Summary
Cellules tumorales circulantes sont isolés du sang de patients atteints de cancer sans infliger des dommages cellulaires. Isolement des cellules tumorales est accomplie en utilisant une surface bimoléculaire de E-sélectine en plus d'anticorps contre des marqueurs épithéliales. Un revêtement de nanotubes de promouvoir spécifiquement l'adhésion cellulaire du cancer résultant en des puretés de capture élevés.
Abstract
Les cellules tumorales circulantes (CTC) sont des cellules qui diffusent à partir d'une tumeur primaire dans tout le système circulatoire et qui peuvent finir par former des tumeurs secondaires à des sites distants. CCT de comptage peut être utilisé pour suivre la progression des maladies basée sur la corrélation entre la concentration de la CCT dans le sang et 1 sévérité de la maladie. Comme un outil de traitement, la CCT pourraient être étudiées dans le laboratoire pour développer des thérapies personnalisées. À cette fin, l'isolement de la CCT doit pas causer de dommages cellulaires, et la contamination par d'autres types cellulaires, notamment les leucocytes, doit être évité autant que possible 2. La plupart des techniques actuelles, y compris la semelle approuvé par la FDA pour le dénombrement dispositif CTC, de détruire la CCT dans le cadre du processus d'isolement (pour plus d'informations, voir Réf. 2). Dispositif microfluidique pour capturer viables CCT est décrit, consistant en une surface fonctionnalisée avec la sélectine E en plus de la glycoprotéine d'anticorps contre des marqueurs 3 épithéliales. Pour améliorer la performance dispositifperformance d'un revêtement de nanoparticules a été appliqué consistant en nanotubes halloysite, une nanoparticule d'aluminosilicate récolté à partir d'argile 4. Les molécules E-sélectine fournir un moyen de capturer en mouvement rapide de la CCT qui sont pompés à travers le dispositif, donnant un avantage sur d'autres dispositifs microfluidiques dans lequel fois plus de temps de traitement sont nécessaires pour fournir des cellules cibles avec suffisamment de temps pour interagir avec une surface. Les anticorps dirigés contre des cibles épithéliales fournir CTC-spécificité de l'appareil, ainsi que de fournir un paramètre facilement réglable pour régler l'isolement. Enfin, le revêtement de nanotubes de halloysite permet d'isoler considérablement améliorée par rapport à d'autres techniques en les aidant à capturer rapidement les cellules en mouvement, en fournissant plus grande surface pour l'adsorption des protéines, et de repousser les leucocytes contaminants 3,4. Ce dispositif est réalisé par une technique simple en utilisant off-the-plateau matériaux, et a été utilisée avec succès pour capturer les cellules cancéreuses dans le sang du cancer métastatiquepatients atteints de cancer. Les cellules capturées sont maintenus jusqu'à 15 jours de culture après isolement, et ces échantillons se composent généralement de> 50% des cellules cancéreuses viables primaires de chaque patient. Ce dispositif a été utilisé pour capturer à la fois viable CCT sang total dilué et échantillons couche leuco-plaquettaire. En fin de compte, nous présentons une technique avec des fonctionnalités dans un environnement clinique pour développer des thérapies du cancer personnalisés.
Protocol
Le protocole suivant est pour la production d'un dispositif unique microtube.
1. Préparation de la solution de nanotubes halloysite
- Soniquer (10-13 W (RMS)) 250 uL solution de nanotubes halloysite (6,6% en poids dans l'eau) 30 sec. Solution refroidir à l'eau froide et sonication répéter une fois. Refroidissez à nouveau.
- Dessiner solution soniqué dans une seringue, fixer un filtre de 0,45 um seringue, et la solution du filtre dans microtube propre. Vortex la solution de temps en temps pour maintenir l'homogénéité.
2. Revêtement de surface microtube intérieur avec des nanotubes de halloysite
- Obtenir 50 cm longue section de Micro-Renathane microtubing (300 um de diamètre intérieur, 35,3 ul de volume interne). Couper une extrémité du microtube en diagonale et l'insérer dans une pièce IDEX petit adaptateur. Insérez l'aiguille d'une seringue 3/10 cc 29G dans l'autre extrémité du microtube.
- Pour nettoyer le microtube, placez l'extrémité ouverte du microtube (la finavec l'adaptateur) dans l'éthanol à 70% du tirage de l'éthanol à 50 ~ ul dans la seringue pour remplir microtube.
