Summary
Une méthode pour isoler les vésicules submitochondriales enrichis en F1FO ATP synthase complexes du cerveau de rat est décrite. Ces vésicules permettent l'étude de l'activité de F1FO complexe ATPase et sa modulation en utilisant la technique de l'enregistrement de patch-clamp.
Abstract
Les mitochondries sont impliquées dans de nombreuses fonctions cellulaires importantes, y compris le métabolisme, la survie à 1, le développement et la signalisation calcium 2. Deux des fonctions mitochondriales les plus importants sont liés à la production efficace de l'ATP, la devise de l'énergie de la cellule, par phosphorylation oxydative et la médiation des signaux de mort cellulaire programmée 3.
L'enzyme principalement responsable de la production de l'ATP synthase est le F1FO-ATP, aussi appelé ATP synthase 4-5. Au cours des dernières années, le rôle des mitochondries dans la mort cellulaire par apoptose et nécrose a reçu une attention considérable. Dans la mort cellulaire par apoptose, BCL-2 protéines de la famille tels que Bax entrent dans la membrane mitochondriale externe, s'oligomériser et perméabilisent la membrane externe, libérant des facteurs pro-apoptotiques dans le cytosol 6. Dans la mort cellulaire nécrotique classique, telle que celle produite par une ischémie ou excitotoxicité des neurones, un large, augmentation mal régulé en calcium de la matrice contribue à l'ouverture d'un pore de la membrane intérieure, le pore de transition de perméabilité mitochondriale ou mPTP. Cette dépolarise la membrane interne et provoque des changements osmotiques, en contribuant à la rupture de la membrane externe, libération de facteurs pro-apoptotiques, et un dysfonctionnement métabolique. De nombreuses protéines dont la protéine Bcl-xL 7 interagir avec F1FO ATP synthase, de moduler sa fonction. Bcl-xL interagit directement avec la sous-unité bêta de l'ATP-synthase F1FO, et cette interaction diminue une conductance de fuite à l'intérieur de la F1FOATPasecomplex, augmentant le transport net de H + par F1FO pendant F1FO activité ATPase 8 et augmentant ainsi l'efficacité mitochondriale. Pour étudier l'activité et de la modulation de l'ATP synthase, nous avons isolé à partir de rongeurs cerveau submitochondriales vésicules (SMVS) contenant F1FO ATPase. Les SMVS conserver l'intégrité structurelle et fonctionnelle de la F1FO ATPase comme indiqué dans Alavian et al. Ici, nous décrivons une méthodeque nous avons utilisé avec succès pour l'isolement du SMVS de cerveau de rat et nous délimiter la technique de patch-clamp pour analyser l'activité du canal (ion fuite conductance) de la SMVS.
Protocol
1. Cerveau mitochondrial Isolation (Adapté de Brown MR et al. 9)
- Sacrifier le rat en utilisant des méthodes approuvées par le Comité d'utilisation Institutional Animal Care et (IACUC).
- Couper la tête de l'animal par décapitation, couper la peau et exposer le crâne.
- Ouvrez le crâne doucement en coupant avec des ciseaux ou rongeur. Retirez le cerveau.
- Hacher finement le cerveau sans cervelet dans le tampon d'isolement (voir tableau 1) et de le transférer à un ml en verre / téflon homogénéisation 5 (voir la liste de l'équipement).
- Homogénéiser les tissus doucement 10 fois (sans bulles), environ 5 min.
- Centrifuger à 1500 g pendant 10 min à 4 ° C dans une centrifugeuse de paillasse.
- Enregistrer le surnageant (mitochondrial et synaptosomes) et jeter le culot (matières nucléaires et débris cellulaires). Centrifuger à 16000 g pendant 10 min à 4 ° C dans une centrifugeuse de paillasse.
- Jetersurnageant et remettre en suspension le culot dans 500 ul de tampon d'isolement. Perturber synaptosomes avec un navire de la perturbation de la cellule (voir la liste de l'équipement). Appliquer une pression de 1200 psi pendant 10 minutes, suivie d'une décompression rapide.
- Couche du mélange sur Ficoll gradients (voir tableau 2), lieu SW-50.1 rotor et centrifuger à 126.500 g pendant 20 min à 4 ° C dans une ultracentrifugation (voir la liste de l'équipement). Le culot est les mitochondries purifiées, la couche entre les différentes densités de Ficoll est synaptosomes sans perturbation.
- Lavez granulés par centrifugation dans un tampon d'isolement à 16.000 g pendant 10 min à 4 ° C dans une centrifugeuse de paillasse.
