavati con 3 x 1 ml di PBS.
- DAPI e campioni di anticorpi secondari colorati vengono poi ripreso con un microscopio a fluorescenza ImageExpress Axon, λex 365 nm - 460 nm per λem DAPI λex e 480 nm - 533 nm λem per l'anticorpo secondario. DAPI macchie nucleo e permette di vedere la distribuzione delle cellule all'interno delle fibre molto facilmente.
7. Celle sottoponendo sui ponteggi a biassiale condizionata dinamica
Per esaminare l'effetto del condizionamento dinamica sulla produzione di fibroblasti ECM abbiamo sviluppato un semplice proof-of-concept per esplorare questo bioreattore.
- Montare palloncino e il flussoorgani di regolazione e preparare sistema in modo che possa essere facilmente collocato in un contenitore sterile adatto per la coltura cellulare una volta che è rivestita.
- Autoclavare l'apparecchio includendo il palloncino (122 ° C, 220 mbar per 1 ora). Possiamo confermare che i palloncini sopravvivere in autoclave, senza alterare la loro funzione, gonfiando e sgonfiando ripetutamente.
- In una stanza pulita, decomprimere l'apparecchio in una cappa a flusso laminare in grado di essere elettrofilate su.
- Gonfiare il palloncino per la superficie richiesta (ricordiamo il palloncino deve ancora inserirsi nel recipiente di coltura) con tampone fosfato e collegare il PBS ad una terra elettrica in un punto l'apparecchiatura che non deve essere sterile (il tubo di diramazione 3-way rubinetto).
- Electrospin il polimero desiderato sul palloncino utilizzando le normali condizioni di filatura, mediante una distanza di lavoro di 10 cm. Consentire l'impalcatura per essiccare per 1 ora. I "umida" fibre sono 'appiccicoso' sufficiente per aderire al surfasso del pallone, senza poi staccare.
- Posizionare il pallone in un recipiente sterile e trasportarlo in una cappa a flusso laminare adatto per la coltura cellulare.
- Rimuovere il palloncino e dal recipiente posto su una superficie sterile (capsula Petri) e ripetutamente (ogni 20 secondi) pipetta una sospensione di cellule (1 x 10 6 cellule in 5 ml di DMEM) sul palloncino rivestito per 20 minuti per tentare di distribuire cellule uniformemente sulla superficie.
- Mettere palloncino nel vaso della cultura, e aggiungere pre-riscaldati mezzi appropriati al tipo di cellula.
- Collegare il dispositivo di gonfiaggio una pompa a siringa (Kent scientifico, Genie Plus, Connecticut, USA) e gonfiare / sgonfiare il palloncino come richiesto per dare distensione biassiale. Una pompa a siringa controllato computer può essere usato per conseguire un sistema più complesso distensione.
8. Risultati rappresentativi
Le figure seguenti sono risultati rappresentativi che possono essere previstise i metodi sopra indicate.
Elettrofilatura possono essere utilizzati per creare scaffold con architetture casuali e ordinato (figura 1), questo è ripetibile e le fibre sono uniformi. Molti tipi di polimeri può essere elettrofilate con caratteristiche che possono variare notevolmente come mostrato nella Figura 2 per PHBV, PLA o PCL. Electrospinning in grado di produrre luce ponteggi soffici o membrane cellulari densi impenetrabili (vedi Figura 3). Tutti i ponteggi mostrati qui facilitato attacco e la proliferazione cellulare. Studi precedenti hanno dimostrato che le cellule possono migrare attraverso questi scaffold fino ad una profondità di almeno 500-600 um 9 PLA Per il diametro medio delle fibre è di 3 um;. Per PHBV è 0.3μm con perle che vanno da 5-20 micron, per PCL è 3 um, e per PLGA è 11 um. Altri studi che utilizzano altri sistemi solventi segnalare che PHBV può essere elettrofilate come fibre senza perline o perle polimeriche. 10,11
<class p => "jove_content" Se spessore impalcature sono necessarie acqueo e calore ricottura può essere impiegata per strati di ricottura ponteggi insieme (vedere Figura 4). Questi strati ponteggio non delamina e può essere molto difficile trovare la giunzione tra gli strati.Abbiamo dimostrato che le membrane a doppio strato può essere fatto in cui le cellule A e B possono ciascuno essere coltivati su una membrana separata senza mescolarsi come mostrato in figura 5. Qui mostriamo questo utilizzando fibroblasti cutanei umani colorati con due cellulari diversi coloranti fluorescenti tracker. Tale membrana a doppio strato potrebbe essere utile quando coltura di cellule per formare un tessuto duro come un osso o cartilagine su un lato separato dalle cellule destinate a formare una soffice (e di solito crescita più rapida) del tessuto sul lato come riparazione palatoschisi o ricostruttiva parodontale chirurgia. 12, 13
Per quanto riguarda l'effetto di sterilizzazione sul elettrofilate ponteggi abbiamoprecedentemente riportato che il metodo di impatti sterilizzazione sulla coltura cellulare scaffold e la successiva. 9 Questo è illustrato in figura 6 che mostra gli effetti di acido peracetico, irradiazione gamma ed etanolo sul diametro delle fibre e carico di rottura e modulo di Young di un ponteggio PLGA .
