Summary
एक उपन्यास विधि झल्लाहट (Forster प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण) संकेतों के मात्रात्मक विश्लेषण शामिल एंजाइम कैनेटीक्स का अध्ययन करने के लिए वर्णित है.
Protocol
1. प्लास्मिड constructs
- पीसीआर द्वारा जीनों के खुला पढ़ने फ्रेम बढ़ाना, और PCRII - Topo वेक्टर में पीसीआर उत्पादों क्लोन.
- अनुक्रमण द्वारा उत्पादों की पुष्टि करें, और क्लोन सीडीएनए एन्कोडिंग CyPet (पूर्व SUMO1) YPet, CyPet SUMO1, YPet और एन टर्मिनल एक hexahistidine टैग के साथ pET28 वेक्टर (ख) में SENP1 उत्प्रेरक डोमेन.
2. प्रोटीन अभिव्यक्ति और शुद्धीकरण
- BL21 तनाव (DE3) के pET28 साथ Escherichia कोलाई कोशिकाओं को बदलने (ख) वैक्टर CyPet (पूर्व SUMO1) - YPet, CyPet SUMO1, YPet और SENP1 उत्प्रेरक डोमेन एन्कोडिंग.
- 3 घंटा के लिए 2xYT मध्यम में तब्दील बैक्टीरिया 37 डिग्री सेल्सियस (250 rpm पर मिलाते हुए) 600 एनएम पर 0.5 का एक ऑप्टिकल घनत्व तक पहुँचने के लिए बढ़ी.
- (IPTG) isopropyl β-D-thiogalactoside प्रोटीन (अंतिम एकाग्रता) अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए और 25 में 16 घंटे के लिए हिला सी ° 200 आरपीएम पर 100 सुक्ष्ममापी जोड़ें.
- Centrifug जीवाणुओं द्वारा जल का संग्रहण10,000 rpm पर 4 में समझना ° 5 मिनट और 20 मिमी Tris (पीएच 7.4), एचसीएल, 50 मिमी NaCl, और 5 मिमी imidazole एक बफर में उन्हें resuspend सी.
- 5 सेकंड अंतराल में 10 मिनट के लिए कोशिकाओं और 25 का उपयोग कर MiSonics 4000 sonicator डब्ल्यू के एक बिजली की सेटिंग में Sonicate उन्हें centrifugation द्वारा 35,000 XG 4 में इकट्ठा ° सी 30 मिनट के लिए.
- 1 एल संस्कृति के लिए 500 मिलीलीटर नी NTA मोती के साथ स्तंभ सेट और स्तंभ में तैरनेवाला हस्तांतरण.
- 20 मिमी Tris (पीएच 7.4), एचसीएल, 500 मिमी NaCl, और 10 मिमी दो बार imidazole के बफर के साथ राल धो लें.
- 20 मिमी Tris (पीएच 7.4), एचसीएल, 500 मिमी NaCl, और 500 मिमी imidazole और 20 मिमी Tris - एचसीएल (पीएच 7.4), 50 मिमी NaCl और 1 मिमी (डीटीटी) dithiothreitol में एक बफर में डायलिसिस के बफर के साथ Elute प्रोटीन 4 ° रातोंरात सी.
- ब्रैडफोर्ड परख द्वारा शुट्ठ प्रोटीन की सांद्रता का निर्धारण करते हैं. प्रोटीन एकाग्रता मापन के लिए वैकल्पिक विधि एसडीएस पृष्ठ जेल वैद्युतकणसंचलन और तो Coomassie नीले रंग के साथ दाग इमेजिंग के साथ पीछा कियामात्रात्मक.
