Summary
Циркулирующих клеток опухоли, выделенных из крови больных раком, не причиняя повреждения клеток. Изоляция опухолевых клеток достигается с помощью бимолекулярной поверхности Е-селектина в дополнение к антителам против эпителиальных маркеров. Нанотрубок покрытие специально способствует адгезии раковых клеток приводит к высокой чистоты захвата.
Abstract
Циркулирующих опухолевых клеток (КТК) являются клетки, которые распространяют от первичной опухоли всей кровеносной системы, и это может в конечном счете образуют вторичные опухоли в отдаленных районах. CTC счетчик может быть использован для следить прогрессирования заболевания на основе корреляции между концентрацией СТС в крови и тяжести заболевания 1. В лечении инструмент, СТС могут быть изучены в лаборатории для разработки персонализированных терапии. Для этого CTC изоляции должно вызывать никаких повреждения клеток и загрязнения других типов клеток, особенно лейкоцитов, следует избегать как можно больше 2. Многие из современных методов, в том числе единственный FDA утвержденных устройство для перечисления КТК уничтожить ТХМ в качестве части процесса изоляции (для получения дополнительной информации см.. 2). Микрофлюидных устройство для захвата жизнеспособной КТК описано, состоящая из поверхности с функциональными E-селектина гликопротеинов в дополнение к антителам против эпителиальных маркеров 3. Для повышения устройство perforОсвоив наночастиц покрытие было применено, состоящий из галлуазит нанотрубок, наночастиц алюмосиликатных собраны из глины 4. E-селектина, молекул обеспечивают средства для съемки быстродвижущихся СТС, поступающим через устройство, предоставляя преимущество по сравнению с альтернативными устройствами микрофлюидных которых больше время обработки, необходимые для обеспечения клетки-мишени достаточно времени, чтобы взаимодействовать с поверхностью. Антитела к эпителиальным цели обеспечить СТС-специфичность к устройству, а также обеспечить легко регулируемый параметр для настройки изоляции. Наконец, галлуазит покрытия нанотрубок позволяет значительно улучшена изоляция сравнению с другими технологиями, помогая захвата быстро движущихся клеток, обеспечивая увеличенную площадь поверхности для адсорбции белка, и отталкивает загрязнения лейкоциты 3,4. Это устройство производится простой метод использования с готовых материалов, а также успешно использоваться для захвата раковые клетки из крови метастатическогобольных раком. Захваченные клетки сохраняются на срок до 15 дней в культуре после изоляции, и эти образцы обычно состоят из> 50% жизнеспособных первичных раковых клеток каждого пациента. Данное устройство используется для получения жизнеспособных СТС с обеих разбавленных цельной крови и образцы лейкомассы. В конце концов, мы представляем технику с функциями в клинических условиях для разработки персонализированных методов лечения рака.
Protocol
Следующий протокол для производства одного устройства микропробирок.
1. Подготовка галлуазит Решение нанотрубок
- Разрушать ультразвуком (10-13 Вт (RMS)) 250 мкл раствора нанотрубок галлуазит (6,6% вес в воде), 30 сек. Холодный раствор холодной водой и повторите обработку ультразвуком раз. Охладить снова.
- Нарисуйте ультразвуком раствор в шприц, приложите 0,45 мкм шприц фильтр и фильтр раствор в чистую пробирку и отцентрифугировать. Vortex решения иногда для поддержания однородности.
2. Покрытие микропробирку внутренней поверхности нанотрубки с галлуазит
- Получить длиной 50 см раздел Micro-Renathane microtubing (300 мкм, внутренним диаметром 35,3 мкл внутреннего объема). Отрежьте один конец микропробирки по диагонали и вставить небольшой кусочек адаптер IDEX. Вставьте иглу 3/10 см 29G шприца в другой конец микропробирок.
- Для очистки микропробирок, поместить в открытый конец микропробирок (конецс адаптером) в 70% этанола и ничья ~ 50 мкл этанола в шприц для заполнения микропробирок.
- Промойте этанола из микропробирок, опираясь щедрый объем дистиллированной воды в шприц.
- Отсоедините шприц от микропробирок, очистить шприц, а затем присоединить к микропробирок.
- Приготовьте раствор 0,02% в / о поли-L лизина в воде. Рисуем 50 мкл в микропробирок и позволяет сидеть в течение 5 мин при комнатной температуре (RT).