Irradiazione gamma ha alcun effetto significativo sul diametro delle fibre, mentre l'acido peracetico ed etanolo ridurre il diametro di fibra di circa il 50%. Per quanto riguarda carico di rottura ciascuno dei metodi di sterilizzazione cambiato il carico di rottura e l'elasticità dei ponteggi. Coltura di cellule su queste impalcature ulteriormente ridotto la tensione di rottura a trazione, ma aumenta l'elasticità.
Infine, un metodo per testare l'effetto di distensione dinamica biassiale su cellule coltivate su impalcature elettrofilate viene presentato. Questa proof-of-concept approccio dimostra che le cellule rimangano vitali durante la dinamicadistensione ma anche producono quantità maggiori di elastina in queste condizioni. Ciò contrasta nettamente la mancanza di elastina quando le cellule stesse sulla stessa scaffold sono mantenute in condizioni statiche (vedere Figura 7).
Figura 1. Mostra un cartone animato di un rig electrospinning e delle filatura di fibre casuali e in parallelo e poi strati di fibre disposte una sull'altra. Fibre perpendicolari possono essere creati da elettrofilatura un insieme di fibre allineate su una pellicola di alluminio, ruotando il foglio di 90 ° e poi immediatamente elettrofilatura una seconda serie di fibre allineate sopra di questi.
Figura 2. Mostra la morfologia di stuoie elettrofilati casuali di (A) PLA (barra della scala è di 100 micron), (B) PHBV (barra della scala è di 100 micron), (C) PCL (bar scala è 100 pm) e (D) PLGA (scala bar è 200 pm). Si noti che PLA, PCL e PLGA sono tutti ponteggi microfibrosi uniformi. PHBV è filata come una 'collana di perle' con nanofibre di collegamento 5-20 perline micron di dimensioni. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 3. Produzione di uno scaffold multistrato. Qui i ponteggi sono inizialmente utilizzando PHBV filate e poi siringhe piene di PLA o PCL vengono utilizzati. Questi vengono filate in cima al ponteggio PHBV. La figura mostra l'aspetto di questi ponteggi multistrato, (A) Un singolo strato PHBV, (B) Una sezione trasversale di un PHBV-PLA doppio strato, che mostra il nanofibrous densa, 'collana di perle' PHBV strato (a sinistra) e più aperto microfibroso PLA strato (a destra) e (C) Un singolo strato PLA.nk "> Clicca qui per ingrandire la figura.
Ponteggi Figura 4. Più spessi possono essere prodotta da calore e ricottura vapore ricottura. (A) e (B) mostra una sezione attraverso una ricotto vapore PLA scaffold dove iniziali ponteggi fibrose di circa 150 pm sono state messe insieme e diclorometano vapore viene usato per fare ponteggi molto spesse fino a 500 um. In (C) e (D) si può vedere che il ponteggio consiste di strati di fibre molto spesse intervallati da strati di fibre sottili creati da calore ricottura strati di fibre sottili e spessi insieme. Questo approccio può essere utilizzato per la produzione di ponteggi di complesse proprietà meccaniche. Clicca qui per ingrandire la figura .
