Summary
Nous décrivons ici un roman à forte teneur en test l'inflammation induite chimiquement visant à l'identification du système immunitaire modulateurs bioactifs. Nous avons réussi à combiner la microscopie automatisée avec des scripts logiciels développés permettant la quantification automatique de la réponse inflammatoire ainsi que la poursuite du traitement des données, l'analyse, l'exploitation minière, et le stockage.
Abstract
Larves poisson zèbre sont particulièrement favorables à l'animal entier petite molécule écrans 1,2 en raison de leur petite taille et la facilité relative de la manipulation et l'observation, ainsi que le fait que les composés peuvent être simplement ajoutés à l'eau de baignade et sont facilement absorbés lorsqu'ils sont administrés dans un <solution à 1% DMSO. En raison de la clarté optique des larves de poisson zèbre et la disponibilité de lignes transgéniques exprimant des protéines fluorescentes dans les leucocytes, le poisson-zèbre offrent l'avantage unique de suivi d'une réponse inflammatoire aiguë in vivo. Par conséquent, en utilisant le poisson zèbre pour haute teneur écrans de petites molécules visant à l'identification du système immunitaire modulateurs composés avec un débit élevé a été proposé 3-6, suggérant des scénarios d'induction par exemple l'inflammation dans les tissus localisés pseudos fin, dommage laser dirigé vers la surface jaune d' embryons 7 ou amputation tailfin 3,5,6. L'inconvénient majeur de ces méthodes a toutefois étél'exigence de la manipulation manuelle larve pour induire la blessure, empêchant ainsi criblage à haut débit. Introduction de l'inflammation induite chimiquement (Chin) dosage 8 éliminé ces obstacles. Depuis blessure est infligée chimiquement le nombre d'embryons qui peuvent être traitées simultanément est pratiquement illimitée. Traitement temporaire des larves du poisson zèbre avec du sulfate de cuivre induit sélectivement la mort cellulaire dans les cellules ciliées de la ligne latérale et les résultats en matière de recrutement de granulocytes rapide à neuromastes blessés. La réponse inflammatoire peut être suivie en temps réel en utilisant composé transgénique cldnB :: GFP / lysC :: DsRed2 6,9 larves du poisson zèbre qui expriment une protéine fluorescente verte dans les cellules neuromastes, ainsi que quelques rouges fluorescentes granulocytes d'étiquetage de protéines.
Afin de concevoir une stratégie de dépistage qui permettrait aux deux analyses de haut-contenu et à haut débit, nous avons introduit robotique de manipulation de liquide et combinée micr automatiséoscopy avec un script un logiciel développé sur mesure. Ce script permet de quantifier automatisé de la réponse inflammatoire en marquant la zone occupée par pour cent rouges fluorescentes leucocytes dans une zone définie de manière empirique entourant blessés verts fluorescents neuromastes. En outre, nous avons automatisé le traitement des données, la manipulation, la visualisation et de stockage tout fondé sur la coutume développé MATLAB et des scripts Python.
En bref, nous introduisons un système automatisé HC / HT écran qui permet de tester des composés chimiques pour leur effet sur l'initiation, la progression ou la résolution d'une réponse inflammatoire granulocytaire. Ce protocole sert un bon point de départ pour plus de des analyses en profondeur des mécanismes de drogue et les voies impliquées dans l'orchestration d'une réponse immunitaire innée. Dans l'avenir, il peut aider à identifier les intolérables effets toxiques ou hors cible lors des phases antérieures de la découverte de médicaments et de réduire ainsi les risques et les coûts de procédure pour le développement de médicaments.
Protocol
1. Manipulation des animaux
Pour le dosage de l'utilisation Chin 3 larves dpf résultant de croisements entre des groupes homozygote cldnB double transgénique :: GFP / lysC :: DsRed2 et AB (type sauvage) du poisson. Recueillir des embryons par la reproduction naturelle et de les élever à 29 ° C dans un milieu E3 (5 mM de NaCl, 0,17 mM de KCl, 0,33 mM CaCl 2, 0,33 mM MgSO 4, et 0,1% de méthylène bleu, équilibrée à pH 7,0) dans des boîtes de Pétri. Il est essentiel de maintenir une densité d'embryons ne dépassant pas 50-70 par plaque.
2. Tri Larve
Vérifiez toutes les larves sous un stéréoscope de fluorescence pour l'expression rapporteur fluorescent, l'inflammation spontanée et le développement liés à l'âge approprié.