3. मात्रात्मक झल्लाहट स्पेक्ट्रम विश्लेषण
- परख के लिए सामान्य रणनीति झल्लाहट संकेत (चित्रा 1) के आधार पर किया गया था. जोड़ी झल्लाहट, CyPet और YPet, एन और सी टर्मिनी टैग किया गया था, क्रमशः पूर्व SUMO1 की. Gly-Gly में है SUMO1 सी टर्मिनस साइट पर SENP1 cleaves संलयन प्रोटीन CyPet (पूर्व SUMO1) YPet और इस प्रकार, सूमो पूंछ के साथ YPet विज्ञप्ति. झल्लाहट संकेत बाधित है, वृद्धि हुई है और CyPet से उत्सर्जन के CyPet उत्तेजना तरंग दैर्ध्य में एक नाटकीय कमी YPet उत्सर्जन में जिसके परिणामस्वरूप.
- तरंगदैर्ध्य के प्रकाश से 530 एनएम पर 414 एनएम, की कुल प्रतिदीप्ति उत्सर्जन CyPet (पूर्व SUMO1) YPet उत्साहित पूर्ण झल्लाहट प्रेरित YPet उत्सर्जन, CyPet प्रत्यक्ष उत्सर्जन और YPet प्रत्यक्ष (उत्सर्जन चित्रा: तीन स्रोतों से प्राप्त कर सकते हैं ) 2.
जहां FL 530/414 <FL CyPet (cont) / उप> 530 एनएम पर कुल प्रतिदीप्ति उत्सर्जन जब 414 एनएम पर उत्साहित है, FL झल्लाहट है पूर्ण संकेत झल्लाहट CyPet प्रत्यक्ष उत्सर्जन जब 414 एनएम पर उत्साहित है, और FL YPet (cont) YPet उत्सर्जन प्रत्यक्ष जब 414 एनएम पर उत्साहित है. सब्स्क्रिप्ट (cont) योगदान के लिए खड़ा है.
- 530 एनएम में CyPet की प्रत्यक्ष उत्सर्जन 475 एनएम पर उत्सर्जन के लिए आनुपातिक था जब α की एक निरंतर अनुपात के साथ 414 एनएम पर उत्साहित CyPet - SUMO1 50 की सांद्रता, 100, 200, 500, और 750 एनएम पर तैयार किया गया था और 1 मिमी , और 475 और 530 एनएम पर उत्सर्जन 414 एनएम पर उत्तेजना α (3-1 चित्रा) निर्धारित करने के बाद मापा गया.
- उत्तेजना के तहत 530 एनएम पर 414 एनएम पर YPet के प्रत्यक्ष उत्सर्जन 530 एनएम पर उत्सर्जन के लिए आनुपातिक था जब β की एक निरंतर अनुपात के साथ 475 एनएम पर उत्साहित YPet 50 की सांद्रता, 100, 200, 500, 750 एक पर तैयार किया गया था.1000 एनएम, और 530 एनएम पर उत्सर्जन एन डी जब नमूने 414 और 475 एनएम की तरंग दैर्ध्य से उत्साहित थे β (चित्रा 3-2) निर्धारित मापा गया था.
- जब CyPet (पूर्व SUMO1) YPet SENP1 से पचता था, दरार CyPet SUMO1 और YPet के साथ SUMO1 पूंछ जारी किया. जब यौगिक 414 एनएम पर उत्साहित थी, 530 एनएम (FL 530/414) में प्रतिदीप्ति उत्सर्जन में कमी आई है, लेकिन अभी भी तीन भागों में विभाजित किया जा सकता है:
FL CyPet (/ 414 475), जहां FL 414 530/530 एनएम के पाचन के बाद कुल प्रतिदीप्ति उत्सर्जन है जब 414 एनएम पर उत्साहित, FL झल्लाहट शेष पूर्ण संकेत झल्लाहट है पाचन के बाद 475 एनएम पर CyPet उत्सर्जन है जब 414 एनएम (यहाँ CyPet उत्सर्जन दो भागों में से एक है: CyPet (पूर्व SUMO1) YPet पचाया नहीं और CyPet SUMO1 पच) पर उत्साहित है, और FL YPet(/ 475 530) YPet उत्सर्जन जब 475 एनएम पर उत्साहित है, जो निरंतर चाहे CyPet (पूर्व SUMO1) YPet पचा या नहीं है है.