Fi gura 5. Aspetto delle cellule su un'impalcatura doppio strato. In tutti i casi le cellule sono presenti fibroblasti dermici umani. (A) su fibroblasti elettrofilate PLA in cui sono fissate le cellule e colorati con DAPI. (B) DAPI cellule colorate su PHBV. In (C), i fibroblasti sono pre-colorato con un colorante vitale, verde CellTracker, e si può vedere l'aspetto del loro al di là PLA del doppio strato. (D) Una sezione attraverso il doppio strato con rossi fibroblasti tinto sulla superficie inferiore PHBV e verdi fibroblasti colorate sulla superficie superiore PLA. (E) fibroblasti pre-tinto con rosso CellTracker cresciute sulla superficie PHBV. L'utilizzo di coloranti fluorescenti vitali fornisce una metodologia conveniente per guardare la distribuzione delle cellule sul patibolo, mentre le cellule sono ancora in crescita. Si possono utilizzare questi coloranti di routine per almeno 7 giorni. Tuttavia la concentrazione del colorante si diluisce come le cellule si dividono. Barre di scala sono pari a 0,1 mm.g6.jpg "alt =" Figura 6 "/>
Figura 6. Proprietà biomeccaniche elettrofilate scaffold sono ottenuti utilizzando un tensiometro Bose ElectroForce dispositivo (A). (B) sforzo / deformazione curve di PLGA impalcature sterilizzato mediante irradiazione gamma, alcol, acido peracetico, o asettico prodotto. Tre misurazioni possono essere ottenute da tale grafico: il carico di rottura (UTS) per cui la fibra può essere sottoposto prima che si rompa, la deformazione ultima a trazione e il modulo di Young. Quest'ultimo dà un'indicazione della elasticità del ponteggio. (C) L'effetto di ogni metodo di sterilizzazione sul diametro delle fibre PLGA in micron. Ogni metodologia di sterilizzazione è diminuito UTS. Sia l'acido peracetico e raggi gamma diminuire il modulo di Young che danno un più elastico patibolo, l'alcool rende il patibolo particolarmente fragile. Clicca qui per ingrandire la figura .Figura 7. Questa figura mostra l'uso di un palloncino semplice di fornire un bioreattore biassiale in cui ponteggi (e cellule che crescono all'interno dei ponteggi) possono essere sottoposti a distensione biassiale per periodi di tempo. (A) un palloncino sgonfio su cui elettrofilate fibre, PHBV, sono stati depositati. In questa fase il palloncino è parzialmente coperta con fibre. (B) Un palloncino ricoperto di PHBV e fibre PLA. (C) Una sospensione cellulare viene ripetutamente appoggiato sul palloncino. (D) Un pallone posizionato in una bottiglia sterile di supporto a cui è collegato il palloncino ad una pompa a siringa e PBS (utilizzato come elettrolita conduttore) viene utilizzato per gonfiare delicatamente e lasciar sgonfiaggio del palloncino contro un programma programmato. (E) Celle ponteggi sono stati tolti dal pallone alla fine dell'esperimento e l'analisi effettuata per la vitalità cellulare mostrato in (F) in cui cellule vitali sviluppare un colore blu scuro utilizzando metabolica indicator 3 - (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio bromuro. (G) dimostra che le cellule (blu) coltivate su questo palloncino e soggetti a distensione biassiale sviluppare fibre elastiche (verde, tinto con anticorpi specifici elastina), mentre le cellule stesse su un identico ponteggio (H) coltivate in condizioni statiche sono trascurabili produzione elastina . Barre di scala sono pari a 0,025 mm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Electrospinning è una tecnica molto popolare per la produzione di scaffolds per l'ingegneria tissutale. 14, 15, 16 Mentre è relativamente semplice da realizzare ponteggi elettrofilati di base per uso sperimentale la tecnica è complessa e sfaccettata con molte variabili. 6 Ci sono molti studi che descrivono come la electrospinning parametri determinano il patibolo prodotto. In questo studio l'attenzione è rivolta alla post-produzione una notevole sfida per fare di architetture adeguate impalcature e le proprietà meccaniche e per incoraggiare le cellule al loro interno per produrre le proteine extracellulari di realizzare in forma di tessuto per l'impianto nell'uomo.