3. Préparation moyen de dépistage (Toujours préparer une nouvelle)
Préparer le milieu E3 sans bleu de méthylène additionné de DMSO (1% final) et MS222 (0,05 g / l).
4. CuSO4Préparation (Toujours préparer une nouvelle)
D'abord peser CuSO 4 (M r = 159,6 g / mol) et de préparer une solution stock à 20 mM dans dH 2 O. Préparer 120 um CuSO solution de travail 4 (de 20 solution stock mM) dans E3/DMSO (1%) / MS-222. Protéger CuSO 4 solution de la lumière.
5. La préparation des plaques de 384 puits (Greiner microplaques 384 puits)
Pré-ajouter 20 ul de E3/DMSO (1%) / MS-222 à chaque puits avec une pipette inverse. Une augmentation de la pointe de pipette alésage est nécessaire pour traiter les embryons soigneusement sans infliger aucune blessure, ce qui est fait en coupant la pointe de 2 mm alésage. Transfert seule larve dans 74 ul de milieu dans chaque puits (84 pi pour le contrôle non traité). Si nécessaire, les larves d'orienter dans une position latérale à l'intérieur du puits en utilisant une pipette souple Eppendorf Microloader Astuce (Eppendorf; 5242 956.003).
Effectuer toutes les étapes suivantes de manipulation des liquides avec un liquide de robotla manipulation poste de travail pour assurer le traitement simultané de toutes les larves.
6. Traitement de la toxicomanie
Mélanger des composés de la plaque des stocks de médicaments 5 fois par aspiration et refoulement. Ajouter 16 ul de la plaque de drogue stock de 7,5 x à chaque puits et mélanger 5 fois. Ajustez la position de pointe dans les puits pour prévenir les blessures de larves et de passer le milieu à 10 pi / s. Mélanger moyennes dans les puits 4 fois pour assurer une distribution homogène de la drogue dans le puits.
7. Incubation
Incuber plaque de blindage pendant 1 h à 29 ° C recouverts d'une feuille d'aluminium pour protéger les composés ainsi que CuSO 4 de la lumière.
8. Blessures chimique
Ajouter 10 ul de 120 uM CuSO 4 solution de travail à chaque puits, sauf pour les contrôles négatifs, mélange 4 fois et incuber à nouveau pendant 1 h à 29 ° C.
9. Lavage
Enlever et échanger 80 pi de moi dium de chaque puits deux fois (en 20 étapes ul) pour éliminer les composés et CuSO 4.
10. Acquisition d'image
Démarrer l'acquisition d'images sur un microscope inversé automatisé (ex: Olympus scan ^ R) à 90 minutes après traitement au cuivre initial. Première série z-niveau afin que neuromastes de droite et de gauche de la ligne latérale postérieure sont visibles. Image dans chaque puits une fois par heure dans le fond clair canaux, Cy3 et la GFP dans 4 plans focaux (une distance de 50 um) en utilisant un objectif 4x (NA = 0,13).
Informations supplémentaires sur l'image et le traitement des données sont disponibles sur demande.
11. Traitement d'image
1. Les données de tri
Les images brutes sont traitées avec notre script de logiciels personnalisés LabView. La première opération dans le pipeline de traitement d'image est le tri des images du microscope premières données générées par le dossier de canal, et le temps et une information de point.
ove_step "> 2. accent étenduePar la suite, le logiciel crée des images de discussion prolongée de 4 plans focaux pour chacun des canaux.
3. RVB-incrustation
Dans une dernière étape, les images de discussion élargie des 3 canaux sont fusionnés pour donner lieu à une finale RGB-superposition d'image.
4. La détection automatique neuromastes
Un outil de reconnaissance de formes (LabView rapide IA prototypage de l'outil) identifie neuromastes dans les images de superposition RGB et crée une zone d'intérêt définie empiriquement autour des neuromastes.
5. Quantification
Dans la zone d'intérêt définie empiriquement entourant neuromastes blessés rouges leucocytes fluorescentes reflète sous forme de pixels rouges) sont marqués en résulte dans une lecture primaire de p ourcentage un o rea ccupied par eukocytes l (Paol). En moyenne 95,27 ± 2,11% (FDA1) et 95,12 ±1,56% (FDA2) du puits (larves) ont été détectés correctement et ont ensuite été soumis à un traitement ultérieur des données. La sortie de données brutes (Paol pour chaque neuromastes détectée) est stocké dans un fichier texte et sert d'entrée de données pour les scripts MATLAB qui traitent les données brutes en outre.