- Нарисуйте 100 мкл фильтруется нанотрубок решение в микропробирок и позволяет инкубировать в течение 3 мин при комнатной температуре.
- Нарисуйте 100 мкл воды через микропробирок для полоскания из нанотрубок решение. Позвольте покрытием микропробирку сидеть, наполненный водой, на ночь при комнатной температуре.
3. Подготовка пробирок для сотового изоляция
- Приготовьте раствор 10 мкг / мл белка G в фосфатных 1X Дульбеко буферным раствором (PBS, рН 7.0 - 7.2). Рисуем 50 мкл PBS через микропробирок, а затем сделать 50 мклбелок-G решение и позволяет инкубировать в течение 1,5 часа при комнатной температуре.
- Приготовьте раствор, содержащий 5 мкг / мл E-селектина-IgG и 50 мкг / мл антитела (анти-EpCam для большинства образцов рака, борьбы с ПСМА простаты образцов рака) в PBS. Рисуем 50 мкл E-селектина и раствор антител в микропробирок и позволяет инкубировать в течение 2 часов при комнатной температуре.
- Неспецифические клеточной адгезии блокируется с 5% молочного белка. Приготовьте раствор 5% (вес / объем) молочного белка в PBS. Рисуем 50 мкл раствора белка молока в микропробирок и позволяет инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре.
- Рисуем 50 мкл PBS в трубку и оставить при комнатной температуре до образцов крови или лейкомассы готовы к обработке.
- 10 минут перед использованием микропробирок для изоляции, привлечь 50 мкл PBS, который был насыщенным Ca 2 + ("PBS +"), чтобы активировать селектина молекул.
4. Подготовка проб для изолятор
- Нарисуйте или получить 10 мл крови пациента в гепаринизированнойтрубы.
- Место 10 мл Ficoll-лимфоцитов Paque решение изоляции в 50 мл трубы центрифуги. Осторожно слой 10 мл цельной крови на вершине Ficoll, чтобы не смешивать кровь и Ficoll.
- Центрифуга в 2000x г в течение 15 мин при 4 ° С с минимальным замедлением.
- Удалите слой лейкомассы и место в новой трубки.
- Wash лейкомассы с PBS (центрифуги в 230x г в течение 10 минут, удалите супернатант).
- Осторожно ресуспендирования клеток с 1 мл буфера для лизиса эритроцитов и инкубировать в течение 10 мин при комнатной температуре для лизиса эритроцитов.
- Добавить 10 мл PBS, аккуратно перемешать, а центрифуги в 230x г в течение 10 мин. Удалите супернатант и осторожно ресуспендируют осадок от 3 до 4 мл PBS +.
5. Сотовые изоляции
- Подключите один конец функциональными микропробирок в 5 мл шприц использованием IDEX адаптеров.
- Вставьте шприц на шприцевой насос.
- Погрузитесь в открытый конец функциональными микропробирок в клетку Suspensioл.
- Процесс клеточной суспензии через микропробирки от 1 до 4 мл / час.
- Передача открытого конца микропробирки в пробирку, содержащую PBS + и привлечь 300 мкл PBS + в шприц на 0,016 мл / мин для удаления несвязанных и слабо связаны с клетками микропробирок.
- Поместите открытый конец микропробирок в чистую пробирку. Отсоедините шприц от микропробирок и присоединить шприц заполнено с Accutase. Осторожно заливать достаточно Accutase в микропробирки для заполнения (~ 50 мкл) и позволяет инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин.
- Присоединить шприц заполнено с 1 мл питательной среды (79% RPMI, 20% FBS, 1% пенициллина стрептомицин) и заливать в микропробирки, сбор сточных вод в культуре ткани хорошо относились пластины.
- Культуры клеток при 37 ° С и 5% CO 2 при увлажненных условиях.
6. Представитель Результаты
Цель этого метода заключается в изоляции жизнеспособные раковые клетки из крови больных раком. Существует несколько методов для выявления раковых клеток в культуре, необходимые проверки устройств успеха. Мы выбрали для окрашивания клеток в культуре с антителами против эпителиальных остатков, таких как EpCam (эпителиальные сотовой молекулы адгезии) или ПСМА (простат специфический антиген мембраны), в дополнение к DAPI определить нетронутыми ядрах клеток (рис. 2 и 3). Число раковых клеток получены с помощью этой техники обязательно функцией количества ЦОК в стартовом образца, а пациент изменчивость может быть высокой. При обработке образцов, взятых у пациентов с диагнозом рак IV стадии, мы обычно захвата от 100 до 500 раковых клеток в трубке кровь, на чистоты> 50%. Сразу же после изоляции, большее количество загрязняющих лейкоцитов может присутствовать. Однако эти цифры будут исчерпаны после инкубации в питательной среде в течение 5 дней.