- Rincer l'éthanol sur le microtube en attirant un volume généreux de l'eau distillée dans la seringue.
- Détacher la seringue du microtube, vider la seringue, puis la rattacher à la microtube.
- Préparer une solution de 0,02% p / v de poly-L lysine dans l'eau. Dessiner 50 uL dans le microtube et laisser reposer pendant 5 min à température ambiante (RT).
- Dessiner une solution de 100 ul de nanotubes et filtré dans le microtube et laisser incuber pendant 3 min à température ambiante.
- Dessinez 100 pi d'eau à travers le microtube pour rincer la solution de nanotubes. Laisser microtube revêtu de s'asseoir, rempli d'eau, une nuit à TA.
3. Préparation de microtubes pour l'isolement cellulaire
- Préparer une solution de 10 ug / ml à la protéine G dans le phosphate de Dulbecco 1X une solution saline tamponnée (PBS, pH 7,0 - 7,2). Dessiner 50 ul de PBS par microtube puis dessinez 50 pi dela solution de protéine-G et laisser incuber pendant 1,5 heure à température ambiante.
- Préparer une solution contenant 5 ug / ml E-sélectine-IgG et 50 pg / ml d'anticorps (anti-EpCAM pour la plupart des échantillons de cancer, anti-PSMA pour les échantillons cancer de la prostate) dans du PBS. Dessiner 50 pi de l'E-sélectine et une solution d'anticorps dans le microtube et laisser incuber pendant 2 h à température ambiante.
- Non spécifique adhésion cellulaire est bloqué avec des protéines de lait de 5%. Préparer une solution de 5% (p / v) de protéine du lait dans du PBS. Dessiner une solution à 50 ul de protéines de lait dans le microtube et laisser incuber pendant 1 h à température ambiante.
- Dessiner 50 ul de PBS dans le tube et laisser à température ambiante avant que des échantillons de sang ou de buffy coat sont prêts pour le traitement.
- 10 min avant d'utiliser le microtube pour l'isolement, dessiner 50 ul de PBS qui a été saturé avec du Ca 2 + ("PBS +") pour activer les molécules de sélectine.
4. Préparation des échantillons pour l'isolement cellulaire
- Dessinez ou obtenir 10 mL de sang du patient dans héparinéTube.
- Placer 10 ml de Ficoll-Paque solution d'isolation de lymphocytes dans 50 ml tube de la centrifugeuse. Doucement couche sang 10 ml ensemble au-dessus de Ficoll manière à ne pas mélanger le sang et de Ficoll.
- Centrifuger à 2000x g pendant 15 min à 4 ° C avec une décélération minimale.
- Retirez la couche leuco-plaquettaire et le placer dans un nouveau tube.
- Laver avec du PBS couche leuco-plaquettaire (centrifugeuse à 230x g pendant 10 min, éliminer le surnageant).
- Resuspendre doucement les cellules avec 1 ml de tampon de lyse et incuber pendant 10 min à température ambiante pour lyser les érythrocytes.
- Ajouter 10 ml de PBS, mélanger doucement et centrifuger à 230x g pendant 10 min. Jeter le surnageant et doucement reprendre le culot dans 3 à 4 ml de PBS +.
5. Isolement cellulaire
- Fixez une extrémité du microtube fonctionnalisé à un seringue de 5 ml en utilisant des adaptateurs IDEX.
- Insérez la seringue sur une pompe à seringue.
- Plonger l'extrémité ouverte du microtube fonctionnalisé dans la cellule de suspension.
- Traiter la suspension cellulaire à travers le microtube de 1 à 4 ml / h.
- Transfert à l'extrémité ouverte du microtube dans un tube contenant du PBS + et d'en tirer 300 + pi de PBS dans la seringue de 0,016 ml / min pour éliminer les cellules non relié et faiblement liés du microtube.
- Placer l'extrémité ouverte du microtube dans un tube propre. Déconnecter la seringue du microtube et joindre une seringue pré-remplie avec Accutase. Doucement perfuser Accutase assez dans le microtube à remplir (~ 50 pi) et laisser incuber à température ambiante pendant 10 min.
- Fixer une seringue pré-remplie avec 1 ml de milieu de croissance (79% RPMI, SVF 20%, 1% de streptomycine à la pénicilline) et perfuser en microtube, la collecte des effluents dans la culture de tissus bien traités plaque.
