את הצעדים הדרושים לכוונון ואופטימיזציה יומיים של ביצועים של cytometer המוני CyTOF מתוארים. תגובות על הכנת מדגם אופטימלי וקצב זרימה נדונות
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Cytometry המוני: פרוטוקול לכוונון יומי ודגימות תאים פועלים על Cytometer המוני CyTOF
במאמר זה
סיכום
תקציר
בשנים האחרונות, הניתוח המהיר של תאים בודדים יש בדרך כלל בוצע באמצעות cytometry זרימה ונוגדנים שכותרת-fluorescently. עם זאת, סוגיית חפיפת רפאים של פליטות fluorophore הגבילה את מספר הבדיקות בו זמנית. לעומת זאת, cytometer ההמוני CyTOF החדש על ידי זוגות מדעי DVS מערכת הקדמת תא בודד נוזל ICP-MS. 1 במקום fluorophores, פולימרים המכילים איזוטופים chelating מתכת מועשרת-מאוד הם מצמידים לנוגדנים או בדיקות ספציפיות אחרות. 2-5 בגלל טוהר המתכת והרזולוציה המונית של cytometer ההמוני, אין "חפיפת רפאים" מהאיזוטופים שכנים, ולכן אין צורך מטריצות פיצויים. בנוסף, בשל השימוש במתכות lanthanide, אין רקע ביולוגי ולכן אין לה מקבילה של autofluorescence. עם חלון המוני הפורשים מסה אטומית 103-203, באופן תיאורטי עד 100 תוויות יכולות להבחין בו זמנית. כיום, יותר מ 35 ערוצים זמינים באמצעות ריאגנטים chelating הזמינים ממדעי DVS, המאפשר לנתיחת תקדים של הפרופיל החיסוני של דגימות. 6-7
חסרונות cytometry המוני כוללים דרישה המחמירה לאיזוטופ נפרד מתכת לבדיקה (אין מקביל לפיזור קדימה או בצד), ועובדה שמדוברת בטכניקה הרסנית (אין אפשרות למיון החלמה). התצורה הנוכחית של cytometer המסה יש גם שיעור תא שידור של רק ~ 25%, ולכן דורש קלט מספר גבוה יותר של תאים.
ביצועים יומיים אופטימליים של cytometer ההמוני דורשים מספר שלבים. המטרה הבסיסית של אופטימיזציה היא למקסם את עוצמת האות הנמדדת של איזוטופים המתכת הרצויה (M) תוך מזעור ההיווצרות של תחמוצות (16 '), שיהיה הפחתה בעוצמת אות M ולהפריע לאות רצויה בM 16. הצעד הראשון הוא לחמם את המכונה כל כך חם, אני יציבCP פלזמה כבר נקבע. שנית, את ההגדרות עבור קצב זרימת גז נוכחי ואיפור חייבות להיות מותאמות על בסיס יומי. במהלך איסוף דגימה, שיעור אירועי התא המרבי מוגבל על ידי יעילות גלאי ומהירות עיבוד עד 1000 תאים / 2. עם זאת, בהתאם לאיכות המדגם, שיעור אירועי תא איטי יותר (300-500 תאים / 2) הוא בדרך כלל רצוי שיאפשר רזולוציה טובה יותר בין אירועי תאים ובכך למקסם את הגופיות שלמות על כפילויות ופסולות. לבסוף, ניקוי נאות של המכונה בסוף היום מסייע למזער אות רקע בשל מתכת חופשיה.
פרוטוקול
כל דגימות התאים לCyTOF חייבות להיות קבועות וpermeabilized. זה מאפשר כניסה רבה יותר של intercalator דנ"א המכיל אירידיום, וגם מונע תמוגה תא במהלך הרחצה במים וצעדי MilliQ resuspension מייד לפני ההזרקה לתוך cytometer ההמוני.