2. Submitochondriales vésicules (SMV) Isolation (Adapté de Chan et al. 10)
- Re-suspendre mitochondries dans 200 tampon d'isolement ul combiné avec un volume égal de digitonine à 1% et laisser reposer sur la glace pendant 15 min.
- Ajouter plus Buff Isolationer et centrifuger à 16000 g pendant 10 min à 4 ° C dans une centrifugeuse de paillasse. Pour ce faire, deux fois.
- Re-suspendre le culot dans 200 ul de tampon d'isolement et ajouter 2 pi de 10% Lubrol PX (C12E9). Mélanger et laisser reposer sur la glace pendant 15 min.
- mélange de la couche tampon sur d'isolation, lieu SW-50.1 rotor et centrifuger à 182 000 xg à 4 ° C pendant 1 heure.
- Laver le culot final par centrifugation dans une centrifugeuse bureau haut dans le tampon d'isolement à 16.000 g pendant 10 min à 4 ° C.
3. L'enregistrement électrophysiologique
- Un dispositif typique électrophysiologique comprend un amplificateur, un ordinateur de type PC équipé d'une interface de convertisseur analogique-numérique Digidata 1440A en conjonction avec le logiciel pClamp10.0, manipulateurs, un microscope, une table d'isolation de vibration, cage de Faraday.
- Tubes capillaires de verre borosilicate sont insérés dans un Flaming / Brown Micropipette Extracteur modèle P-87. Un programme pipette extracteur est optimisé pourgénérer des pipettes avec résistances entre 80 à 100 MQ.
- SMVS sont placés dans une solution physiologique intracellulaire (ATP est ajoutée au moment approprié au cours de l'enregistrement) (tableau 3). pipettes de patch-clamp sont remplis avec la même solution (pas ATP). Les enregistrements sont effectués en formant un joint giga-ohms sur SMVS à la température ambiante. Les vésicules sont visualisées par microscopie à contraste de phase avec un microscope inversé Nikon ou Zeiss.
- Le potentiel de la membrane est maintenu à des tensions allant de -100 mV à +100 mV pour des périodes de 10 secondes. Les enregistrements sont filtrés à 5 kHz en utilisant le circuit de l'amplificateur. Niveau de bruit électrique ou non-spécifique parasite de moins de 1 pA sont souhaitables pour l'enregistrement réussi.
- Les données sont analysées avec le logiciel Clampfit 10.0 par exemple pour déterminer la fréquence et l'amplitude des événements à un seul canal. La dépendance de tension est déterminée en traçant une relation courant-tension.
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Representative Results
La première étape de notre protocole permet l'isolement des mitochondries purifiées comme indiqué par Western blot à la figure 1. Dans la figure 2 est représenté un exemple de submitochondriales enregistrement de patch des vésicules dérivé du cerveau. Utilisation de la configuration de patch inside-out, nous démontrons l'activité du canal modulé par l'ATP. Le contrôle (CTL) enregistrement (à gauche) montre l'activité du canal multi-conductance avec une conductance pic de 600 ch en moyenne. qui a été immédiatement diminué lors de l'addition de 1 mM d'ATP dans le bain. L'effet global de l'ATP est de diminuer la conductance des correctifs SMVS d'une manière dépendante de la concentration. Pour mesurer l'efficacité de F1FO ATPase après l'isolement, nous avons mesuré le mouvement des ions H + dans les SMVS en réponse à l'hydrolyse d'ATP comme le montre la figure 3, la mesure de la diminution de l'intensité de fluorescence du SMV-exclus H + indicateur ACMA. H ATP-sensible + séquestration d'ions dans SMVS est renforcée après ajouterition de l'ATP. Ce test peut être utilisé pour mesurer l'efficacité de H + séquestration d'ions. SMVS moins efficaces vont s'accumuler ions H + plus lentement ou à une valeur de crête plus petite. Par exemple H + séquestration d'ions est atténué par l'ajout d'inhibiteurs de la protéine Bcl-XL et FCCP (Alavian et al., 2011).
| Concentration finale | |
| Saccharose | 250 mm |
| Hépès | 20 mm |
| EDTA | 1 mm |
| BSA | 0,5% |
Tableau 1. Buffer d'isolement.
| Ficoll | 22 ml 20%> |
| Saccharose | 12 ml 1 M |
| EDTA | 18,75 pl 0,1 M |
| Tris-HCl | 375 pl 1 M (pH 7,4), |
| Top Layer 7,5% de Ficoll | |
| Ficoll stock | 10 ml |
| Buffer d'isolement | 6 ml |
| Couche inférieure à 10% de Ficoll | |
| Ficoll stock | 15,5 ml |
| Buffer d'isolement | 2,5 ml |
Tableau 2. Ficoll Stock.
| KCl | 120 mM |
| NaCl | 8 mM |
| EGTA | 0,5 mM |
| Hépès | 10 mM |
| pH | 7.3 |
Tableau 3. Interne Solution.
