Summary
ووصف طريقة لعزل الحويصلات submitochondrial المخصب في F1FO ATP مجمعات سينسيز من دماغ الفئران. هذه الحويصلات تسمح دراسة النشاط من مجمع أتباز F1FO والتشكيل وذلك باستخدام أسلوب التصحيح تسجيل المشبك.
Abstract
وتشارك الميتوكوندريا في العديد من الوظائف الخلوية الهامة بما في ذلك التمثيل الغذائي، والبقاء على قيد الحياة 1، والتنمية، والكالسيوم مما يشير 2. ترتبط اثنين من وظائف الميتوكوندريا الأكثر أهمية بالنسبة للكفاءة الإنتاج من ATP، والعملة الطاقة للخلية، من خلال الفسفرة التأكسدية، والوساطة من إشارات لموت الخلية المبرمج 3.
الإنزيم المسؤول في المقام الأول لإنتاج ATP هو سينسيز ATP-F1FO، وتسمى أيضا ATP سينسيز 4-5. في السنوات الأخيرة، تلقت دور الميتوكوندريا في موت الخلايا أفكارك ونخرية اهتماما كبيرا. في موت الخلايا أفكارك، BCL-2 البروتينات الأسرة مثل باكس دخول الغشاء الخارجي الميتوكوندريا، oligomerize وpermeabilize الغشاء الخارجي، والإفراج عن العوامل الموالية لأفكارك في العصارة الخلوية 6. في موت الخلايا نخرية الكلاسيكية، مثل تلك التي ينتجها نقص التروية أو التحفيز الزائدة في الخلايا العصبية، تأه، وزيادة سيئة التنظيم في مصفوفة الكالسيوم يساهم في افتتاح مسام الغشاء الداخلي، والميتوكوندريا نفاذية المسام الانتقال أو MPTP. هذا depolarizes الغشاء الداخلي ويسبب تحولات ناضح، والمساهمة في تمزق غشاء الخارجي، وإطلاق سراح من العوامل الموالية لأفكارك، وضعف التمثيل الغذائي. العديد من البروتينات بما في ذلك بي سي إل XL 7 التفاعل مع F1FO ATP سينسيز، تحوير وظيفتها. BCL-XL يتفاعل مباشرة مع الوحيدات بيتا من F1FO ATP سينسيز، وهذا التفاعل يقلل من تصرف تسرب داخل F1FOATPasecomplex، وزيادة صافي النقل من H + من قبل F1FO خلال F1FO ATPase النشاط 8 وبالتالي زيادة كفاءة الميتوكوندريا. لدراسة النشاط والتشكيل من سينسيز ATP، ونحن عزل من القوارض الدماغ الحويصلات submitochondrial (SMVs) التي تحتوي على F1FO أتباز. وSMVs الإبقاء على السلامة الهيكلية والوظيفية للF1FO أتباز كما هو مبين في علويان وآخرون. هنا، نحن تصف طريقةالتي استخدمناها بنجاح لعزل SMVs من دماغ الفئران، ونحن ترسيم تقنية المشبك التصحيح لتحليل نشاط قناة (أيون تصرف تسرب) من SMVs.
Protocol
1. الدماغ الميتوكوندريا العزلة (مقتبس من براون MR آخرون. 9)
- التضحية الفئران باستخدام أساليب وافقت عليها اللجنة استخدام المؤسسات ورعاية الحيوان (IACUC).
- قطع رأس الحيوان عن طريق قطع الرأس، وقطع الجلد وفضح الجمجمة.
- فتح الجمجمة بلطف عن طريق قطع مع مقص أو مقراض. إزالة الدماغ.
- اللحم المفروم ناعما الدماغ من دون المخيخ في العزلة عازلة (انظر الجدول 1) وتحويلها إلى 5 مل زجاج / تفلون الخالط (انظر قائمة المعدات).
- التجانس الأنسجة بلطف 10 مرات (أي فقاعات)، حوالي 5 دقائق.
- أجهزة الطرد المركزي لعينة في 1،500 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية في جهاز للطرد المركزي المقعد العلوي.
- حفظ طاف (الميتوكوندريا وsynaptosomes) وتجاهل بيليه (المواد النووية والحطام الخلية). الطرد المركزي في 16،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية في جهاز للطرد المركزي المقعد العلوي.
- نبذطاف وإعادة تعليق بيليه في 500 ميكرولتر من الاحتياطي العزلة. تعطيل synaptosomes مع سفينة تمزيق الخلايا (انظر قائمة المعدات). تطبيق الضغط من 1،200 رطل لمدة 10 دقيقة، تليها إزالة الضغط السريع.
