Summary
Biosyntesen av brosk extracellulär matris genom kondrocyter kan påverkas av applicering av mekaniska stimuli. Denna metod beskriver tekniken att tillämpa dynamiska komprimerande stammar till kondrocyter inkapslade i 3D konstruktioner och utvärdering av inducerade förändringar i kondrocyt ämnesomsättning.
Abstract
Ledbrosk lider av en begränsad reparation kapacitet när den skadats av mekanisk förolämpning eller bryts ned av sjukdom, såsom artros. För att råda bot på denna brist har flera medicinska åtgärder utvecklats. En sådan metod är att dyka upp igen det skadade området med vävnadstekniska brosk, men det vävnadstekniska vanligtvis saknar de biokemiska egenskaper och hållbarhet hos infödda brosk, ifrågasätta sin långsiktiga överlevnadsförmåga. Detta begränsar tillämpningen av broskvävnad engineering till reparation av små fokala defekter, att förlita sig på den omgivande vävnaden för att skydda det implanterade materialet. För att förbättra egenskaperna hos den utvecklade vävnaden, är mekanisk stimulering en populär metod som används för att öka syntesen av brosk extracellulär matris liksom de resulterande mekaniska egenskaperna hos den manipulerade vävnaden. Mekanisk stimulering tillämpar krafter till vävnaden konstruerar analoga med dem upplevt in vivo. Dettaär baserad på antagandet att den mekaniska miljön, delvis reglerar utveckling och underhåll av nativ vävnad 1,2. Den mest allmänt vedertagen form av mekanisk stimulering i brosk vävnadsteknik är dynamisk kompression vid fysiologiska stammar av cirka 5-20% vid en frekvens av 1 Hz 1,3. Flera studier har undersökt effekterna av dynamisk kompression och har visat att det har en positiv effekt på kondrocyt metabolism och biosyntes i slutändan påverkar de funktionella egenskaperna hos den utvecklade vävnaden 4-8. I detta dokument visar vi metoden att mekaniskt stimulera kondrocyt-agaros hydrogel konstruktioner under dynamisk kompression och analysera förändringar i biosyntes genom biokemiska och radioisotoper analyser. Denna metod kan också lätt modifieras för att bedöma eventuella potentiellt inducerade förändringar i cellulär respons som ett resultat av mekaniska stimuli.
Protocol
1. Isolering av primära ledkondrocyter
Skörd 10-15 fulla skivor tjocklek brosk från artikulära ytorna av animaliska fogar (t.ex. metakarpala-falangala leden moget skelett kor erhållna från en lokal Abbatoir).
- Placera brosk segment i en 100 mm petriskål och inkubera i 20 ml 0,5% proteas i Hams F-12 (vikt / volym) under 2 h vid 37 ° C. Skölj tre gånger i Hams F-12 odlingsmedium och inkubera med 20 ml 0,15% kollagenas A i Hams F-12 odlingsmedium över natten vid 37 ° C.
- Filtrera cellsuspensionen genom en 200 mesh-filter in i en ren skål. Tvätta filtret med 5 ml Hams F-12 och lägga till skålen. Överför cellsuspensionen till en 50 ml koniskt rör. Tvätta petriskål med 10 ml Hams F-12 och lägga till det koniska röret.
- Centrifugera röret vid 600-800 ref för 6-8 minuter vid rumstemperatur.
- Aspirera supernatanten, säkerställer inte att störa the cellpellet och återsuspendera i 40 ml Hams F-12 odlingsmedier.
- Centrifugera röret vid 600-800 ref under 6-8 min.
- Upprepa steg 1,4 och 1,5 gånger mer för totalt 3 ggr. Före centrifugering för tredje gången, suspendera pelleten genom agitation och få en 500 ul alikvot för cellräkning.
- Räkna livskraftiga celler med användning av trypanblått exklusionsmetoden 9 med en hemacytometer och ett inverterat ljusmikroskop.
- Aspirera supernatanten och återsuspendera pelleten i en volym av Hams F-12 medium till dubbla den önskade såddtäthet (t.ex. 20 x 10 6 celler / ml för en slutkoncentration av 10 x 10 6 celler / ml efter inkapsling).
2. Kondrocyt-agaros Hydrogel Inkapsling
- Värme 0,8 g autoklaverad typ VII agaros i 20 ml steril 1 x PBS (pH 7,4) på en varm platta inställd på 120 ° C tills upplöst. När upplöst, sänk värmen till 60 ° C som högre temperaturer tilL påverka cellviabiliteten.