Figure 1. Représentant immunoblot de lysat purifié du cytosol et les mitochondries. Le panneau supérieur montre un immunoblot en utilisant un anticorps contre la protéine GAPDH cytosolique. Le panneau inférieur montre un immunoblot en utilisant un anticorps contre la innner CoxIV de protéine de la membrane mitochondriale.
Figure 2. Deux timbre représentant enregistrement de serrage avant et après addition de 1 mM ATP. Le potentiel de maintien est +70 mV. La ligne pointillée représente 0 pA. Chaque trace est enregistrée pendant 10 secondes et il ya 10 secondes entre les traces.
Figure 3. Exemple traces des changements d'intensité de fluorescence del'indicateur ACMA au cours du temps en présence de SMVS et en l'absence (trace noire) et en présence (rouge trace) de l'ATP.
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Discussion
Les procédés décrits ici permettent l'isolement des mitochondries pur à la fin de l'étape 1 et des vésicules submitochondriales (SMVS) après l'étape 2 de cerveau entier, sans distinction de cellules phenotypes.SMVspurified par ce procédé sont essentiellement exempt de contamination par d'autres organelles sous-cellulaires comme indiqué dans Figure 1 et notre travail précédent (Alavian KN et al. 8) et conserver leur intégrité structurale et fonctionnelle avant la congélation. Après congélation et la décongélation, les mitochondries isolées ou SMVS sont utilisés pour des enregistrements et des analyses biochimiques, mais pas pour des études respiratoires.
Cette méthode peut en outre être utilisé pour isoler les mitochondries de foie en utilisant les mêmes étapes. Parce que les mitochondries et SMVS ont tendance à former des agrégats lorsque plaqué dans la chambre d'enregistrement électrophysiologique, l'attention devrait être accordée au chargement de l'échantillon, comme une dilution excessive agglutination ou excessive peut diminuer la possibilité de formation joint. Par ailleurs, l'attention devrait être accordée à plusieurs détails techniques avant de commencer l'isolement. Il est essentiel d'utiliser des outils propres et de les garder sur la glace. Toutes les procédures doivent être effectuées sur la glace et toutes les centrifugeuses fixé à 4 ° C. Préparation du gradient Ficoll est correctement essentiel pour une expérience réussie. Création d'une séparation parfaite entre les deux concentrations de Ficoll améliore la pureté des fractions sous-cellulaires.
Une limitation de cette technique est imposée par le montant final de la protéine, qui peut être faible si l'échantillon d'une région spécifique du cerveau est souhaité par exemple mitochondries de substantia nigra pars compacta ou striatum. La mise en commun des échantillons de plusieurs animaux peut être nécessaire d'augmenter la quantité totale de protéines récolté.
Mitochondries ou SMVS sont aliquotées à 1 mg / ml et conservé à -80 ° C et ils sont stables pour les enregistrements pendant plusieurs mois, cependant, il est preferable de ne pas recongeler l'échantillon mitochondrial après décongélation. Vésicules purifiées par cette méthode sont utiles pour étudier l'ATP synthase, en utilisant différentes approches telles que l'enregistrement de patch-clamp, les techniques biochimiques et d'autres études fonctionnelles. Avec cette préparation, on peut analyser les effets de la drogue ou de petites molécules sur l'activité ATPase F1FO et la structure.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potter-Elvehjem Tissue Grinder withPTFEPestle | Krackeler Scientific, Inc. | 1-7725T-5 | |
| Eppendorf Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5424 000.410 | |
| 4639 Cell Disruption Vessel | Parr Instrument Company | 4639 | |
| Ficoll | Sigma-Aldrich | F5415 | |
| Polycarbonate centrifuge tubes | Beckman Coulter | P20314 | |
| SW-50.1 rotor | Beckman Coulter | ||
| L8-70M Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D5628 | |
| Lubrol PX (C12E9) | Calbiochem | 205534 | |
| Axopatch 200B | Axon Instruments | ||
| Digidata 1440A | Molecular Device | ||
| pClamp10.0 | Molecular Device | ||
| Manipulator | Sutter Instrument | ||
| Borosilicate glass capillary | World Precision Instruments | 1308325 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller Model P-87 | Sutter Instrument |
References
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