Summary
בתאי הגידול במחזור מבודדים מהדם של חולי סרטן ללא גרימת נזק לתאים. בידוד של תאים סרטניים נעשה באמצעות משטח bimolecular של selectin-E בנוסף נוגדנים כנגד סמנים אפיתל. ציפוי Nanotube במיוחד מקדם תאים סרטניים וכתוצאה מכך הידבקות purities ללכוד גבוהה.
Abstract
בתאי הגידול במחזור (CTC) הם תאים מן הגידול המפיצים העיקרי בכל מערכת הדם וזה יכול בסופו של דבר יוצרים גידולים משניים באתרים מרוחקים. CTC ספירת ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר התקדמות המחלה בהתבסס על הקשר בין ריכוז CTC בדם חומרת המחלה 1. ככלי טיפולי, CTC יכול להיות למד במעבדה לפתח טיפולים מותאמים אישית. לשם כך, בידוד CTC גרם שום נזק לתאים, וזיהום על ידי סוגי תאים אחרים, במיוחד leukocytes, יש להימנע ככל האפשר 2. רבים טכניקות הנוכחי, לרבות מכשיר ה-FDA הבלעדי של ספירה CTC, להרוס CTC כחלק מתהליך הבידוד (למידע נוסף ראה Ref. 2). המכשיר microfluidic ללכוד CTC קיימא מתואר, המורכב משטח פונקציונליות עם גליקופרוטאין E-selectin בנוסף נוגדנים כנגד סמנים אפיתל 3. כדי לשפר את ביצועי המכשירmance ציפוי nanoparticle יושמה בהיקף של צינוריות halloysite, nanoparticle aluminosilicate שנקטפו מן החומר 4. את ה-selectin מולקולות לספק אמצעי ללכוד CTC זז מהר, כי הם נשאבים באמצעות המכשיר, השאלת יתרון על פני מכשירים microfluidic חלופיות שבו תהליך העיבוד של יותר נחוצים כדי לספק תאים היעד עם מספיק זמן כדי אינטראקציה עם פני השטח. את הנוגדנים ליעדים אפיתל לספק CTC-הספציפיות למכשיר, כמו גם לספק פרמטר מתכוונן בקלות לכוון בידוד. לבסוף, ציפוי Nanotube halloysite מאפשר בידוד משופר באופן משמעותי לעומת טכניקות אחרות של עוזר ללכוד תאים זז מהר, מתן שטח מוגברת של חלבון ספיחה, ולהדוף leukocytes מזהמים 3,4. מכשיר זה מיוצר על ידי טכניקה פשוטה באמצעות ה-off-המדף חומרים, שימש בהצלחה ללכוד תאים סרטניים מהדם של גרורתיחולי סרטן. התאים שנתפסו יישמרו לתקופה של עד 15 ימים בתרבות בעקבות הבידוד, ודגימות אלו בדרך כלל מורכב> תאים קיימא 50% סרטן ראשוני של כל מטופל. מכשיר זה נעשה שימוש כדי ללכוד CTC קיימא מהדם הן כל בדילול מלא דגימות באפי המעיל. בסופו של דבר, אנו מציגים טכניקה עם פונקציונליות בסביבה קלינית לפתח טיפולים בסרטן אישית.
Protocol
פרוטוקול הבאה היא לייצור מכשיר microtube אחת.
1. הכנת פתרון Nanotube Halloysite
- Sonicate (10-13 וואט (RMS)) 250 halloysite μL Nanotube פתרון (6.6% WT במים) 30 שניות. פתרון מגניב עם מים קרים sonication חוזרת פעם אחת. מצננים שוב.
- צייר פתרון sonicated לתוך מזרק, חבר 0.45 מזרק מסנן מיקרומטר, והפתרון המסנן לתוך צינור microfuge נקי. הפתרון וורטקס מדי פעם כדי לשמור על אחידות.
