Recent ontwikkelde beeldvormende technieken met behulp van nabij-infrarood fluorescentie (NIRF) kan helpen verduidelijken van de rol het lymfestelsel speelt in kanker metastase, immuunrespons, wondheling, en andere lymfatische-geassocieerde ziekten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Niet-invasieve optische beeldvorming van de lymfatische vasculatuur van een muis
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het lymfatische vasculaire systeem is een belangrijk onderdeel van de bloedsomloop dat vloeistof homeostase handhaaft, biedt immune surveillance en bemiddelt vetopname in de darm. Ondanks deze kritische functie, is er betrekkelijk weinig begrip van hoe het lymfatisch systeem past zich aan dienen deze functies in gezondheid en ziekte 1. Onlangs hebben we aangetoond over het vermogen om dynamisch beeld lymfatische architectuur en de lymfe "pompen" actie in normale proefpersonen en bij personen die lijden lymfatische dysfunctie met trace toediening van een nabij-infrarood fluorescerende (NIRF) kleurstof en een aangepaste, Gen III- geïntensiveerd beeldvormingssysteem 2-4. NIRF beeldvorming dramatische veranderingen in lymfatische architectuur en functie toonde met menselijke ziekte. Het blijft onduidelijk hoe deze veranderingen en nieuwe diermodellen zijn ontwikkeld voor de genetische en moleculaire basis te helderen. In dit protocol, presenteren we NIRF lymfatische, small dier imaging 5,6 met indocyanine groen (ICG), een kleurstof die gebruikt 50 jaar bij mensen 7 en een NIRF kleurstof gelabelde cyclische albumine bindend domein (Abd-IRDye800) peptide dat bij voorkeur bindt muis en humaan albumine 8 . Ongeveer 5,5 keer helderder dan ICG, 'Abd-IRDye800 heeft een soortgelijke lymfatische speling profiel en kan worden geïnjecteerd in kleinere doseringen dan ICG om voldoende NIRF signalen te bereiken voor de beeldvorming 8. Omdat beide Abd-IRDye800 en ICG binden aan albumine in de interstitiële ruimte 8, die beide kunnen actief eiwit transport naar en tonen in de lymfevaten. Intradermale (ID) injectie (5-50 ul) van ICG (645 uM) of Abd-IRDye800 (200 uM) in zoutoplossing worden toegediend aan het dorsale aspect van elke achterpoot en / of de linker en rechter zijde van de basis van de staart van een isofluraan-verdoofde muis. De verkregen kleurstof concentratie in het dier 83-1,250 ug / kg voor ICG of 113-1,700 ug / kg voor'Abd-IRDye800. Onmiddellijk na injecties wordt lymfatische functionele beeldvorming uitgevoerd tot 1 uur met een aangepaste, klein dier NIRF beeldvormingssysteem. Hele dier ruimtelijke resolutie kan afbeelden fluorescent lymfevaten van 100 micrometer of minder, en beelden van structuren tot 3 cm in diepte worden verkregen 9. De beelden werden met behulp van V + + software en geanalyseerd met behulp van ImageJ of MATLAB software. Tijdens de analyse worden opeenvolgende gebieden die van belang (ROI) omvat het gehele vaartuig diameter getrokken langs een bepaalde lymfevat. De afmetingen voor elke ROI constant worden gehouden voor een bepaald vaartuig en NIRF intensiteit wordt gemeten voor elke ROI voor een kwantitatieve beoordeling "pakketten" van lymfe bewegen door schepen.
Protocol
Alle dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de normen van de Universiteit van Texas Health Science Center (Houston, TX), Vakgroep Vergelijkende Geneeskunde en Centrum voor Moleculaire Beeldvorming na nazicht en goedkeuring van het protocol door de respectieve institutionele Animal Care en gebruik Comite (IACUC) of Animal Welfare Committee (AWC).
1. Voorbereiding van de dieren 24 Hr Voorafgaand aan Imaging
De stappen moeten worden uitgevoerd (indien nodig) de dag voor lymfatische beeldvorming plaatsvindt.
- Plaats dier in een inductie doos en verdoven met isofluraan.