- SENP1 से पाचन के बाद, शेष झल्लाहट उत्सर्जन (FL 'झल्लाहट):
जहां सी CyPet (पूर्व SUMO1) YPet और x के कुल एकाग्रता है पच की एकाग्रता CyPet (पूर्व SUMO1) YPet है.
- आइटम के सभी संयोजन करके, उत्तेजना के तहत 530 एनएम पर 414 एनएम (530 'FL 414 /) का पता लगाया प्रतिदीप्ति उत्सर्जन है:
4. झल्लाहट आधारित एंजाइम काइनेटिक अध्ययन के लिए Protease परख
- CyPet (पूर्व SUMO1) YPet SENP1 उत्प्रेरक डोमेन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर incubated 20 मिमी Tris - एचसीएल (पीएच 7.4), 50 मिमी NaCl, 0.1% की एक बफर में (v /v) Tween-20 और 1 मिमी डीटीटी और 80 मिलीलीटर की कुल मात्रा 384 अच्छी तरह से थाली में स्थानांतरित.
- चलाता 475 और 530 एनएम पर 15 सेकंड के अंतराल के साथ 5 मिनट के लिए एक प्रतिदीप्ति multiwell प्लेट रीडर में 414 एनएम पर एक उत्तेजना के बाद प्रतिदीप्ति उत्सर्जन को मापने के द्वारा आयोजित किया गया था.
- प्रतिक्रिया दर (v) सब्सट्रेट (एस) के रूप में राशि में परिवर्तन के साथ सहसंबद्ध था:
- उत्पाद की एकाग्रता 0 से के रूप में तेजी से वृद्धि हुई है [एस] 0 (मूल सब्सट्रेट एकाग्रता) = 0 टी:
- जब टी = 0, मूल वेग (0 वी) है:
- सान्द्रSENP1 की entration तय किया गया था और CyPet (पूर्व SUMO1) YPet की एकाग्रता एंजाइम की एकाग्रता, जो Michaelis Menten समीकरण द्वारा आवश्यक है की तुलना में 100 गुना अधिक से बढ़ा दिया गया था.
- फ्लोरोसेंट रीडिंग के मात्रात्मक विश्लेषण झल्लाहट विधि द्वारा विश्लेषण किया गया और GraphPad चश्मे वी सॉफ्टवेयर में साजिश रची लिए समीकरण Michaelis Menten फिट. nonlinear प्रतिगमन भी अधिक स्प्रेडशीट प्रोग्राम्स (जैसे Microsoft Excel) की तरह आम सॉफ्टवेयर संकुल की सहायता के साथ किया जा सकता है.
5. प्रतिनिधि परिणाम
पूर्व SUMO1 SENP1 द्वारा परिपक्वता प्रक्रिया के दौरान 475 और 530 एनएम पर प्रतिदीप्ति संकेत में परिवर्तन की निगरानी द्वारा निर्धारित किया जा सकता है. परिणाम से पता चला है कि सब्सट्रेट खुराक निर्भर तरीके में SENP1 द्वारा पूर्व SUMO1 पाचन के वेग (4 चित्रा). यह पता चलता है कि पूर्व SUMO1 परिपक्वता के लिए SENP1 उत्प्रेरक डोमेन उत्कृष्ट गतिविधि दर्शाती है कि. प्रारंभिक reaction वेग विभिन्न सब्सट्रेट सांद्रता (1 टेबल) के साथ उपरोक्त विश्लेषण के अनुसार गणना की गई.
/ k बिल्ली कश्मीर एम अनुपात आम तौर पर एक सब्सट्रेट या विभिन्न substrates के साथ एक विशेष एंजाइम के साथ विभिन्न एंजाइमों की क्षमता की तुलना करने के लिए प्रयोग किया जाता है कश्मीर और एम वी अधिकतम समीकरण Michaelis Menten से विभिन्न प्रारंभिक वेग, इसी की साजिश रचने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है . CyPet (पूर्व SUMO1)-YPet (5 चित्रा) कश्मीर बिल्ली के रूप में प्राप्त किया गया था के विभिन्न सांद्रता:
उपरोक्त विश्लेषण के अनुसार, की गणना के एम 0.21 था ± 0.04 सुक्ष्ममापी, कश्मीर बिल्ली 6.90 था ± 0.28 -1 एस, और कश्मीर एम / बिल्ली कश्मीर अनुपात (3.2 ± 0.55) x10 7 एम -1 > -1.