2. ציפוי של משטח Microtube פנימית עם צינורות halloysite
- קבל 50 ס"מ בחלק הארוך של microtubing מיקרו Renathane (300 מיקרומטר קוטר פנימי, 35.3 נפח פנימי μL). חותכים קצה אחד של microtube ב באלכסון ולהכניס לתוך חתיכת IDEX מתאם קטן. הכנס את המחט של המזרק 29G 3/10 סמ"ק אל הקצה השני של microtube.
- כדי לנקות את microtube, מקם את הקצה הפתוח של microtube (סוףעם מתאם) אתנול 70% ולצייר ~ 50 אתנול μL לתוך המזרק למלא microtube.
- שוטפים את אתנול מתוך microtube על ידי ציור נפח נדיב של מים מזוקקים לתוך המזרק.
- לנתק את המזרק מ microtube, לרוקן את המזרק, ואז לצרף את microtube.
- להכין תמיסה של 0.02% w / v פולי-L ליזין במים. צייר 50 μL אל microtube ולאפשר לשבת 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
- צייר 100 Nanotube μL פתרון הסתנן אל microtube ולאפשר כדי לדגור על 3 דק 'ב RT.
- צייר 100 מים μL דרך microtube לשטוף את הפתרון Nanotube. אפשר microtube מצופה לשבת, מלא מים, למשך הלילה בבית RT.
3. הכנת Microtubes על בידוד תא
- להכין תמיסה של 10 מיקרוגרם / מ"ל חלבון G ב פוספט 1X של Dulbecco בופר סליין (PBS, pH 7.0-7.2). צייר 50 PBS μL דרך microtube ואז לצייר 50 μL שלהפתרון חלבון G ולאפשר כדי לדגור על 1.5 שעות ב RT.
- להכין תמיסה המכילה 5 מיקרוגרם / מ"ל E-selectin-IgG ו - 50 מיקרוגרם / מ"ל נוגדנים (אנטי EpCAM עבור דגימות סרטן רוב, אנטי PSMA עבור דגימות סרטן הערמונית) ב PBS. צייר 50 μL של selectin-E פתרון נוגדנים לתוך microtube ולאפשר כדי לדגור על משאבי אנוש 2 ב RT.
- הידבקות הסלולר ספציפי חסום עם חלבון חלב 5%. הכן את הפתרון של 5% (w / v) חלבון חלב PBS. צייר 50 הפתרון μL חלבון החלב לתוך microtube ולאפשר כדי לדגור על שעות 1 ב RT.
- צייר 50 PBS μL לתוך הצינור ולהשאיר על RT עד דם או באפי דגימות המעיל מוכנים לעיבוד.
- 10 דקות לפני השימוש microtube לבידוד, צייר 50 PBS μL כי כבר רווי Ca 2 + ("PBS +") כדי להפעיל את מולקולות selectin.
4. הכנת דגימות לבידוד בתא
- צייר או להשיג 10 מ"ל דם מחולה לתוך heparinizedצינור.
- מקום 10 מ"ל Ficoll-Paque פתרון לימפוציטים הבידוד לתוך צינור 50 צנטריפוגות מ"ל. בעדינות 10 מ"ל שכבת הדם כולו על גבי Ficoll כדי לא לערבב את הדם Ficoll.
- צנטריפוגה ב 2000x גרם במשך 15 דקות על 4 מעלות צלזיוס עם האטה מינימלית.
- להסיר את שכבת מעיל באפי ומכניסים צינור חדש.
- לשטוף באפי מעיל עם PBS (צנטריפוגות ב 230x גרם דקות 10, לבטל את supernatant).
- בעדינות resuspend תאים עם חיץ 1 תמוגה RBC מ"ל ו דגירה של 10 דקות על RT כדי lyse אריתרוציטים.
- הוסף 10 מ"ל PBS, מערבבים בעדינות, צנטריפוגות ב 230x גרם ל 10 דקות. מחק supernatant בעדינות resuspend גלולה ב 3-4 מ"ל PBS +.