- Zodra het dier is in een staat van diepe anesthesie (bewaakt met teen-snuifje manoeuvre), plaats verdoofd dier op een luier / pluis pad en positie neus in een neuskegel verbonden met isofluraan gas.
- Clip alle haar / bont (indien aanwezig) in de omgeving af te beelden.
- Breng ontharingsmiddel (NAIR) om het uitgeknipte gebied en laat het on de huid tot 3 minuten.
- Veeg korting op alle ontharingsmiddel met warme, vochtige gaas of papieren handdoek.
- Spoel de huid met warm water en voorzichtig drogen de ruimte met een gaasje of papieren handdoek.
- Toestaan dat dieren om te herstellen op een verwarmingselement of onder een warmtelamp, en hun kooi terug te keren.
2. Dag van de Imaging
- Reconstitueren imaging agent met steriel water, vervolgens verdund met steriele normale (0,85%) zoutoplossing tot 645 uM (5 ug/10 pi) bereiken voor ICG of 200 uM (6.8 ug/10 pi) voor Abd-IRDye800. Een oplossing in donker voorwaarden en het gebruik binnen 6 uur na reconstitutie.
- Plaats dier in een inductie doos en verdoven met isofluraan.
- Zodra het dier in een toestand van diepe anesthesie (gecontroleerd toe-pinch figuur), place verdoofde dier op zijn kant op een luier / pluizen pad en positie neus in een neuskegel verbonden gas isofluraan.
- Doe de lichten uit (dus de ruimte isdonker). Indien nodig, kan een klein bureau halogeenlicht worden gebruikt voor een kleine hoeveelheid licht om injecties te zien.
- Met een insulinespuit met een 31-gauge naald geïnjecteerd ID 5 pi tot 50 pi ICG of Abd-IRDye800 in het dorsale aspect van elke achterpoot en / of links en rechts van de basis van de staart, afhankelijk het gebied van belang (zie Discussie). Elke geïnjecteerde dosis kan variëren 0.083-+1.25 mg / kg (ICG) of ,113-+1.7 mg / kg (Abd-IRDye800). Injectie volumes zal variëren met dierlijke stam en de plaats van injectie. Voor athymische muizen, kan het volume van injectie 5 ui (achterpoot) of 10 ul (staartaanzet). Wanneer het dier zich niet in het beeldvormingssysteem injectieplaats (s) onmiddellijk het dier onder het beeldvormingssysteem na injectie (s).
- Als er geen kleurstof opname wordt gezien in de lymfevaten wordt in stap 2.5 moeten worden herhaald worden per dier protocol.
- Zodra lymfevaten worden gezien, de injectieplaats bedekken met zwarte isolatietape of zwart paper.
- Verwerven lymfatische beelden tot 1 uur met V + + software en een klein dier, NIRF beeldvormingssysteem. (Dieren worden verdoofd met isofluraan en ademhaling worden bewaakt terwijl de beelden zijn het verwerven van.) Terwijl klein dier, NIRF imagers zijn commercieel verkrijgbaar, maken we gebruik van een op maat gemaakte, klein dier NIRF imaging systeem dat bestaat uit een 785-nm laser diode (1005-9mm-78503 , Intense, North Brunswick, NJ) uitgerust met een asferische lens (C24TME-B, Thorlabs, Newton, NJ), diffuser (ED1-C20, Thorlabs) en filter (LD01-785/10-25, Semrock, Rochester, NY ) een uniforme excitatie veld dat het dier verlicht op een incident fluentie van minder dan 1,4 mW per vierkante centimeter 10 maken. Een elektron vermenigvuldigen charged-coupled device (EMCCD, PhotonMax512, Princeton Instruments, Trenton, NJ) camera systeem met twee 830-nm filters (AND11333, Andover Corp, Salem, NH) en een 28-mm Nikkor-objectief (1992, Nikon, Melville, NY) wordt gebruikt om lymfatische opnamen met integratie times van 200 msec voor dynamische beeldvorming en 800 msec voor statische imaging 5. Zie figuur 1 voor de systeemconfiguratie, de tabel voor meer informatie over elk onderdeel, en de discussie voor een korte bespreking van de belangrijkste imager eigenschappen.