- طبقة الخليط على Ficoll التدرجات (انظر الجدول 2)، ومكان في SW-50.1 الدوار وأجهزة الطرد المركزي في 126،500 × ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية في نابذة فائقة السرعة (انظر قائمة المعدات). بيليه هو تنقية الميتوكوندريا، وطبقة بين كثافات مختلفة من Ficoll هو synaptosomes undisrupted.
- غسل بيليه بواسطة الطرد المركزي في العزلة عازلة في 16،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية في جهاز للطرد المركزي المقعد العلوي.
2. Submitochondrial الحويصلات (SMV) العزلة (مقتبس من تشان وآخرون. 10)
- اعادة تعليق الميتوكوندريا في 200 ميكرولتر العازلة عزل جنبا إلى جنب مع حجم مساو من 1٪ ديجيتونين والسماح للجلوس على الجليد لمدة 15 دقيقة.
- إضافة المزيد من العزلة بوفإيه وأجهزة الطرد المركزي في 16،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية في جهاز للطرد المركزي المقعد العلوي. القيام بذلك مرتين.
- اعادة تعليق بيليه في 200 ميكرولتر العازلة عزل وإضافة 2 ميكرولتر من 10٪ Lubrol PX (C12E9). خلط والسماح للجلوس على الجليد لمدة 15 دقيقة.
- خليط طبقة عازلة على العزلة، مكان في SW-50.1 الدوار وأجهزة الطرد المركزي في 182،000 × غرام عند 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- غسل النهائي بيليه بواسطة الطرد المركزي في جهاز للطرد المركزي المنضدي في العزلة عازلة في 16،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
3. تسجيل الكهربية
- يتضمن الكهربية تلاعب نموذجي مكبر للصوت، وجهاز كمبيوتر PC مجهزة Digidata 1440A تحويل واجهة التناظرية إلى الرقمية بالتعاون مع pClamp10.0 البرمجيات، والمتلاعبين، المجهر، جدول العزلة الاهتزاز، قفص فاراداي.
- تندس البورسليكات أنابيب زجاجية الشعرية إلى يلهب / براون مجتذب micropipette نموذج P-87. هو الأمثل برنامج ماصة مجتذب إلىتوليد ماصات مع المقاومة بين 80-100 MΩ.
- توضع SMVs في حل داخل الخلايا الفسيولوجية (يضاف ATP في الوقت المناسب أثناء التسجيل) (الجدول 3). تمتلئ ماصات المشبك التصحيح مع نفس الحل (لا ATP). يتم إجراء التسجيلات من خلال تشكيل ختم جيجا أوم على SMVs في درجة حرارة الغرفة. الحويصلات هي تصور بواسطة المجهر المرحلة على النقيض مع نيكون أو زايس مجهر مقلوب.
- يتم الحفاظ على غشاء المحتملة في الفولتية التي تتراوح بين -100 بالسيارات إلى + 100 بالسيارات لفترات من 10 ثانية. يتم تصفيتها التسجيلات في 5 كيلو هرتز باستخدام الدوائر مكبر للصوت. مستوى الضجيج الكهربائي أو غير محددة الضالة من أقل من 1 باسكال تكون مرغوبة للتسجيل ناجحة.
- ويتم تحليل البيانات مع Clampfit 10.0 البرمجيات على سبيل المثال لتحديد التردد والسعة من الأحداث قناة واحدة. يتم تحديد الاعتماد التيار الكهربائي من خلال التآمر علاقة الجهد الحالي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الخطوة الأولى من بروتوكول لدينا يسمح لعزل الميتوكوندريا تنقيته كما هو موضح من قبل لطخة غربية في الشكل 1. في الشكل 2 يظهر مثال على الدماغ المستمدة submitochondrial حويصلة تسجيل التصحيح. باستخدام التكوين التصحيح من الداخل إلى الخارج ونحن لشرح نشاط قناة عن طريق التضمين ATP. عنصر التحكم (CTL) تسجيل (يسار) ويظهر نشاط قناة متعدد تصرف مع تصرف الذروة من 600 PS في المتوسط. الذي انخفض فور إضافة 1 ملم ATP إلى الحمام. التأثير الكلي للاعبي التنس المحترفين هو لتقليل تصرف من بقع SMVs بطريقة تعتمد على التركيز. لقياس كفاءة F1FO أتباز بعد العزلة، قمنا بقياس حركة أيونات H + في SMVs استجابة لاعبي التنس المحترفين المائي كما هو مبين في الشكل (3)، وقياس انخفاض في كثافة مضان من SMV-H + استبعاد مؤشر ACMA. H حساسة ATP + ومما يعزز امتصاص أيون في SMVs بعد إضافةition من ATP. هذا الاختبار يمكن استخدامها لقياس كفاءة H + عزل أيون. سوف SMVs أقل كفاءة تراكم H + الأيونات أكثر ببطء أو إلى قيمة أصغر الذروة. على سبيل المثال H + عزل أيون هو الموهن بإضافة بي سي إل XL مثبطات وFCCP (علويان وآخرون، 2011).