5. תא בידוד
- צרף קצה אחד של microtube פונקציונליות כדי מזרק 5 מ"ל באמצעות מתאמי IDEX.
- הכנס את המזרק לתוך משאבת מזרק.
- להטביע את הקצה הפתוח של microtube פונקציונליות לתוך התא suspension.
- תהליך ההשעיה התא דרך microtube ב 1-4 מ"ל / h.
- מעבירים את הקצה הפתוח של microtube כדי צינור המכיל PBS + ולצייר 300 μL + PBS לתוך המזרק על 0.016 מ"ל / דקה להסיר מאוגד ותאי המרופט מ microtube.
- מניחים את הקצה הפתוח של microtube לתוך צינור נקי. נתק את המזרק מ microtube ולצרף מזרק עם Accutase. בעדינות perfuse Accutase מספיק לתוך microtube למלא (~ 50 μL) ולאפשר כדי לדגור על RT במשך 10 דקות.
- צרף מזרק עם 1 מ"ל של התקשורת הצמיחה (79% RPMI, FBS 20%, 1% סטרפטומיצין פניצילין) ו perfuse אל microtube, איסוף שפכים לתוך התרבות רקמת יחס טוב צלחת.
- תאים תרבות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 בתנאים humidified.
6. נציג תוצאות
מטרת טכניקה זו היא לבודד את התאים הסרטניים קיימא מדם של חולי סרטן. קיימים מספר שיטות לזיהוי תאים סרטניים בתרבית, אימות הכרחי להצלחת המכשיר. בחרנו כתם התאים בתרבית עם נוגדנים נגד moieties אפיתל כמו EpCAM (הידבקות אפיתל מולקולה תאית) או PSMA (אנטיגן ספציפי לערמונית קרום), בנוסף DAPI לזהות גרעיני תאים שלמים (איור 2 ו 3). מספר תאים סרטניים שנתפסו באמצעות טכניקה זו היא בהכרח פונקציה של מספר CTCs במדגם ההתחלה וכי השונות המטופל יכול להיות גבוה. בעיבוד דגימות שנלקחו מהחולים שאובחנו עם סרטן בשלב IV, אנחנו באופן שגרתי ללכוד בין 100 ל 500 תאים סרטניים בכל צינור של דם, על purities> 50%. מיד לאחר הבידוד, מספר גדול יותר של כדוריות דם לבנות מזהמים יכולים להיות נוכחים. עם זאת המספרים הללו ייגמרו הדגירה הבאה במדיום התרבות של עד 5 ימים.
איור 2. נתונים מייצגים של בידוד CTC של דגימות דם נמשך מחולה סרטן השד חולת סרטן ריאות. מספר תאים קיימא המזוהים באופן חיובי כמו CTC מבוסס על מכתים EpCAM מיוצג על ידי מוטות מוצקים מתייחסים לתאם שמאל אחוז תאים שזוהו כמו CTC בהשוואה למספר הכולל של תאים שנכבשו מיוצג על ידי הברים פתוחים נמדד על לתאם הנכון. התוצאות לאחר חמישה ימים בתרבות. 
באיור 3. נציג micrographs מתורמים שונים (A ו-B) של CTC בתרבות 5 יום ממועד isolatiעל פי מדגם החולה בסרטן הדם. התאים היו מוכתמות fluorescently עם AlexaFluor 488 (ירוק) ו 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) עבור EpCAM לדמיין את הגרעין (כחול).