- Toestaan dat dieren om te herstellen op een verwarmingselement of onder een warmtelamp en hun kooi terug te keren, of euthanaseren.
- Analyseer beelden met behulp van ImageJ of MATLAB software. Zie afbeelding 6.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Voorbeeld van NIRF Lymfatische Imaging in Muizen
Wanneer ICG of Abd-IRDye800 wordt ID geïnjecteerd aan de basis van de staart van een normale muis, moet de lymfatische vasculatuur tussen de injectieplaats aan de basis van de staart en de inguinale lymfeklier (LN) onmiddellijk zichtbaar. Kort na injectie (enkele seconden tot minuten) moet het lymfevat tussen de lies en de axillaire LN LN worden gevisualiseerd zoals weergegeven in figuur 2. Aangezien de lymfevaten in muizen varië...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
We maken gebruik van een aangepaste, kleine dieren NIRF imaging systeem om beelden van het label lymfevaten in muizen te vangen. Om films van lymfe beweging te construeren, zijn 300 of meer beelden verzameld. Voor functionele analyse van lymfevaten uit films, worden twee of meer ROI's handmatig worden getekend langs een lymfevat. De afmetingen van het ROI worden constant gehouden voor elk vaartuig en ongeveer de diameter van het vat. Terwijl hele dier ruimtelijke resolutie kan afbeelden fluorescent lymfevaten van 10...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Auteurs hebben niets openbaar te maken, maar sommige auteurs worden vermeld op een octrooi.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de volgende subsidies aan Eva Sevick: NIH R01 CA128919 en NIH R01 HL092923.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Oplossingen en reagentia, en apparatuur | Vennootschap | Catalogusnummer | Reacties |
| Indocyaninegroen (ICG) | Patheon Italia SPA | NDC 25431-424-02 | Reconstitueren tot 645 uM (5 ug/10 pi) |
| Cyclische Albumine Binding Domain ('Abd) | Bachem | Gewoonte | Reconstitueren tot 200 urn (6,8 ug/10 pi) |
| IRDye800 | Li-COR | IRDye 800CW | Reconstrueren volgens de instructies van vervaardiging; geconjugeerd aan Abd op equilmolar concentraties |
| Steriel Water | Hospira, Inc, Lake Forest, IL | NDC 0409-4887-10 | |
| NAIR | Church & Dwight Co,Inc | Lokale winkels | www.nairlikeneverbefore.com |
| Imaging System (componenten onder) | Center for Molecular Imaging | N / A | Op maat gebouwd in onze laboratoria. |
| Electron-vermenigvuldigende charge-coupled device (EMCCD) camera | Princeton Instruments, Trenton, NJ | Photon Max 512 | |
| Nikon camera lens | Nikon Inc, Melville, NY | Model No 1992, Nikkor 28mm | |
| Optische filter | Andover Corp, Salem, NH | ANDV11333 | Twee 830.0/10.0 nm banddoorlaatfilters worden gebruikt voor de lens |
| 785-nm laserdiode | Intense Ltd, North Brunswick, NJ | 1005-9MM-78503 | 500 mW optische uitgang |
| Optieksysteem | Thorlabs, Newton, NJ | C240TME-B | Collimeert laservermogen voorafgaand aan de cleanup filter |
| Clean-up filter | Semrock, Inc, Rochester, NY | LD01-785/10-25 | Verwijdert laseremissie in fluorescentie-band |
| Optische diffuser | Thorlabs, Newton, NJ | ED1-C20 | Verspreidt de laser over het dier |
| V + + | Digital Optics, Browns Bay, Auckland, Nieuw-Zeeland | Versie 5.0 | Software die wordt gebruikt om de camera systeem te bedienen en beelden op te slaan op de computer. http://digitaloptics.net/ |
| Analytische Software Een van de volgende softwarepakketten kan worden gebruikt voor beeldanalyse | |||
| ImageJ | Nationaal Instituuttuten van Volksgezondheid, Bethesda, MD | Nieuwste beschikbare versie | Gratis programmatuur beschikbaar op http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
| MATLAB | MathWorks, Natick, MA | Versie 2008a of later | http://www.mathworks.com/ |
Referenties
- Alitalo, K. The lymphatic vasculature in disease. Nat. Med. 17, 1371-1380 (2011).