12. Informatique
1. Imaps
Évaluer le succès des expériences individuelles par la visualisation graphique de la sortie de Paol données brutes dans un code de couleur pourrait être réalisé avec des cartes inflammation soi-disant (IMAPS) (Figure 2). Vert clair reflète une haute indice inflammatoire initiale; noire indique l'absence de l'inflammation. Ce rapide survol permet d'identifier rapidement des expériences ratées, qui peuvent ensuite être exclus de l'analyse des données supplémentaires.
2. Calcul de la moyenne des contrôles
Chaque plaque expérimentale contient 320 composés reflétant unede données unique point par composé et l'heure du point ainsi que 32 contrôles positifs et négatifs, respectivement. La commande 32 répétitions sont moyennées et l'écart type est calculé. Pour les contrôles des points de données au sein de seulement 2 écarts-types sont inclus.
3. Normalisation
La normalisation est faite par analyse de feuille de calcul. La valeur moyenne de DMSO, étant le témoin négatif, est mis à 0 et la plus haute moyenne Paol pour le contrôle de cuivre est mis à 1, de sorte que la différence maximale entre le contrôle positif et négatif est mis à 1. Paol Chaque composé est interpolés ou extrapolés linéairement aux contrôles respectifs sur la plaque expérimentale.
4. Lecture finale: l'indice inflammatoire
Après des expériences répétées suffisantes (c.-à-15) ont été menées, normalisées données brutes à partir d'expériences répétées sont en moyenne, entraînant une lecture finale - la réponse inflammatoireindex. L'indice inflammatoire initiale de la commande de cuivre commence à 100% pour le temps du point zéro et est corrélée à l'heure de début d'acquisition d'image (90 minutes après le traitement du cuivre initial).
5. Monotonic raccord de régression exponentielle
En raison de la résolution inflammation au fil du temps nous procédons à une monotone raccord exponentielle de régression non linéaire vers l'inflammation initiale à l'aide 
- Un 0 est une mesure pour la réponse initiale à l'instant t = 0, a 1 est liée à la pente de l'amplitude dans le temps.
6. 2-D parcelle d'espace caractéristique (Figure 4)
À générer de l'espace caractéristique, une régression non linéaire est appliquée et un groupe-analyse divise l'espace caractéristique en régions caractéristiques, permettant ainsi l'identification automatique de candidats intéressants à partir de différentes catégories immunitaire-modulateurs (anti-inflammatthéorie, anti-résolution, pro-inflammatoire, pro-résolution). Tous les composés sont affichés dans le tracé 2-D d'après les paramètres a 0 et a 1.
13. Manipulation et stockage des données
Nos données routines de gestion créer des pages Web pour visualiser et représenter de dépistage de drogues, assurant ainsi une vue d'ensemble rapide de l'image et de traitement de données des résultats des étapes, ainsi que d'une vue détaillée à la demande de l'utilisateur 10. Liens vers d'autres soft pertinentes bases de données hétérogènes biologiques et chimiques sont intégrés aussi bien pour fournir une ressource précieuse pour les études comparatives et roman 11. Par ces routines, propres normes de données et métainformations sont fixés pour le stockage à long terme de ces données.
14. Les résultats représentatifs
Dans un écran de pilote, nous avons analysé une bibliothèque constituée de 640 approuvé par la FDA connus composés bioactifs pour les effets sur l'initiation, la progression ou la résolution d'un Granulocytic réponse inflammatoire. Sur la base des effets observés que nous avons classées 4 types de phénotypes immunomodulateurs qui pourraient être indicatifs des différents modes d'action: anti-inflammatoires (1), anti-résolution (2), pro-inflammatoire (3) et pro-résolution (4) , qui peut être décrite avec les paramètres a 0 et un 1, qui découlent d'une installation de régression non linéaire monotone (e ao + alx -) vers l'inflammation initiale. Un 0 représente l'amplitude de la réponse inflammatoire tandis qu'une 1 caractérise la pente de la courbe et donc décrit résolution l'inflammation. Affichage tous les composés dans un tracé 2-D fonctionnalité espace (1 une par rapport à un 0) permet une identification automatisée de candidats frappées à partir des différentes catégories modulateurs immunitaires (figure 3).
