Rastreamento de celular utilizando proteínas Photoconvertible Durante o Desenvolvimento Zebrafish

Resumo

Aqui, apresentamos um método para a comutação fotoativada de proteínas fluorescentes fotoconvertíveis (PCFPs) em embriões vivos de peixe-zebra e o rastreamento posterior da proteína fotoconvertida em pontos temporais específicos durante o desenvolvimento. Esta metodologia permite o monitoramento de eventos de biologia celular subjacentes a diferentes processos de desenvolvimento em um organismo vertebrado vivo.

Resumo

A embriogênese é um processo dinâmico que é melhor estudado por meio de técnicas que permitem a documentação de mudanças no desenvolvimento in vivo. O uso de proteínas fluorescentes codificadas geneticamente tem se mostrado uma estratégia valiosa para elucidar processos morfogenéticos dinâmicos conforme ocorrem no organismo intacto. Na última década, o desenvolvimento de proteínas fluorescentes fotoativáveis e fotoconvertíveis abriu a possibilidade de investigar o destino de subpopulações discretas de proteínas marcadas¹. Diferentemente das proteínas fotoativáveis, as proteínas fluorescentes fotoconvertíveis (PCFPs) podem ser facilmente rastreadas e imagiadas em seu estado de emissão nativo antes da fotoconversão, facilitando a identificação e seleção de regiões por inspeção óptica. As PCFPs, como Kaede², KikGR³, Dendra⁴ e EosFP⁵, podem mudar de verde para vermelho após exposição à luz UV ou azul, devido a uma sequência tríplice His-Tyr-Gly que forma um cromóforo verde, o qual pode ser fotoconvertido em um vermelho por meio de uma β-eliminação catalisada por luz e subsequente extensão de um sistema π-conjugado³. As PCFPs e suas variantes monoméricas são ferramentas úteis para rastrear células^6-10 e estudar a dinâmica de proteínas^11-14, respectivamente. Nos últimos anos, as PCFPs têm sido expressas em diferentes modelos animais, como peixe-zebra⁶, galinha^7,8 e camundongo^9,10, para o rastreamento do destino celular. Aqui relatamos um protocolo para fotoconversão específica de células com PCFPs no embrião vivo de peixe-zebra e posterior rastreamento das proteínas fotoconvertidas em estágios mais avançados do desenvolvimento. Essa metodologia permite estudar, de maneira específica a tecidos, eventos de biologia celular subjacentes à morfogênese no modelo animal peixe-zebra.

Protocolo

1. Obtenção de Embriões para o Ensaio de Fotoconversão

Após o cruzamento intra-linhas de peixes-zebra transgênicos que expressam um PCFP, os embriões homozigotos mais brilhantes são selecionados e criados a 28,5 °C até o estágio embrionário desejado¹⁵.

Observação 1: Esta pré-seleção permitirá a varredura de embriões com baixa potência de laser, evitando assim fototoxicidade e fotobranqueamento.

Observação 2: Sugerimos utilizar luz de baixa intensidade ao visualizar embriões e mantê-los em condições de escuridão devido à alta sensibilidade das PCFPs, como Kaede e KikGR, à expos....

Discussão

Nos últimos anos, foram gerados modelos animais transgênicos para a expressão de proteínas fotocovertíveis, como Kaede ou KikGR. Esses animais se desenvolvem normalmente, indicando que essas proteínas não possuem efeitos tóxicos sobre o desenvolvimento embrionário. O primeiro relato sobre um ensaio de fotconversão para rastreamento celular em embriões animais foi realizado por Hatta e colaboradores, mediante injeção de mRNA ou DNA codificando Kaede em embriões de peixe-zebra de um único blastômero para expressão ubíqua, .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Materiais:
Equipamento necessário para criar peixes e coletar ovos (consulte o Zebrafish Book22 para obter detalhes).
Microsscópio estereoscópico	Leica	Leica MZ6 Microsscópio Estereoscópico	Equipado com laser operando em 488 nm
Microsscópio confocal de varredura a laser	Zeiss	Zeiss LSM 710 NLO	equipado com lasers operando em 488 nm, 561 nm e 405 nm
Bloco de aquecimento
Par de pinças Dumont #5
Placa de cultura com fundo de lamínula	MatTek Corp		Ashland MA EUA
Pontas de pipeta Microloader	Eppendorf
Vórtex
agulhas
Reagentes:
Meio de água para ovos
60 μg/ml de Sais Marinhos Instant Ocean em ddH2O
Meio E3
5 mM NaCl
0,17 mM KCl
0,33 mM CaCl2
0,33 mM MgSO4
0,00001% (p/v) Azul de Metileno
Solução estoque de Tricaina 4 mg/ml
400 mg de Tricaina (éster etílico do ácido 3-amino benzóico)	Sigma-Aldrich
97,9 ml de ddH2O
2,1 ml de Tris 1M (pH 9)
Ajustar para pH 7, fracionar e armazenar a -20 °C
1% LMA (agarose de baixa temperatura de fusão, Lonza)
1 g de LMA/100 ml de meio E3 1X
Fracionar e armazenar a 4 °C