- I en 50 ml koniskt rör, grundligt blanda lika volymer av cellsuspensionen med dubbla den önskade koncentrationen av agaros (t.ex. 4% agaros suspension en slutlig 2% agaros hydrogel). Undvika att stora bubblor eftersom de kan påverka cellviabiliteten och konstruera utmattningslivslängden.
- Försiktigt alikvot 10 ml kondro-agaros blandningen i en 60 mm diameter petriskål, samtidigt som man undviker att skapa stora bubblor.
- Låt stå under 30 minuter vid rumstemperatur tills gelade.
- Få så många kondrocyt-agaros hydrogel prover som behövs (vanligtvis 20-30) med en 4 mm biopsistans.
- Mäta och registrera de fysiska dimensionerna (diameter och höjd) av representativa prover med användning av en mikrometer. Konstruktioner bör vara ca 5 mm hög, kassera alla prover som erhållits från en region där provet höjd varians var större än 2%.
- Överför proverna till en ny 60 mm petriskål och tilläggmed 10 ml komplett medium (t.ex. 20% fetalt bovint serum i Hams F-12 odlingsmedium med 20 mM HEPES, 100 ^ g / ml askorbinsyra och 2x antibiotika / antimykotika).
3. Mekanisk stimulering och Radiomärkning av kondrocyt-agaros hydrogeler
- Autoklavera de metalliska komponenterna i kompression riggen. Sterilisera plastkomponenterna med 70% etanol (över natten) och UV-ljus (under minst 15 minuter).
- För att hålla konstruktioner från att falla över, med pincett, plats 12 sterila plast låsringar (med en inre diameter som är större än den konstruktionen diametern) (n = 6, prover och kontroller) inom brunnarna i en 24-brunnars odlingsplatta.
- Använd pincett försiktigt överföra kondrocyt-agaros hydrogeler från petriskål till 24-brunnar, säkra var och en i en stoppring.
- Överför 400 pl komplett medium (t.ex. 20% FBS i Hams F-12 odlingsmedium med 20 mM HEPES, 100 pg / ml askorbinsyra, och2x antibiotika / antimykotika) till varje provbrunn.
- Montera steriliserade kompression riggen (figur 1) och säkra plattorna med låsskruvar. Fäst komprimering riggen till 24-brunnars odlingsplatta.
- Släpp och åter säkra ställskruvarna att etablera digelpressidan hydrogel kontakt (nolltöjning tillstånd).
- Fyll den monterade komprimering riggen i en Mach-1 mikromekaniska testsystem. Säker rigg till den vertikala steget via styrstift och lås på plats med ställskruv. Avlägsna avståndet jiggen.
- Applicera dynamisk tryckbelastning på önskad amplitud (t.ex. 10% belastning amplitud baserad på den ursprungliga höjden av proverna), frekvens (t.ex. 1 Hz) och varaktighet eller antal cykler (t.ex. tidsintervall upp till 60 minuter).
- Vid färdigställandet av mekanisk stimulering, byt avståndet jiggen, lossa lokalisera skruvstift set och ta bort komprimeringen riggen och kultur plattan från Mach-1 mikromekaniska testsystem. Radiomarkör cell-hydrogel konstruktioner genom att komplettera medierna med 5 pCi av önskad isotop (t.ex. [3 H]-prolin protein etikett för kondrocyt-specifika kollagensyntesen och [35 S]-svavel för proteoglykansyntes).
- Inkubera de radiomärkta konstruktioner för 24 timmar vid 37 ° C, CO 5% 2 10.
- Skörda de radiomärkta hydrogel konstruktionerna och skölj 3 gånger i 1 x PBS (pH 7,4) för att avlägsna eventuellt icke inkorporerat isotop. Smälta prover med papain (40 pg / ml i 20 mM ammoniumacetat, 1 mM ethyldiaminetetraacetic syra och 2 mM ditiotreitol vid 65 ° C under 72 timmar).
- Analys Digest för DNA-innehåll med hjälp av PicoGreen färgämnet analysen 11 och inkorporerad isotop aktivitet normaliseras till DNA-innehåll, genom β-vätskescintillationsräkning 12,13 omedelbart efter papaindigerering.