| تركيز النهائي | |
| سكر القصب | 250 مم |
| HEPES | 20 ملم |
| EDTA | 1 ملم |
| BSA | 0.5٪ |
الجدول 1. الاحتياطي العزلة.
| Ficoll | 22 مل 20٪> |
| سكر القصب | 12 مل 1 M |
| EDTA | 18.75 ميكرولتر 0.1 M |
| تريس، حمض الهيدروكلوريك | 375 ميكرولتر 1 M (7.4 درجة الحموضة) |
| أعلى طبقة 7.5٪ من Ficoll | |
| الأسهم Ficoll | 10 مل |
| الاحتياطي العزلة | 6 مل |
| أسفل طبقة 10٪ من Ficoll | |
| الأسهم Ficoll | 15.5 مل |
| الاحتياطي العزلة | 2.5 مل |
الجدول 2. Ficoll المالية.
| بوكل | 120 ملي |
| كلوريد الصوديوم | 8 ملم |
| EGTA | 0.5 ملي |
| HEPES | 10 ملي |
| درجة الحموضة | 7.3 |
الجدول 3. الداخلية سولونشوئها.
الشكل 1. ممثل طخة مناعية من المحللة تنقيته من العصارة الخلوية والميتوكوندريا. تعرض اللوحة العلوية لطخة مناعية باستخدام الأجسام المضادة ضد البروتين عصاري خلوي GAPDH. تظهر لوحة أسفل لطخة مناعية باستخدام الأجسام المضادة ضد غشاء الميتوكوندريا مع innner CoxIV البروتين.
الشكل 2. اثنين التصحيح ممثل تسجيل المشبك قبل وبعد إضافة 1 ملم ATP. عقد المحتملة +70 بالسيارات. خط متقطع يمثل 0 باسكال. يتم تسجيل كل أثر لمدة 10 ثانية، وهناك 10 ثانية بين آثار.
الشكل (3). آثار المثال التغيرات كثافة مضان منمؤشر ACMA مع مرور الوقت في ظل وجود SMVs وفي غياب (تتبع الأسود) وجود (التتبع الحمراء) من ATP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وصفت وسائل تمكين هنا عزلة الميتوكوندريا نقية في نهاية الخطوة 1 والحويصلات submitochondrial (SMVs) بعد الخطوة 2 من الدماغ كله دون تمييز من خلية phenotypes.SMVspurified بواسطة هذه الطريقة هي مجانية أساسا من التلوث بواسطة العضيات التحت خلوية أخرى كما هو مبين في الشكل (1) والعمل السابق لدينا (علويان KN وآخرون. 8) والمحافظة على سلامتها الهيكلية والوظيفية قبل التجميد. بعد تجميد والذوبان، عزل الميتوكوندريا أو تستخدم SMVs للتسجيلات وفحوصات البيوكيميائية، ولكن ليس لدراسات الجهاز التنفسي.
هذا الأسلوب علاوة على ذلك يمكن استخدامها لعزل الميتوكوندريا من الكبد باستخدام نفس الخطوات. لأن الميتوكوندريا وSMVs تميل إلى تشكيل مجموعات عندما مطلي في غرفة تسجيل الكهربية، ينبغي إيلاء الاهتمام لتحميل عينة، باعتبارها تخفيف التثاقل أو الإفراط المفرط قد يقلل من possibiliتي واي لتشكيل الختم. وعلاوة على ذلك، ينبغي إيلاء الاهتمام لعدة التفاصيل الفنية قبل البدء في عزلة. فمن الأهمية بمكان أن استخدام أدوات نظيفة وإبقائهم على الجليد. يجب أن يتم تنفيذ كافة الإجراءات على الجليد وتعيين كافة أجهزة الطرد المركزي إلى 4 درجات مئوية. إعداد التدرج Ficoll هو صحيح الحرجة لتجربة ناجحة. خلق فصل تام بين تركيزات اثنين من Ficoll يعزز نقاء الكسور التحت خلوية.