Il nostro obiettivo in questo articolo è quello di descrivere i metodi per dotare i lettori a progettare e caratterizzare ponteggi per una vasta gamma di scopi. In questo articolo descriviamo metodologie per rendere ponteggi complessi e più spesso e per la sterilizzazione ponteggi per l'uso sperimentale e clinica. Noi descriviamo anche immagini cells sui ponteggi e l'induzione della produzione di fibre di elastina sottoponendo le cellule a distensione biassiale.
Molte delle caratteristiche desiderate di ponteggi può essere realizzato post produzione (come ricottura più strati) e sterilizzazione. Tuttavia questi svolta influenzerà le proprietà meccaniche dei ponteggi. Segnaliamo che le metodologie di sterilizzazione tutti tendono a cambiare carico di rottura e il modulo di Young a livelli diversi. Uno studio recente dal nostro gruppo rispetto irradiazione gamma, acido peracetico ed etanolo per i loro effetti come potenziali regimi sterilizzanti per ponteggi PLGA 9 Gli effetti negativi di tecniche di sterilizzazione può essere evitato producendo scaffold in condizioni asettiche -. Quest'ultimo richiede l'uso di una camera bianca . Diversi utenti possono selezionare le diverse metodologie, ma tutti devono essere consapevoli che le metodologie di sterilizzazione attuali avrà un impatto negativo sulle proprietà dei ponteggi.
C ultura di celle ponteggi colpisce anche le proprietà meccaniche dei ponteggi. Induzione della produzione ECM sottoponendo celle ponteggi a distensione biassiale può essere usata per influenzare le proprietà meccaniche.
La metodologia di filatura uno scaffold sopra un altro per fare una membrana a doppio strato è facilmente comprensibile e che descriviamo ponteggi doppio strato in grado di supportare due diverse popolazioni di cellule illustrati in questo documento pre-etichettatura cellule con due coloranti vitali delle cellule del tracker. Questi sono stati utilizzati per illustrare che la membrana a doppio strato raggiunto il suo scopo dichiarato.
Infine, il biassiale rig distensione budget descritto in questo studio può essere utilizzato per fornire una gamma di regimi. Ciclico, lineare, e regimi casuali possono essere facilmente programmati e applicata. Questa versatilità permette al sistema di essere utilizzato per molti dei problemi incontrati in ingegneria dei tessuti come, palatoschisi, pavimento pelvico, della vescica, e la pelle.
"> Nella letteratura ingegneria tissutale l'uso di sistemi di test per la coltivazione di cellule monoassiali su ponteggi è stata riportata. 4 Tuttavia non siamo riusciti a trovare alcuna letteratura pubblicata che fare con i tessuti molli come rispondere a distensione biassiale. Questo approccio semplice dimostra che le cellule rispondono a distensione biassiale con la produzione di elastina -. un componente chiave della matrice extracellulare che conferisce ai tessuti molli ritorno elastico Questo dà una chiara indicazione di come i tessuti molli di condizionamento man mano che crescono in laboratorio offre un percorso per la produzione di tessuti per l'impianto adatto per le zone di del corpo in cui i tessuti nativi hanno elasticità intrinseca. Questa è un'area in cui lo sviluppo ulteriore chiaramente meritato dalla comunità dell'ingegneria dei tessuti e produttori bioreattore.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Acknowledgments
Ringraziamo BBSRC per il finanziamento di un dottorato di ricerca per Bye Mr. Frazer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly lactic-co-glycolic acid | Sigma Aldrich | ||
| Poly lactic acid | Sigma Aldrich | 81273 | Inherent viscosity ~2.0dl/g |
| Poly ε-caprolactone | Sigma Aldrich | ||
| Poly hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate 12:1 | Goodfellow | 578-446-59 | PHB88/PHV12 |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich or Fisher | 270997 or D/1850/17 | >99.8% contains 50-150ppm amylene stabiliser |
| 50 multi coloured balloons | Wilkinson’s Hardware Stores Ltd. | 0105790 | |
| Goat anti-rabbit IgG (FC):FITC | AbDserotec | STAR121F | |
| Rabbit anti-human alpha elastin | AbDserotec | 4060-1060 | |
| Screw Cap GL45 PP 2 Port, pk/2 | SLS | 1129750 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma Aldrich | 32670 | |
| CellTracker green CMFDA | Invitrogen | C7025 | |
| CellTracker red CMTX | Invitrogen | C34552 |
References
- Canton, I., McKean, R., Charnley, M., Blackwood, K., Fiorica, C., Ryan, A., MacNeil, S. Development of an Ibuprofen-releasing biodegradable PLA/PGA electrospun scaffold for tissue regeneration. Biotechnology and bioengineering. 105, 396-408 (2010).