45 sur 640 composés exercée significative effet anti-inflammatoire par la réduction de l'indice inflammatoire initiale à 50% ou moins. Dans this catégorie nous avons trouvé 6 composés appartenant à la classe pharmacologique des non-stéroïdiens anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS), confirmant la validité de notre approche. Toutefois, les AINS classé pas parmi les plus puissants anti-inflammatoires. Outre les AINS, nous avons trouvé plusieurs autres classes de médicaments pharmacologiques tels que par exemple pour les bloqueurs de récepteurs de l'angiotensine (ARA), des antibiotiques et des inhibiteurs de la pompe à protons.
7 composés satisfait aux critères de seuil empiriquement définies pour d'éventuels pro-résolution de la drogue.
18 médicaments ont exercé un effet pro-inflammatoire, ce qui entraîne le recrutement des leucocytes exagérée à neuromastes blessés par rapport à des témoins positifs.
Seulement 2 composés empêché la résolution en temps opportun de la réponse inflammatoire.
L'effet anti-inflammatoire des candidats ont frappé plusieurs (candidats exemplaires mentionnés ci-dessus à partir de classes de médicaments pharmacologiques) de la coul écran piloted être confirmé d'une manière dose-dépendante dans les prochains essais Chin secondaires (données non présentées). Répétition de 4 potentiels pro-résolution des médicaments n'a pas confirmé le mode d'action comme indiqué exercée dans l'écran principal. 2 des médicaments a eu un léger potentiel anti-inflammatoire à des concentrations plus élevées (20 uM). Un troisième médicament présentait un marginal non dose-dépendante effet anti-inflammatoire à des concentrations de médicaments allant de 5 à 20 uM. Le quatrième médicament n'a eu aucun effet sur la réponse inflammatoire aux concentrations testées.
Figure 1. Flux de travail de l'essai Chin. Individuel composé transgénique cldnB :: GFP / lysC :: DsRed2 larves (3 dpf) sont distribués manuellement dans des plaques de microtitration à 384 puits. Les médicaments sont ajoutés simultanément à chaque puits en utilisant un Zephyr station de travail compacte Liquid Handling. Plaques d'essai sont ensuite incubées pendant 1 h à 29 ° C. Le traitement avec CuSO 4
Figure 2. . Aperçu image des images brutes La figure montre les images brutes de 4 plans focaux (Z = 0 - 3) à des distances de 50 um dans les canaux Cy3 (à gauche) et de la GFP (à droite), respectivement. Les flèches (Z = 1,2) indiquent neuromastes exemplaires, pointes de flèches (Z = 1,2) points à leucocytes groupés autour de neuromastes.
Figure 3. Cartes Inflammation (IMAPS) Le succès des expériences individuelles peuvent être évalués en imaps reflétant la réponse inflammatoire (données brutes) dans un code de couleur: vert clair. Reflète une inflation initiale élevée réponse mmatory; noire indique l'absence de l'inflammation imaps à timepoint 0 (à gauche) et le temps du point 5 (à droite) montrent clairement si une expérience doit être inclus dans le traitement ultérieur des données.. Contrôles de cuivre (la ligne 13 et 24) se présentent dans différents tons de vert, tandis que le DMSO puits de contrôle (ligne 1 et 12) apparaissent en vert foncé ou noir. Au moment du point 5, l'inflammation est presque résolu dans les contrôles de cuivre, maintenant indiqué dans les tons sombres de vert ou noir. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 4. 2-D parcelle d'espace caractéristique de 320 composés d'une bibliothèque et approuvé par la FDA leurs contrôles respectifs. Tous les puits composés peuvent être affichées dans une parcelle de 2-D fonction d'espace sur la base des paramètres d'un 0 et un 1, qui découlent d'une non-linéaire Raccord de régression (d/4203/4203eq1.jpg "alt =" l'équation 1 "/>) vers l'inflammation initiale. Cette parcelle d'espace caractéristique permet l'identification automatisée des candidats intéressants appartenant à l'un des 4 suivantes immunitaire modulateurs catégories qui peuvent être indicatifs des médicaments «mode d'action:. anti-inflammatoire (1), anti-résolution (2), pro-inflammatoire (3) et pro-résolution (4) Cliquez ici pour agrandir la figure .
Discussion
Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dimethyl sulphoxide | Carl Roth GmbH Co KG | A994.2 | |
| Copper(II) sulphate anhydrous | Carl Roth GmbH Co KG | PO23.1 | |
| FDA approved drug library | Enzo Life Sciences | BML-2841-0100 | |
| 384 microwell plate Non-binding, μClear | Greiner | 781906 | black |
| Olympus scan^R | Olympus | ||
| Zephyr Compact Liquid Handling Workstation | Caliper |
References
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