Obs: köp och omhändertagande av radioaktivt material (avfall isotoper och objektsom kan ha kommit i kontakt radioaktivt material) måste följa relevanta institutionella (och / eller statliga) Strategier och förfaranden för säker hantering och deponering av radioaktiva ämnen.
4. Representativa resultat
Bovina artikulära kondrocyt-agaros hydrogeler konstruktioner (2% agaros med 10 x 10 6 celler / ml inkapslade celler) mekaniskt stimulerades vid en amplitud av 10% tryckpåkänning vid en frekvens av 1 Hz under 20 till 60 min (eller 1.200 till 3.600 cykler ) och analyserades på DNA-innehåll och extracellulär matrix-syntes genom radioisotop inkorporering. DNA och extracellulär matris-syntes påverkades på ett dos-beroende sätt. DNA-halt uppvisade en signifikant 35%-ig minskning som ett resultat av 20 eller 30 minuter för stimulering (p <0,01), medan 60 min av stimulering uppvisade ingen effekt (figur 2). Brosk-specifik kollagen och proteoglykansyntes (bestäms av [3 H]-prolin och[35 S]-svavel inkorporering, respektive) uppvisade signifikanta ökningar av ungefär 60% som svar på 20 eller 30 minuter för stimulering (p <0,01), med 60 minuter för stimulering uppvisar ingen observerbar effekt (figur 3).
. Figur 1 Skiss över specialbyggd dynamisk komprimering rigg för att stimulera kondrocyt-agaros konstruktioner Vänster:. Monterade rigg Höger:. Sprängskiss visar enskilda komponenter.
Figur 2. Förändringar i DNA-innehåll av kondrocyt-agaros hydrogelema mekaniskt stimuleras under en 10% tryckpåkänning amplitud vid 1 Hz under 20 till 60 min (medelvärde ± SEM, n = 6/grupp).
Figur 3. Förändringar i extracellulär matris-syntes (kollagen och proteoglykaner) av kondrocyt-agaros hydrogelema mekaniskt stimulerade under 10% tryckpåkänning amplitud vid 1 Hz under 20 till 60 min (medelvärde ± SEM, n = 6/grupp).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den beskrivna metoden för att applicera kontrollerade mekaniska stimuli till cell-seedade agaros hydrogeler möjliggör direkt utredning om effekterna av dynamiska tryckkrafter på kondrocyt ämnesomsättning. Användningen av den specialanpassade provningsanordningens i samband med de kvarhållande ringarna som sidled hinder för konstruktionerna för att undvika eventuella problem med prov tipp. Användningen av dead-viktade lastning plattorna säkrade genom uppsättningar besättningar säkerställer direktkontakt med konstruktioner trots eventuella skillnader i prov höjd. Radiomärkning efter stimulering för att mäta cellulär biosyntes minskar risken för kontaminering, vilket möjliggör en enkel test rigg ska användas för flera tillämpningar av dynamiska mekaniska stimuli. Denna metod kan lätt anpassas för att undersöka effekten av olika mekanisk belastning lägen (t.ex. skjuv 1,4, spänning 1,2) eller att belysa specifika mechanotransduction vägar ansvarig.
ove_content "> De representativa resultat visade att en liten mängd av celldöd på cirka 35% kan uppstå på grund av tillämpningen av dynamisk stimulans, med längre tillämpningar av mekanisk stimulering inte påverkar konstruktionen cellularitet 15-17. Biosyntes av extracellulära matrix makromolekyler, bestäms av radioisotoper inkorporering, illustrerade en varaktighet beroende respons på dynamisk kompression. Tillämpningar av dynamisk tryckbelastning under en period av 20 till 30 minuter resulterade i en maximal anabol respons med längre löptider förekommer att framkalla en desensibilisering genomföra de påtvingade mekaniska stimuli. Cellulär desensibilisering mot mekanisk lastning har noterats tidigare 1,2,5,13, men det har varit mycket utredning karakterisering av tidsberoende natur detta fenomen. Denna information kan användas för att bestämma optimal stimulering villkoren för att maximera ackumulering av extracellulär matris med konstruera under upprepade eller långvariga, tillämpningar av mekanisk stimulering.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ham's F-12 | Thermo Fisher Scientific | SH3001002 | |
| Collagenase A | Sigma Aldrich Ltd. | C0130 | |
| Protease | Sigma Aldrich Ltd. | P5147 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich Ltd. | F1051 | |