चित्रा 1 झल्लाहट आधारित है SENP पूर्व SUMOs के लिए परिपक्वता protease परख का ग्राफ़.
चित्रा 2 दाता स्वीकर्ता, और झल्लाहट के योगदान के रूप में फ्लोरोसेंट संकेत के मात्रात्मक विश्लेषण. उत्सर्जन स्पेक्ट्रा - CyPet (पूर्व SUMO1) 414 एनएम पर उत्तेजना के तहत YPet FL CyPet (/ 414 530) से विच्छेदन है 414 एनएम के 530 उत्तेजना के तहत एनएम पर है CyPet उत्सर्जन, FL झल्लाहट झल्लाहट - प्रेरित 414 एनएम की उत्तेजना के तहत 530 एनएम पर YPet उत्सर्जन, और FL YPet (/ 414 530) 414 एनएम की उत्तेजना के तहत 530 एनएम पर है YPet उत्सर्जन है.
/ load/4430/4430fig3.jpg ">
चित्रा 3 दिशा उत्सर्जन कारक α और β की गणना.
4 चित्रा CyPet (पूर्व SUMO1) उत्प्रेरक डोमेन के SENP1 के विभिन्न अनुपात से पचता YPet के मात्रात्मक विश्लेषण. प्रतिक्रियाओं पहले 5 मिनट के भीतर निगरानी की गई.
चित्रा 5 Michaelis Menten SENP1 द्वारा CyPet (पूर्व SUMO1) - YPet पाचन की चित्रमय विश्लेषण. डेटा साजिश रची और GraphPad चश्मे वी और nonlinear प्रतिगमन विश्लेषण किया.
| [एस] (सुक्ष्ममापी) | वी 0 (/ सुक्ष्ममापी s) | ||
| 0.115 | 0.००२३ ± 0.००,००५ | 0.214 | ०.००२८ ± 0.००००४ |
| 0.407 | 0.0033 ± .००,००७ | ||
| 0.594 | .0037 ± ०.००,०१३ | ||
| 0.725 | .0043 ± .०००१२ | ||
| 1.471 | 0.0051 ± 0.००,०३६ | ||
| 1.899 | .००५० ± .००,०३१ | ||
| 2.300 | .००५० ± 0.०००६२ |
तालिका 1 SENP1 द्वारा पूर्व SUMO1 परिपक्वता के प्रारंभिक वेग दृढ़ संकल्प. प्रत्येक सब्सट्रेट एकाग्रता में, चार नमूने पाचन को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया. मानक विचलन इन चार नमूनों की विविधताओं से आया था.
| के एम (सुक्ष्ममापी) | कश्मीर बिल्ली (s-1) | कश्मीर / बिल्ली कश्मीर (एम एम एस -1 •-१) |
| 0.21 ± 0.04 | 6.90 ± 0.28 | 3.2 0.55 ± 7 10 × |
मात्रात्मक द्वारा SENP1 द्वारा पूर्व SUMO1 परिपक्वता की काइनेटिक मापदंडों विश्लेषण तालिका 2. झल्लाहट. मानक विचलन प्रत्येक सब्सट्रेट एकाग्रता में चार नमूनों से आया था.
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Discussion
झल्लाहट प्रौद्योगिकी 9 SENP1 पूर्व SUMO1 परिपक्वता का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. CFP YFP जोड़ी झल्लाहट और ratiometric विश्लेषण, जो स्वीकर्ता के दाता उत्सर्जन के लिए अनुपात के रूप में इस्तेमाल किया गया था, गतिज गुण विशेषताएँ इस्तेमाल किया गया था. हालांकि, वहाँ दाता और स्वीकर्ता पारंपरिक ratiometric में आत्म प्रतिदीप्ति विश्लेषण झल्लाहट का कोई विचार है. अनुपात सीधे पचा सब्सट्रेट की राशि के साथ सहसंबंधी नहीं करता है.