تفرض قيود على هذه التقنية من قبل المبلغ النهائي من البروتين، والتي يمكن أن تكون صغيرة إذا كان المطلوب عينة من منطقة محددة في الدماغ على سبيل المثال الميتوكوندريا من المادة السوداء الجزء المكتنزة أو المخطط. تجميع عينات من العديد من الحيوانات قد تكون ضرورية لتعزيز المبلغ الإجمالي المقطوع من البروتين.
يتم aliquoted الميتوكوندريا أو SMVs في 1 ملغ / مل وتخزينها في -80 درجة مئوية، وأنها مستقرة للتسجيلات لعدة أشهر، ومع ذلك، فمن preferablه عدم إعادة تجميد عينة الميتوكوندريا بعد ذوبان الجليد. حويصلات تنقيته بواسطة هذه الطريقة مفيدة لدراسة سينسيز ATP، وذلك باستخدام أساليب مختلفة مثل التصحيح تسجيل المشبك، والتقنيات البيوكيميائية والدراسات الفنية الأخرى. مع هذا المستحضر يمكن للمرء أن تحليل آثار المخدرات أو الجزيئات الصغيرة على F1FO أتباز النشاط والهيكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potter-Elvehjem Tissue Grinder withPTFEPestle | Krackeler Scientific, Inc. | 1-7725T-5 | |
| Eppendorf Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5424 000.410 | |
| 4639 Cell Disruption Vessel | Parr Instrument Company | 4639 | |
| Ficoll | Sigma-Aldrich | F5415 | |
| Polycarbonate centrifuge tubes | Beckman Coulter | P20314 | |
| SW-50.1 rotor | Beckman Coulter | ||
| L8-70M Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D5628 | |
| Lubrol PX (C12E9) | Calbiochem | 205534 | |
| Axopatch 200B | Axon Instruments | ||
| Digidata 1440A | Molecular Device | ||
| pClamp10.0 | Molecular Device | ||
| Manipulator | Sutter Instrument | ||
| Borosilicate glass capillary | World Precision Instruments | 1308325 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller Model P-87 | Sutter Instrument |
References
- Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F., Hardwick, J. M. Mitochondrial factors with dual roles in death and survival. Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).
- Duchen, M. R., et al. Mitochondria and calcium in health and disease. Cell Calcium. 44, 1-5 (2008).
- Lemasters, J. J. Modulation of mitochondrial membrane permeability in pathogenesis, autophagy and control of metabolism. J. Gastroenterol. Hepatol. 22, Suppl 1. S31-S37 (2007).
- Cox, G. B., Jans, D. A., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. Hypothesis. The mechanism of ATP synthase. Conformational change by rotation of the beta-subunit. Biochim. Biophys. Acta. 768, 201-208 (1984).
- Cox, G. B., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. The mechanism of ATP synthase: a reassessment of the functions of the b and a subunits. Biochim. Biophys. Acta. 849, 62-69 (1986).
- Cory, S., Huang, D. C., Adams, J. M. The Bcl-2 family: roles in cell survival and oncogenesis. Oncogene. 22, 8590-8607 (2003).
- Vander Heiden, M. G., Thompson, C. B. Bcl-2 proteins: regulators of apoptosis or of mitochondrial homeostasis. Nat. Cell Biol. 1, 209-216 (1999).
- Alavian, K. N., Li, H., Collis, L., Bonanni, L., Zeng, L., Sacchetti, S., Lazrove, E., Nabili, P., Flaherty, B., Graham, M., Chen, Y., Messerli, S. M., Mariggio, M. A., Rahner, C., McNay, E., Shore, G. C., Smith, P. J. S., Hardwick, J. M., Jonas, E. A. Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase. Nat. Cell Biol. 13 (10), 1224-1233 (2011).
- Brown, M. R., Sullivan, P. G., Dorenbos, K. A., Modafferi, E. A., Geddes, J. W., Steward, O. Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria. Journal of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).
- Chan, T. L., Greenawalt, J. W., Pedersen, P. L. Biochemical and ultrastructural properties of a mitochondrial inner membrane fraction deficient in outer membrane and matrix activities. J. Cell Biol. 45 (2), 291-305 (1970).
- Young, H. K. o, Delannoy, M., Hullihen, J., Chiu, W., Pedersen, P. L. Mitochondrial ATP Synthasomes. J. Biol. Chem. 278 (14), 12305-12309 (2003).