Discussion
זה שקורה לעתים קרובות כי השלבים המוקדמים של גילוי ותרופות לסרטן חדשים לנצל תאים סרטניים קווים, הנושאים דמיון בספק לתאי סרטן ראשוני עדיין להישאר להשתמש בשל קלות השימוש שלהם במעבדה. מחקר ופיתוח של טיפולים בסרטן חדשים יהיה לזרז אם העיקריים תאים סרטניים אנושיים נוצלו בתחילת המחקר רומן. CTC הם סוג ביותר ונגיש של תאים סרטניים, עקב נוכחותם בדם קלות בתיקו דם רגילה. בנוסף, בתאי הגידול במחזור מייצגים צעד הכרחי בתהליך של גרורות 5,6, ולכן הרלוונטיות שלהם המחלה השירות למיקוד תרופות חדשות הוא ברור. הבידוד של CTC מהדם במבחנה מסובך ידי ריכוזים נמוכים שלהם: בסדר גודל של 1 למיליון כדוריות דם לבנות או אחד למיליארד אריתרוציטים 7. רוב השיטות הקיימות לאיתור CTC בדם, כולל תא ה-FDA רק טכניקה חיפוש (Veridex), נזק או להרוס תאים בתהליך איתור, לא ניתן להשתמש מעבר ספירה. השיטה המתוארת לעיל לא להתפשר כדאיות התא ובכך פותח את הדלת עבור מחקרים קליניים בעתיד על סרטן. כמו התאוששות של תאים שלמים היא המטרה של טכניקה זו, זוהי חובתו של תאים להיות מטופלים בזהירות, במיוחד במהלך השלבים הפרדה דם.
ישנם מספר פרמטרים מתכונן במערכת זו, כי אפשר לשנות על מנת להשיג תשואה משופרת בהתאם מאפיינים קריטיים כגון סוג סרטן. בשלבים המתוארים לעיל, בחרנו להשתמש EpCAM כמו CTC נוגדנים ספציפיים עבור כל סוגי הסרטן, למעט בעת עיבוד דגימות סרטן הערמונית, שבה אנטי PSMA היה בשימוש. החלפות נוספים של סרטן ספציפיים נוגדנים בהחלט יכול לשמש כדי לשפר את הביצועים עבור חולים בודדים. יתר על כן, ריכוזים selectin ו הנוגדן ניתן לשנות על מנת לשפר ללכוד 8.
"> התכונה המהותית של המכשיר הוא שילוב של E-selectin מולקולות על פני השטח. E-selectin בא לידי ביטוי בדרך כלל על פני השטח של תאים luminal אנדותל ותפקוד לגייס leukocytes זז מהר לאתרים של דלקת. Leukocytes זורמים לאגד זמני ל מולקולות selectin, וכתוצאה מכך התנהגות, איטי יותר מתגלגל המאפשר מחייב איטי יותר וחזק יותר של תא האנדותל את ידי integrins. ראיה נסיונית משכנע קיים שעושה את המקרה כי CTC יכול extravasate ידי מנגנון דומה 9,10. הכללת selectin גם מאפשר למכשיר להיות מופעל ברמות ספיקה גדולות יותר, שיעורי שאחרת למנוע מתאי מלהתחבר נוגדנים 11. כך המכשיר שלנו פיזיולוגית מחקה ורדיד biomimetically כדי ללכוד זרימת CTC ללא גרימת פציעה הסלולר.ביצועי המכשיר משופרת ניתן לייחס תוספת של ציפוי Nanotube halloysite אל פני השטח luminalשל המכשיר. מחקרים קודמים הראו כי ישנם שלושה מרכיבים עיקריים של ציפוי Nanotube המאפשר פונקציונליות משופרת. ראשית, ציפוי Nanotube מספק שטח פנים גדל, המאפשר בתצהיר חלבון גדולה יותר על פני 4. שנית, בביצוע במיקרוסקופ כוח אטומי על ציפוי Nanotube שקבענו צינורות בודדים בולטים מעל פני השטח אל תוך הזרם. זה מאפשר מולקולות selectin שיוצג ככל 1 מיקרון מעל פני השטח, כך ניתן ללכוד תאים וגייס אל פני השטח בתחילת המסלול שלהם דרך צינור 4. לבסוף, ציפוי Nanotube halloysite הוא מסוגל למנוע הידבקות ליקוציט ומתפשטת על פני השטח, המאפשר מספר מופחת של כדוריות דם לבנות שנתפסו יחד עם CTC, ולכן יותר purities הבאים CTC 3.