यहाँ हम एक विकसित अत्यधिक संवेदनशील protease झल्लाहट आधारित SENP1 द्वारा पूर्व SUMO1 परिपक्वता की गतिज अध्ययन परख रिपोर्ट. पिछले ratiometric दृष्टिकोण के विपरीत, हम मौलिक झल्लाहट गतिज विश्लेषण और एक प्रयोगात्मक प्रक्रिया के लिए संकेत करने के लिए दाता और स्वीकर्ता से स्वयं प्रतिदीप्ति की मात्रात्मक योगदान निर्धारित गतिज पैरामीटर प्राप्त एक नए सिद्धांत के साथ विधि में सुधार, और वास्तविक झल्लाहट प्रेरित स्वीकर्ता उत्सर्जन. Ratiometric विश्लेषण ऐसा नहीं कर सकते.दाता और स्वीकर्ता के आत्म - फ्लोरोसेंट उत्सर्जन की अज्ञानता संकेत झल्लाहट और दाता के उत्सर्जन के एक overestimation को जन्म दे सकती है. बहुत overestimations अंतिम कश्मीर / बिल्ली कश्मीर एम अनुपात (3.81 x10 7 -1 ratiometric विश्लेषण के लिए एम -1, 3.2 x10 7 -1 एम -1 हमारे मात्रात्मक विश्लेषण झल्लाहट के द्वारा) को प्रभावित नहीं है, लेकिन हो सकता है प्रभाव अधिक है स्पष्ट है जब व्यक्तिगत मापदंडों, कश्मीर (.098 बनाम 0.21 सुक्ष्ममापी) एम और कश्मीर बिल्ली (3.43 s -1 बनाम 6.90 एस -1), जो दर सीमित कदम और एंजाइमों का अवरोध करनेवाला शक्ति निर्धारित करने में महत्वपूर्ण हैं का अध्ययन.
विधि हम यहाँ रिपोर्ट protease कैनेटीक्स मापदंडों की एक परख एक कदम है और रेडियोधर्मी लेबलिंग या महंगे उपकरण के बिना ही आणविक क्लोनिंग और प्रोटीन अभिव्यक्ति की आवश्यकता है. एक कदम प्रक्रिया न केवल प्रयोगात्मक प्रक्रिया सरल है, लेकिन यह भी एक बहुत सीमाकी विविधताओं. फ्लोरोसेंट टैग प्रोटीन जलीय चरण है, जो आम तौर पर उनकी कोशिकाओं में प्राकृतिक वातावरण के लिए इसी तरह की हैं. प्रतिदीप्ति तीव्रता सामान्य प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी या प्रतिदीप्ति प्लेट पाठकों, जो व्यापक रूप से उपलब्ध हैं द्वारा निर्धारित किया जा सकता है. पारंपरिक "जेल आधारित" विधि के साथ तुलना में, हमारे protease झल्लाहट आधारित परख वृद्धि की संवेदनशीलता, वास्तविक समय माप, और कम समय और श्रम की जरूरत सहित कई लाभ प्रदान करता है. इसके अलावा, और protease कैनेटीक्स पैरामीटर determinations की कार्यप्रणाली प्रक्रिया radioisotopes या कठोर रसायनों के रूप में पर्यावरण के अनुकूल और गैर खतरनाक सामग्री, कर रहे हैं. इसके अलावा, बेहद संवेदनशील परख झल्लाहट आधारित उच्च throughput protease अवरोध चोकर के रूप में जैविक assays में इस्तेमाल किया जा सकता है. गतिज अध्ययन में यह भी inhibitors के गुण (की जैसे, IC50) विशेषताएँ करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
इसलिए, झल्लाहट बेहद संवेदनशील मात्रात्मक बसएड protease assays जीनोम चौड़ा रूपरेखा protease सब्सट्रेट और अवरोध करनेवाला प्रदर्शन के विकास में एक शक्तिशाली दृष्टिकोण हो सकता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम बहुत मूल्यवान सलाह के लिए विक्टर GJ Rodgers आभारी हैं. हम लियाओ समूह के सदस्यों के बहुत करीबी सहयोगी और इस अध्ययन के साथ मदद के लिए काम करने के लिए सभी को धन्यवाद. इस अध्ययन स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (जीएल AI076504 अनुदान) द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR II TOPO Kit | Invitrogen | K466040 | |
| 2xYT | Research Products Internationa.l Corp. | X15600 | |
| Ni-NTA Agrose | Thermo Scientific | 88222 | |
| Coomassie plus (Bradford) Assay Regent | Thermo Scientific | 23238 | |
| 384-well plate (glass bottom) | Greiner | 781892 | |
| FlexStation II 384 plate reader | Molecular Device |
References
- Johnson, E. S. Protein modification By SUMO. Annual Review of Biochemistry. 73, 355-382 (2004).