Рисунок 2. Представителю данные изоляции CTC из образцов крови взяты из пациентов рака молочной железы и рака легких пациента. Количество жизнеспособных клеток идентифицированы как СТС на основе окрашивания EpCam представлен твердой баров и относятся к левой оси ординат, а процент клеток, которые были определены как СТС по сравнению с общим числом захваченных клеток представлены открытые бары и измеренная на правом ординат. Результаты следующие пять дней в культуре. 
Рисунок 3. Представитель микрофотографии от отдельных доноров (А и Б) ТХМ в культуре 5 дней после isolatiна из крови больного раком. Клетки окрашивали флуоресцентно для EpCam с AlexaFluor 488 (зеленый) и 4 ',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) для визуализации ядра (синий).
Discussion
Это часто случается, что первые шаги в открытии нового терапии рака используют клеточные линии рака, которые несут сомнительные сходства с основной раковые клетки еще остаются в использовании за счет своей простоты использования в лаборатории. Исследования в области разработки новых методов лечения рака, будет ускорено, если первичные человеческие раковые клетки были использованы в начале нового исследования. КТК является наиболее легко доступных типов раковых клеток, в связи с их наличием в крови и удобство стандартного ничьей крови. Кроме того, циркулирующих опухолевых клеток представляют собой необходимый шаг в процессе метастазирования 5,6, так что их отношение к болезни и утилиты для ориентации новых лекарственных препаратов ясно. Выделение CTC из крови в пробирке осложняется низкой концентрацией: порядка одного на миллион лейкоцитов или один на миллиард эритроцитов 7. Большинство современных методов обнаружения КТК в крови, в том числе единственный FDA утвержденных техника Сотовые Поиск (Veridex), повреждения или уничтожения клеток в процессе обнаружения, исключающих использование за перечисление. Описанный выше метод не ставит под угрозу жизнеспособность клеток и таким образом открывает двери для будущих клинических исследований рака. Как восстановления целых клеток и является целью этой техники, важно, что клетки можно использовать с осторожностью, особенно во время шагов крови разделения.
Есть целый ряд настраиваемых параметров в этой системе, которые могут быть изменены, чтобы достичь повышения урожайности в зависимости от критических характеристик, таких как рак типа. В шаги, описанные выше, мы решили использовать в качестве EpCam СТС-специфических антител для всех типов рака исключением случаев, когда обработка образцов рака простаты, в котором анти-ПСМА был использован. Далее замены рака специфических антител, безусловно, может быть использована для повышения производительности для отдельных пациентов. Кроме того, селектина и концентрации антител может быть изменен для повышения захвата 8.
"> Существенной особенностью устройства является включение E-селектина, молекул на поверхности. E-селектина, как правило, выражается в просвете поверхности эндотелиальных клеток и функции набирать быстро движущихся лейкоцитов к участкам воспаления. Измельчитель лейкоциты связываются с временно селектина молекул, что приводит к более медленному, прокат поведения, что облегчает медленнее и сильнее связывание клетки эндотелия от интегринов. Убедительные экспериментальные доказательства того, что делает дело, что СТС может вытекать из сосудов в ткань такой же механизм 9,10. включение селектина также позволяет устройству работать при большей скорости потока, ставки, которые могли бы предотвратить клетки от связывания антител 11. Таким образом, наше устройство имитирует физиологически венулы в biomimetically захватить текущий СТС, не причинив повреждение клеток.Повышенная производительность устройств может быть связано с добавлением галлуазит покрытия нанотрубок на поверхности просветаприбора. Предыдущие исследования показали, что существует три основных компонента нанотрубки покрытие, которое обеспечивает улучшенную функциональность. Во-первых, нанотрубки покрытие обеспечивает повышенную площадь поверхности, что позволяет больше белка осаждения на поверхность 4. Во-вторых, при проведении атомно-силовой микроскопии на нанотрубку покрытия мы определили, что отдельные нанотрубки выступают с поверхности в потоке. Это позволяет селектина молекулы, которые будут представлены, насколько один микрон над поверхностью так, что клетки могут быть захвачены и работу на поверхность в начале их траектории через трубку 4. Наконец, галлуазит покрытия нанотрубки способны предотвратить адгезии лейкоцитов и распространения на поверхности, обеспечивая уменьшение количества лейкоцитов захвачен вместе с КТК и, следовательно, больше последующих чистоты CTC 3.