| Ascorbate | Sigma Aldrich Ltd. | A4034 | |
| Antibiotics/antimycotics | Sigma Aldrich Ltd. | A5955 | |
| HEPES | Bioshop Canada Ltd. | HEP001 | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich Ltd. | 93595 | |
| Reichert Bright-Line Hemacytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
| Quant-iT PicoGreen | Invitrogen | P7589 | |
| Papain from papaya latex | Sigma Aldrich Ltd. | P3125 | |
| Ammonium Acetate | Sigma Aldrich Ltd. | A1542 | |
| Ethyldiaminetetraacetic Acid | Sigma Aldrich Ltd. | E9884 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma Aldrich Ltd. | 43819 | |
| Low Melting Point Agarose, Type VII | Sigma Aldrich Ltd. | A9045 | |
| Mesh Screen (200) Filter | Sigma Aldrich Ltd. | S4145 | |
| Mach-1 Micromechanical Tester | Biomomentum Inc. | V500cs | |
| Compression Loading Jig | Custom-built | Similar product could be supplied by Biomomentum Inc. | |
| Falcon 24 Well Culture Plate | Thermo Fisher Scientific | B353047 | |
| β-Liquid Scintillation Counter | Beckman Coulter | LS6500 | |
| [3H] Proline | Perkin-Elmer | NET323005MC | |
| [35S] Sulfur | Perkin-Elmer | NEX041005MC |
References
- Grodzinsky, A. J. Cartilage tissue remodeling in response to mechanical forces. Annual Review of Biomedical Engineering. 2, 691-713 (2000).
- Kuettner, K. E. Biochemistry of articular cartilage in health and disease. Clinical Biochemistry. 25, 155-163 (1992).
- Neu, C. P. The interface of functional biotribology and regenerative medicine in synovial joints. Tissue Engineering Part B: Reviews. 14, 235-247 (2008).
- Demarteau, O. Dynamic compression of cartilage constructs engineered from expanded human articular chondrocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 310, 580-588 (2003).
- Waldman, S. D. Long-term intermittent compressive stimulation improves the composition and mechanical properties of tissue-engineered cartilage. Tissue Engineering. 10, 1323-1331 (2004).
- Hunter, C. J. Dynamic compression of chondrocyte-seeded fibrin gels: effects on matrix accumulation and mechanical stiffness. Osteoarthritis and Cartilage. 12, 117-130 (2004).
- Buschmann, M. D. Mechanical compression modulates matrix biosynthesis in chondrocyte/agarose culture. Journal of Cell Science. 108 (Pt 4), 1497-1508 (1995).
- Quinn, T. M. Mechanical compression alters proteoglycan deposition and matrix deformation around individual cells in cartilage explants. Journal of Cell Science. 111 (Pt 5), 573-583 (1998).
- Kuettner, K. E. Synthesis of cartilage matrix by mammalian chondrocytes in vitro. I. Isolation, culture characteristics, and morphology. The Journal of Cell Biology. 93, 743-750 (1982).
- Lee, D. A. Mechanical loading of chondrocytes embedded in 3D constructs: in vitro methods for assessment of morphological and metabolic response to compressive strain. Methods in Molecular Medicine. 100, 307-324 (2004).
- McGowan, K. B. Biochemical quantification of DNA in human articular and septal cartilage using PicoGreen and Hoechst 33258. Osteoarthritis and Cartilage. 10, 580-587 (2002).
- Fan, J. C. Y. The effect of intermittent static biaxial tensile strains on tissue engineered cartilage. Annals of Biomedical Engineering. 38, 1672-1682 (2010).
- Kaupp, J. A. Mechanical vibrations increase the proliferation of articular chondrocytes in high-density culture. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine. 222, 695-703 (2008).
- Waldman, S. D. Long-term intermittent shear deformation improves the quality of cartilaginous tissue formed in vitro. Journal of Orthopaedic Research. 21, 590-596 (2003).
- Waldman, S. D. A single application of cyclic loading can accelerate matrix deposition and enhance the properties of tissue-engineered cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 14, 323-330 (2006).
- Kisiday, J. D. Effects of dynamic compressive loading on chondrocyte biosynthesis in self-assembling peptide scaffolds. Journal of Biomechanics. 37, 595-604 (2004).
- Chowdhury, T. T. Temporal regulation of chondrocyte metabolism in agarose constructs subjected to dynamic compression. Archives of Biochemistry and Biophysics. 417, 105-111 (2003).