- Gill, G. SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms. Genes & Development. 18, 2046-2059 (2004).
- Hay, R. T. SUMO: a history of modification. Molecular Cell. 18, 1-12 (2005).
- Müller, S., Hoege, C., Pyrowolakis, G., Jentsch, S. SUMO, ubiquitin's mysterious cousin. Nature. , 202-210 (2001).
- Hochstrasser, M. SP-RING for SUMO: new functions bloom for a ubiquitin-like protein. Cell. , 5-8 (2001).
- Drag, M., Salvesen, G. S. DeSUMOylating enzymes-SENPs. IUBMB Life. 60, 734-742 (2008).
- Mukhopadhyay, D., Dasso, M. Modification in reverse: the SUMO proteases. Trends in Biochemical Sciences. 32, 286-295 (2007).
- Reverter, D., Lima, C. D. Structural basis for SENP2 protease interactions with SUMO precursors and conjugated substrates. Nature Structural & Molecular Biology. 13, 1060-1068 (2006).
- Shen, L., et al. SUMO protease SENP1 induces isomerization of the scissile peptide bond. Nature Structural & Molecular Biology. 13, 1069-1077 (2006).
- Horton, R., Strachan, E., Vogel, K., Riddle, S. A substrate for deubiquitinating enzymes based on time-resolved fluorescence resonance energy transfer between terbium and yellow fluorescent protein. Analytical Biochemistry. 360, 138-143 (2007).
- Mikolajczyk, J., et al. Small Ubiquitin-related Modifier (SUMO)-specific Proteases: PROFILING THE SPECIFICITIES AND ACTIVITIES OF HUMAN SENPs. Journal of Biological Chemistry. 282, 26217-26224 (2007).
- Kolli, N., Mikolajczyk, J., Drag, M., Mukhopadhyay, D., Moffatt, N., Dasso, M., Salvesen, G., Wilkinson, K. D. Distrubition and paralogue specificity of mammalian deSUMOylating enzymes. Biochem. J. , 335-344 (2010).
- Drag, M., Mikolajczyk, J., Krishnakumar, I. M., Huang, Z., Salvesen, G. S. Activity profiling of human deSUMOylating enzymes (SENPs) with synthetic substrates suggests an unexpected specificity of two newly characterized members of the family. Biochemical Journal. 409, 461 (2008).
- Engels, I. H., et al. A time-resolved fluorescence resonance energy transfer-based assay for DEN1 peptidase activity. Analytical Biochemistry. 390, 85-87 (2009).
- Martin, S., Hattersley, N., Samuel, I., Hay, R., Tatham, M. A fluorescence-resonance-energy-transfer-based protease activity assay and its use to monitor paralog-specific small ubiquitin-like modifier processing. Analytical Biochemistry. 363, 83-90 (2007).
- Nguyen, A. W., Daugherty, P. S. Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET. Nature Biotechnology. 23, 355-360 (2005).