Disclosures
Mrk הוא היועץ המדעי של CellTraffix, Inc (רוצ'סטר, ניו יורק).
Acknowledgments
העבודה המתוארת נתמך על ידי מרכז קורנל על Microenvironment & גרורה דרך מספר פרס U54CA143876 מן המוסד הלאומי לסרטן. התוכן הוא באחריות הבלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצגים את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי לסרטן או מכוני הבריאות הלאומיים. עבודה זו מומנה בנוסף ידי הקרן הלאומית למדע מלגת מחקר לתואר שני (ADH) בחלקו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 300 um ID tubing | Braintree Scientific, Inc. | MRE025 | |
| Larger tubing for connection to syringe | IDEX Health Science | 1507L | |
| 5mL syringe for pump | BD Biosciences | 309603 | |
| Connector small to large tubing | IDEX Health Science | P-770 | |
| Connector large tubing to syringe | IDEX Health Science | F-120 and P-659 | |
| Syringe for microtube (3/10cc Insulin Syringe U-100 29G 1/2') | BD Biosciences | 309301 | |
| Accutase | MP Biomedicals LLC | 1000449 | |
| Ficol-Paque Plus | GE Healthcare Bio-Sciences AB | 17-1440-03 | |
| RBC Lysis Buffer (Buffer EL, 1000mL) | Qiagen | 1014614 | |
| Protein G, 5 mg | CalBiochem (calbiochem.com) | 539303 | |
| Human EpCAM/TROP-1 Antibody | R&D Systems | MAB960 | |
| PSMA Antibody (GCP-04) | Abcam | ab66911 | |
| 96 well plates (Microtest 96) | BD Biosciences | 35-3072 | |
| Blotting Grade Blocker Non-Fat Dry Milk, 300g | Bio-Rad | 216005508 | |
| Halloysite Nanotubes | NaturalNano | NN-HNT200 | |
| Calcium Carbonate, 5g | Aldrich Chemistry | 481807 | |
| rhE-Selectin/Fc Chimera, 100 ug | R&D Systems | 724-ES | |
| RPMI Medium 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 22400-089 | |
| DPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190-095 | |
| Poly-L lysine 0.1% w/v in water | Sigma-Aldrich | P8920-100ML | |
| Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | Model 100 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biochemicals | S11056H | |
| Penicillin Streptomycin | Sigma Life Siiences | P0781 |
References
- Allard, W. J. Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases. Clin. Cancer Res. 10, 6897-6904 (2004).
- Hughes, A. D., King, M. R. Nanobiotechnology for the capture and manipulation of circulating tumor cells. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. , (2011).
- Hughes, A. D. Microtube Device for Selectin-Mediated Capture of Viable Circulating Tumor Cells from Blood. Clinical Chemistry. 58, 846-853 (2012).
- Hughes, A. D., King, M. R. Use of naturally occurring halloysite nanotubes for enhanced capture of flowing cells. Langmuir. 26, 12155-12164 (2010).
- Al-Mehdi, A. B. Intravascular origin of metastasis from the proliferation of endothelium-attached tumor cells: a new model for metastasis. Nat. Med. 6, 100-102 (2000).
- Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: Building a framework. Cell. 127, 679-695 (2006).
- Lee, D., King, M. R. Microcontact Printing of P-Selectin Increases the Rate of Neutrophil Recruitment Under Shear Flow. Biotechnology Progress. 24, 1052-1059 (2008).
- Gout, S., Tremblay, P. L., Huot, J. Selectins and selectin ligands in extravasation of cancer cells and organ selectivity of metastasis. Clin. Exp. Metastasis. 25, 335-344 (2008).
- Geng, Y., Marshall, J., King, M. Glycomechanics of the Metastatic Cascade: Tumor Cell-Endothelial Cell Interactions in the Circulation. Annals of Biomedical Engineering. , 1-16 Forthcoming.
- Stott, S. L. Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 18392-18397 (2010).