1. Start-up של Cytometer ההמוני
- פתח את תוכנת CyTOF. בחר הגדרת מכשיר. בכרטיסיית קייג' הכרטיס, לך לפינה ימנית התחתונה ולחץ על מחמם "על" כפתור. הפעל לפחות 15 דקות לפני הזמן רצוי בתנור כדי לאפשר מספיק זמן למעטפת תא התרסיס להגיע 200 ° C.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בעקבות הפרוטוקול הנ"ל צריך להשיג ארבעה דברים. ראשית, המאפשר זמן חימום נאות לcytometer ההמוני יפיק פלזמה חמה, יציבה הכרחית לאות אופטימלית והיווצרות תחמוצת מינימאלית. כביסה שנייה, נאותה cytometer ההמוני עם פתרון לשטוף DVS מי MilliQ ו( איור 9) תעזור להפחית את הרמות של מתכת ספיחה לצינורות וחלקים אחרים של המכונה, כדי לסייע להפחית רקע במהלך רכישת מדגם (איור 8). זה גם יעזור להסיר את כל תאים שעלולים להיתקע במכונה ובכך לצמצם carryover ממדגם למדגם. תוך.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
במשך העשורים האחרונים, cytometry הזרימה פלואורסצנטי היה סוס עבודת שיטה לניתוח תאים בודדים, הוא במונחים של ביטוי בשטח ומבחנים תפקודיים. עם זאת, בסוגיות של חפיפת ספקטרום של צבעי הניאון הגבילו את מספר הסמנים בו זמנית. בעוד ניסויים באמצעות יותר מ 12 סמנים בו זמנית כבר דיווחו, סכום הפיצוי הנדרש עושה את זה קשה מבחינה טכנית.
במקום fluorophores, cytometry ההמוני החלוץ ידי מדעי DVS משתמש פולימרים בעלי אתרי chelating למתכו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים גם עבודה במרכז האנוש החיסוני הניטור, מרכז שירות באוניברסיטת סטנפורד שגובה דמי שימוש אך ורק כדי לשחזר את העלות של מבחנים, כולל cytometry המוני.
תודות
ברצוננו להודות לד"ר האוון ניואל וד"ר שון Bendall למשוב. אנחנו גם רוצים להודות למדעים וDVS ד"ר שון Bendall למדגם בחרוזי הקלקר בעל מספר lanthanide המכיל. אנו מודים למימון ממענק NIH 2 U19 AI057229.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שם המגיב | חברה | מספר קטלוגים | תגובות |
| CyTOF TM ההמוני cytometer | מדעי DVS | ||
| שטוף את הפתרון | מדעי DVS | 201071 | 0.05% חומצה הידרופלואורית במים |
| כוונון פתרון | מדעי DVS | 201072 | 0.5 ppm La, Cs, שחפת, TM, עיר, חומצה חנקתית עקבות |
| חרוזי קלקר איחוד אירופי המכילים | מדעי DVS | 201073 | מכיל איזוטופים טבעי שפע איחוד האירופיים; חרוזים מסופקים בכ 1 מ'/ מ"ל |
| Multi-lanthanide המכיל (La / Pr / Tb / Tm / Lu) - חרוזי קלקר | מדעי DVS | עדיין לא זמין המסחרי | מכיל איזוטופים טבעי שפע של lanthanides הרשום |
| חומצה חנקתית (מרוכז) | הפישר סיינטיפיק | A467-500 | אופטימה עקבות מתכת טהורה ICP-MS כיתה |
| צינור פוליסטירן עגול עם תחתית תא מסננת כובע-5 מ"ל | BD | 352235 | משמש לסינון דגימות תאים לפני ההזרקה |
| נורמה מקרינה tuberkulin מזרק 1ml | הנקת זאס וולף | 4010-200V0 | סיליקון חופשי, לטקס חינם |
| נורמה מקרינה מזרק-3 מ"ל | הנקת זאס וולף | 4010.000V0 | סיליקון חופשי, לטקס חינם |
| מי MilliQ | מים טהורים MΩ 18; לא חייבים להיות מאוחסנים בזכוכית או בקבוקי פלסטיק שנשטפו עם חומר ניקוי מסחרי (עקב הרמות הגבוהות של הווה בריום). | ||
| Citranox | סיגמה אולדריץ | Z273236 | חומר ניקוי חומצה |
| ארגון גז | Praxair | AR 5.0UH-T | 99.999% טוהר גבוה במיוחד |
מקורות
- Bandura, D. R. Mass cytometry: Technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma Time-of-Flight mass spectrometry. Anal. Chem. 81, 6813-6822 (2009).
- Lou, X. Polymer....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