Disclosures
МРК является научным советником CellTraffix, Inc (Рочестер, штат Нью-Йорк).
Acknowledgments
Описываемая работа выполнена при финансовой поддержке Центра Корнелла в микроокружение и метастазы через премия Количество U54CA143876 из Национального института рака. Содержания несут их авторы и не обязательно отражает официальную точку зрения Национального института рака и Национальный институт здоровья. Эта работа была дополнительно частично финансируется Национальным научным фондом Высшей исследовательский грант (АДГ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 300 um ID tubing | Braintree Scientific, Inc. | MRE025 | |
| Larger tubing for connection to syringe | IDEX Health Science | 1507L | |
| 5mL syringe for pump | BD Biosciences | 309603 | |
| Connector small to large tubing | IDEX Health Science | P-770 | |
| Connector large tubing to syringe | IDEX Health Science | F-120 and P-659 | |
| Syringe for microtube (3/10cc Insulin Syringe U-100 29G 1/2') | BD Biosciences | 309301 | |
| Accutase | MP Biomedicals LLC | 1000449 | |
| Ficol-Paque Plus | GE Healthcare Bio-Sciences AB | 17-1440-03 | |
| RBC Lysis Buffer (Buffer EL, 1000mL) | Qiagen | 1014614 | |
| Protein G, 5 mg | CalBiochem (calbiochem.com) | 539303 | |
| Human EpCAM/TROP-1 Antibody | R&D Systems | MAB960 | |
| PSMA Antibody (GCP-04) | Abcam | ab66911 | |
| 96 well plates (Microtest 96) | BD Biosciences | 35-3072 | |
| Blotting Grade Blocker Non-Fat Dry Milk, 300g | Bio-Rad | 216005508 | |
| Halloysite Nanotubes | NaturalNano | NN-HNT200 | |
| Calcium Carbonate, 5g | Aldrich Chemistry | 481807 | |
| rhE-Selectin/Fc Chimera, 100 ug | R&D Systems | 724-ES | |
| RPMI Medium 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 22400-089 | |
| DPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190-095 | |
| Poly-L lysine 0.1% w/v in water | Sigma-Aldrich | P8920-100ML | |
| Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | Model 100 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biochemicals | S11056H | |
| Penicillin Streptomycin | Sigma Life Siiences | P0781 |
References
- Allard, W. J. Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases. Clin. Cancer Res. 10, 6897-6904 (2004).
- Hughes, A. D., King, M. R. Nanobiotechnology for the capture and manipulation of circulating tumor cells. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. , (2011).
- Hughes, A. D. Microtube Device for Selectin-Mediated Capture of Viable Circulating Tumor Cells from Blood. Clinical Chemistry. 58, 846-853 (2012).
- Hughes, A. D., King, M. R. Use of naturally occurring halloysite nanotubes for enhanced capture of flowing cells. Langmuir. 26, 12155-12164 (2010).
- Al-Mehdi, A. B. Intravascular origin of metastasis from the proliferation of endothelium-attached tumor cells: a new model for metastasis. Nat. Med. 6, 100-102 (2000).
- Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: Building a framework. Cell. 127, 679-695 (2006).
- Lee, D., King, M. R. Microcontact Printing of P-Selectin Increases the Rate of Neutrophil Recruitment Under Shear Flow. Biotechnology Progress. 24, 1052-1059 (2008).
- Gout, S., Tremblay, P. L., Huot, J. Selectins and selectin ligands in extravasation of cancer cells and organ selectivity of metastasis. Clin. Exp. Metastasis. 25, 335-344 (2008).
- Geng, Y., Marshall, J., King, M. Glycomechanics of the Metastatic Cascade: Tumor Cell-Endothelial Cell Interactions in the Circulation. Annals of Biomedical Engineering. , 1-16 Forthcoming.
- Stott, S. L. Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 18392-18397 (2010).