- Des cellules en culture à 37 ° C et 5% de CO 2 dans des conditions humidifiés.
6. Les résultats représentatifs
Le but de cette technique consiste à isoler les cellules cancéreuses viables dans le sang de patients atteints de cancer. Plusieurs méthodes existent pour identifier les cellules cancéreuses en culture; une vérification nécessaire à la réussite appareil. Nous avons choisi pour colorer les cellules en culture avec des anticorps contre des fragments épithéliaux tels que EpCAM (molécule d'adhésion cellulaire épithéliale) ou PSMA (antigène prostatique membranaire spécifique), en plus de DAPI à identifier les noyaux des cellules intactes (Fig. 2 et 3). Le nombre de cellules cancéreuses capturé en utilisant la technique est nécessairement une fonction du nombre de CTC dans l'échantillon de départ, et à la variabilité du patient peut être élevé. Dans le traitement des échantillons prélevés sur des patients diagnostiqués avec le cancer de stade IV, nous avons l'habitude de capturer entre 100 et 500 cellules cancéreuses par tube de sang, à des puretés> 50%. Immédiatement après l'isolement, un plus grand nombre de leucocytes contaminants peuvent être présents. Toutefois, ces chiffres seront épuisées après une incubation dans un milieu de culture pour un maximum de 5 jours.
Figure 2. Données représentatives de l'isolement de la CCT à partir d'échantillons de sang prélevés à partir d'un patient atteint de cancer du sein et un patient du cancer du poumon. Le nombre de cellules viables positive identifiés comme CCT sur la base de la coloration EpCAM est représenté par des barres solides et se rapportent à l'ordonnée de gauche et le pourcentage de cellules qui ont été identifiées comme CCT par rapport au nombre total de cellules capturées est représenté par les barres d'ouverture et de mesurée sur la droite d'ordonnée. Les résultats sont, après cinq jours de culture. 
Micrographies représentatives Figure 3. Des bailleurs de fonds distincts (A et B) de la CCT dans la culture 5 jours à la suite de isolatisur un échantillon de sang patients atteints du cancer. Les cellules ont été colorées pour fluorescence EpCAM avec AlexaFluor 488 (vert) et 4 ',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pour visualiser le noyau (en bleu).
Discussion
Il est souvent le cas que les premières étapes de la découverte de nouvelles thérapies contre le cancer d'utiliser des lignées de cellules cancéreuses, ce qui ne ressemblent discutable de cellules cancéreuses primaires restent encore en cours d'utilisation en raison de leur facilité d'utilisation dans le laboratoire. La recherche sur le développement de nouveaux traitements du cancer serait accéléré si primaires des cellules cancéreuses humaines ont été utilisées dès le début dans la recherche roman. CCT sont le type le plus facilement accessible de la cellule cancéreuse, en raison de leur présence dans le sang et la facilité d'une prise de sang standard. En outre, les cellules tumorales circulantes représentent une étape nécessaire dans le processus de métastase 5,6, de sorte que leur pertinence pour la maladie et l'utilité pour le ciblage de nouveaux médicaments est clair. Isolement de la CCT à partir du sang in vitro est compliquée par leurs faibles concentrations: de l'ordre de un cas par million de leucocytes ou de l'un par milliard érythrocytes 7. La majorité des méthodes actuelles de détection de la CCT dans le sang, y compris la Cellule technique approuvé par la FDA ne Recherche (Veridex), endommager ou détruire les cellules dans le processus de détection, ce qui empêche l'utilisation au-delà de l'énumération. La méthode décrite ci-dessus ne compromet pas la viabilité cellulaire et ouvre ainsi la porte à la recherche clinique sur le cancer du futur. Comme la récupération des cellules intactes est le but de cette technique, il est impératif que les cellules être manipulés avec soin, en particulier lors des étapes de séparation du sang.
Il ya un certain nombre de paramètres ajustables dans ce système qui pourrait être modifié de façon à obtenir un rendement amélioré en fonction des caractéristiques essentielles telles que le type de cancer. Dans les étapes décrites ci-dessus, nous avions choisi d'utiliser EpCAM comme un anticorps spécifique de la CCT pour tous les types de cancer, sauf lorsque le traitement d'échantillons cancer de la prostate, dans lequel anti-PSMA a été utilisé. Substitutions supplémentaires de cancer des anticorps spécifiques peut certainement être utilisée pour améliorer les performances pour les patients individuels. En outre, les concentrations d'anticorps et de sélectine peuvent être modifiés pour améliorer la capture 8.