- Blackwood, K., McKean, R., Canton, I., Freeman, C., Franklin, K., Cole, A., Brook, I., Farthing, P., Rimmer, S., Haycock, J., Ryan, A., MacNeil, S. Development of biodegradable electrospun scaffolds for dermal replacement. Biomaterials. 29, 3091-3104 (2008).
- Yang, F., Maurugan, R., Wang, S., Ramakrishna, S. Electrospinning of nano/micro scale poly(L-lactic acid) aligned fibers and their potential in neural tissue engineering. Biomaterials. 26, 2603-2610 (2005).
- Sittichokechaiwut, A., Edwards, J. H., Scutt, A. M., Reilly, G. C. Short bouts of mechanical loading are as effective as dexamethasone at inducing matrix production by human bone marrow mesenchymal stem cell. Eur. Cell Mater. 20, 45-57 (2010).
- Sill, T. J., von Recum, H. A. Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29 (13), 1989-2006 (2008).
- Deitzel, J., Kleinmeyer, J., Harris, D., Beck Tan, N. C. The effect of processing variables on the morphology of electrospun nanofibers and textiles. Polymer. 42, 261-272 (2001).
- Fridrikh, S., Yu, J., Brenner, M., Rutledge, G. Controlling the fiber diameter during electrospinning. Physical review letters. 90, 1-4 (2003).
- Fong, H., Chun, I., Reneker, D. Beaded nanofibers formed during electrospinning. Polymer. 40 (16), 4585-4592 (1999).
- Selim, M., Bullock, A. J., Blackwood, K. A., Chapple, C. R., MacNeil, S. Developing biodegradable scaffolds for tissue engineering of the urethra. BJU Int. 107 (2), 296-302 (2010).
- Tong, H. -W., Wang, M. An investigation into the influence of electrospinning parameters on the diameter and alignment of poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate) fibers. Journal of Applied Polymer Science. 120 (3), 1694-1706 (2011).
- Tong, H. -W., Wang, M. Electrospinning of poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate) fibrous tissue engineering scaffolds in two different electric fields. Polymer Engineering & Science. 51 (7), 1325-1338 (2011).
- Retzepi, M., Donos, N. Guided Bone Regeneration: biological principle and therapeutic applications. Clinical oral implants research. 21, 567-576 (2010).
- Moreau, J., Caccamese, J., Coletti, D., Sauk, J., Fisher, J. Tissue engineering solutions for cleft palates. Journal of oral maxillofacial. 65, 2503-2511 (2007).
- Yang, F., Both, S., Yang, X., Walboomers, X., Jansen, J. Development of an electrospun nano-apatite/PCL composite membrane for GTR/GBR application. Acta biomaterialia. 5, 3295-3304 (2009).
- Yoshimoto, H., Shin, Y., Terai, H., Vacanti, J. A biodegradable nanofiber scaffold by electrospinning and its potential for bone tissue engineering. Biomaterials. 24, 2077-2082 (2003).
- Telemeco, T., Ayres, C., Bowlin, G., Wnek, G., Boland, E., Cohen, N., Baumgarten, C., Mathews, J., Simpson, D. Regulation of cellular infiltration into tissue engineering scaffolds composed of submicron diameter fibrils produced by electrospinning. Acta biomaterialia. 1, 377-385 (2005).