- Rasmussen, J. C., Tan, I. C., Marshall, M. V., Fife, C. E., Sevick-Muraca, E. M. Lymphatic imaging in humans with near-infrared fluorescence. Curr. Opin. Biotechnol. 20, 74-82 (2009).
- Rasmussen, J. C., et al. Human Lymphatic Architecture and Dynamic Transport Imaged Using Near-infrared Fluorescence. Transl. Oncol. 3, 362-372 (2010).
- Sevick-Muraca, E. M. Translation of near-infrared fluorescence imaging technologies: emerging clinical applications. Annu. Rev. Med. 63, 217-231 (2012).
- Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Noninvasive quantitative imaging of lymph function in mice. Lymphat. Res. Biol. 5, 219-231 (2007).
- Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Mouse phenotyping with near-infrared fluorescence lymphatic imaging. Biomed Opt Express. 2, 1403-1411 (2011).
- Marshall, M. V., et al. Near-infrared fluorescence imaging in humans with indocyanine green: a review and update. The Open Surgical Oncology Journal. 2, 12-25 (2010).
- Davies-Venn, C. A., et al. Albumin-Binding Domain Conjugate for Near-Infrared Fluorescence Lymphatic Imaging. Mol. Imaging Biol. , (2011).
- Sharma, R. Quantitative imaging of lymph function. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 292, 3109-3118 (2007).
- Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Functional lymphatic imaging in tumor-bearing mice. J. Immunol. Methods. 360, 167-172 (2010).
- Karlsen, T. V., McCormack, E., Mujic, M., Tenstad, O., Wiig, H. Minimally invasive quantification of lymph flow in mice and rats by imaging depot clearance of near-infrared albumin. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 391-401 (2012).
- Zhou, Q., Wood, R., Schwarz, E. M., Wang, Y. J., Xing, L. Near-infrared lymphatic imaging demonstrates the dynamics of lymph flow and lymphangiogenesis during the acute versus chronic phases of arthritis in mice. Arthritis Rheum. 62, 1881-1889 (2010).
- Adams, K. E., et al. Direct evidence of lymphatic function improvement after advanced pneumatic compression device treatment of lymphedema. Biomed. Opt. Express. 1, 114-125 (2010).
- Tan, I. C., et al. Assessment of lymphatic contractile function after manual lymphatic drainage using near-infrared fluorescence imaging. Arch. Phys. Med. Rehabil. 92, 756-764 (2011).
- Lapinski, P. E., et al. RASA1 maintains the lymphatic vasculature in a quiescent functional state in mice. J. Clin. Invest. 122, 733-747 (2012).
- Maus, E. A., et al. Near-infrared fluorescence imaging of lymphatics in head and neck lymphedema. Head Neck. 34, 448-453 (2012).
- Galanzha, E. I., Tuchin, V. V., Zharov, V. P. Advances in small animal mesentery models for in vivo flow cytometry, dynamic microscopy, and drug screening. World J. Gastroenterol. 13, 192-218 (2007).
- Schramm, R., et al. The cervical lymph node preparation: a novel approach to study lymphocyte homing by intravital microscopy. Inflammation research : official journal of the European Histamine Research Society. 55, 160-167 (2006).
- Hall, M. A., et al. Imaging prostate cancer lymph node metastases with a multimodality contrast agent. Prostate. 72, 129-146 (2012).
- Zhu, B., Sevick-Muraca, E. M. Minimizing excitation leakage and maximizing measurement sensitivity for molecular imaging with near-infrared fluorescence. J. Innovat. Opt. Health Sci. 4, 301-307 (2011).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
Meer artikelen verkennen
Nabij-infrarood fluorescentie-imagingimaging van de lymfevateninjectie van indocyaninegroencyclisch albumine-bindend domeinNIRF-imaging van kleine dierenintradermale toediening van kleurstofvisualisatie van lymfevatenanalyse van fluorescentie-intensiteittracking van regio's van belanglymfatische voortstuwingssnelheid