"> Une caractéristique essentielle du dispositif est l'incorporation de la E-sélectine molécules sur la surface. E-sélectine est normalement exprimé à la surface luminale des cellules endothéliales et la fonction de recruter des leucocytes mobiles rapides aux sites d'inflammation. Leucocytes Flowing lier transitoirement molécules de sélectine, résultant en un rythme plus lent, le comportement de roulement qui facilite la liaison plus lente et plus forte de la cellule à l'endothélium par les intégrines. convaincante des preuves expérimentales existe qui rend le cas où la CCT peut s'extravaser par un mécanisme similaire 9,10. L'inclusion de la sélectine aussi permet au dispositif de fonctionner à des débits supérieurs, des taux qui empêcherait, sinon, les cellules de se lier à des anticorps 11. Ainsi, notre dispositif imite physiologiquement une veinule de biomimetically capturer couler la CCT, sans infliger des lésions cellulaires.Amélioration de la performance du dispositif peut être attribuée à l'ajout du revêtement de nanotubes halloysite à la surface luminaledu dispositif. Des études antérieures ont montré qu'il ya trois principales composantes du revêtement de nanotubes de qui permet de fonctionnalités améliorées. Tout d'abord, le revêtement de nanotubes de fournit une plus grande surface, ce qui permet une plus grande pour le dépôt de protéines sur la surface 4. Deuxièmement, à effectuer la microscopie à force atomique sur le revêtement de nanotubes on a déterminé que les nanotubes individuels saillie sur la surface dans le flux. Cela permet molécules de sélectine qui sera présenté autant que l'ordre du micron au-dessus de la surface de sorte que les cellules peuvent être capturés et recruté à la surface plus tôt dans leur trajectoire à travers le tube 4. Enfin, le revêtement de nanotubes de halloysite est capable d'empêcher l'adhérence des leucocytes et la propagation à la surface, permettant une réduction du nombre de leucocytes capturés le long de la CCT et donc plus ultérieures puretés de la CCT 3.
Disclosures
MRK est un conseiller scientifique de CellTraffix, Inc (Rochester, NY).
Acknowledgments
Le travail décrit a été pris en charge par le Centre de Cornell sur le micro-environnement et métastases à travers U54CA143876 Nombre Prix du National Cancer Institute. Le contenu est exclusivement la responsabilité de leurs auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles de l'Institut national du cancer ou de la National Institutes of Health. Ce travail a été en outre financé en partie par la National Science Foundation Graduate Fellowship recherche (ADH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 300 um ID tubing | Braintree Scientific, Inc. | MRE025 | |
| Larger tubing for connection to syringe | IDEX Health Science | 1507L | |
| 5mL syringe for pump | BD Biosciences | 309603 | |
| Connector small to large tubing | IDEX Health Science | P-770 | |
| Connector large tubing to syringe | IDEX Health Science | F-120 and P-659 | |
| Syringe for microtube (3/10cc Insulin Syringe U-100 29G 1/2') | BD Biosciences | 309301 | |
| Accutase | MP Biomedicals LLC | 1000449 | |
| Ficol-Paque Plus | GE Healthcare Bio-Sciences AB | 17-1440-03 | |
| RBC Lysis Buffer (Buffer EL, 1000mL) | Qiagen | 1014614 | |
| Protein G, 5 mg | CalBiochem (calbiochem.com) | 539303 | |
| Human EpCAM/TROP-1 Antibody | R&D Systems | MAB960 | |
| PSMA Antibody (GCP-04) | Abcam | ab66911 | |
| 96 well plates (Microtest 96) | BD Biosciences | 35-3072 | |
| Blotting Grade Blocker Non-Fat Dry Milk, 300g | Bio-Rad | 216005508 | |
| Halloysite Nanotubes | NaturalNano | NN-HNT200 | |
| Calcium Carbonate, 5g | Aldrich Chemistry | 481807 | |
| rhE-Selectin/Fc Chimera, 100 ug | R&D Systems | 724-ES | |
| RPMI Medium 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 22400-089 | |
| DPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190-095 | |
| Poly-L lysine 0.1% w/v in water | Sigma-Aldrich | P8920-100ML | |
| Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | Model 100 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biochemicals | S11056H | |
| Penicillin Streptomycin | Sigma Life Siiences | P0781 |
References
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