Summary
En ny fremgangsmåte som involverer kvantitativ analyse av FRET (Förster Resonance Energy Transfer) signaler er beskrevet for å studere enzymkinetikk.
Abstract
Reversible posttranslational modifikasjoner av proteiner med ubiquitin eller ubiquitin-lignende proteiner (Ubls) er mye brukt for å dynamisk regulere protein aktivitet og har forskjellige roller i mange biologiske prosesser. For eksempel endrer SUMO kovalent et stort antall eller proteiner med viktige roller i mange cellulære prosesser, herunder celle-syklus regulering, celle overlevelse og død, DNA skade respons, og stressrespons 1-5. SENP, som SUMO-spesifikk protease, til funksjoner som en endopeptidase i modning av SUMO forløpere eller som en isopeptidase fjerne SUMO fra sine target proteiner og oppdatere SUMOylation syklus 1,3,6,7.
Den katalytiske effektivitet eller spesifisitet av et enzym er best karakterisert ved forholdet mellom de kinetiske konstanter, k cat / K M. I flere studier har de kinetiske parametrene SUMO-SENP par blitt bestemt av ulike metoder, inkludert polyakrylamid gel-basert western-blot, radIOActive-merket substrat, fluorescerende stoff eller protein merket substrat 8-13. Men de polyakrylamid-gel-baserte teknikker, som brukte "innfødte" proteiner, men er arbeidskrevende og teknisk krevende, som ikke lett egner seg til detaljert kvantitativ analyse. Den oppnådde K cat / K M fra studier med tetrapeptid eller proteiner med en ACC (7-amino-4-carbamoylmetylcoumarin) eller AMC (7-amino-4-methylcoumarin) fluorofor var enten opptil to størrelsesordener lavere enn de naturlige substratene eller kan ikke tydelig skille ISO-og endopeptidase aktiviteter SENPs.
Nylig FRET-baserte protease analysene ble brukt til å studere deubiquitinating enzymer (Dubs) eller SENPs med FRET par cyan fluorescerende protein (CFP) og gule fluorescerende protein (YFP) 9,10,14,15. Forholdet mellom akseptor utslipp til donor utslipp ble brukt som den kvantitative parameter for FRET signal monitor for protease acduktivitet besluttsomhet. Men ignorert denne metoden signal tvers forurensing på akseptor og donor utslipp bølgelengder akseptor og donor selv fluorescens og dermed var ikke nøyaktig.
Vi utviklet en roman svært følsom og kvantitative FRET-baserte protease analysen for å bestemme kinetiske parametre av pre-SUMO1 modning av SENP1. En konstruert FRET pair CyPet og YPet med betydelig forbedret FRET effektivitet og fluorescens kvanteutbytte, ble brukt til å generere CyPet-(pre-SUMO1)-YPet substratet 16. Vi differensiert og kvantifisert absolutte fluorescens signaler bidratt av giver og akseptor og FRET på akseptor og utslipp bølgelengder, henholdsvis. Verdien av k cat / K M ble oppnådd som (3,2 ± 0,55) x10 7 M -1 s -1 av SENP1 mot pre-SUMO1, som er i overensstemmelse med generelle enzymatiske kinetikkparametrene. Derfor er denne metodikken gyldig og kan brukes etSA generell tilnærming til å karakterisere andre proteaser også.
Protocol
1. Plasmidkonstruksjoner
- Forsterke de åpne leserammer av gener med PCR, og klone PCR produkter i PCRII-TOPO vektor.
- Bekreft produktene ved sekvensering, og klone cDNA som koder CyPet-(pre-SUMO1)-YPet, CyPet-SUMO1, YPet og katalytiske domener av SENP1 inn i pET28 (b) vektoren med et N-terminalt hexahistidine tag.
2. Protein Expression og rensing
- Transformere Escherichia coli celler stamme BL21 (DE3) med pET28 (b) vektorer koder CyPet-(pre-SUMO1)-YPet, CyPet-SUMO1, YPet og katalytiske domener av SENP1.
- Vokst de transformerte bakterier i 2xYT medium i 3 timer ved 37 ° C (rysting ved 250 rpm) for å nå en optisk densitet på 0,5 ved 600 nm.
- Tilsett 100 uM isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) (endelig konsentrasjon) for å indusere proteinekspresjon og rist i 16 timer ved 25 ° C ved 200 rpm.
- Høste bakterier ved centrifugasjon ved 10.000 rpm ved 4 ° C i 5 min og resuspender dem i en buffer av 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 50 mM NaCl, og 5 mM imidazol.
- Sonicate cellene i 10 min i 5-sek intervaller ved en effektinnstilling på 25 W ved hjelp MiSonics 4000 sonikator og samle dem ved sentrifugering ved 35.000 xg ved 4 ° C i 30 min.
- Sett opp kolonnen med 500 ml Ni-NTA perler for en L kultur og overfør supernatanten inn i kolonnen.
- Vask harpiksen med buffer av 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 500 mM NaCl, og 10 mM imidazol to ganger.
- Eluer protein med buffer av 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 500 mM NaCl, og 500 mM imidazol og dialyse i en buffer av 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 50 mM NaCl og 1 mM ditiotreitol (DTT) ved 4 ° C over natten.
- Bestemme konsentrasjonene av de rensede proteiner ved Bradford-analysen. Alternativ metode for proteinkonsentrasjon målingene vil være SDS-PAGE gelelektroforese og deretter farget med Coomassie blå fulgt med avbildningkvantitative.
3. Kvantitativ FRET Spectrum Analysis
- Den generelle strategi for analysen var basert på FRET signalnettverk (Figur 1). Fret paret ble CyPet og YPet, knyttes til den N-og C-termini, henholdsvis, av pre-SUMO1. SENP1 spalter fusjonsproteinet CyPet-(pre-SUMO1)-YPet ved Gly-Gly-nettsted i SUMO1 C-terminus, og dermed frigjør SUMO halen med YPet. Fret signalet er forstyrret, noe som resulterer i en økning av utslipp fra CyPet og en dramatisk reduksjon av YPet utslippsbehov ved CyPet eksitasjonsbølgelengde.
- Når opphisset av lys med bølgelengde 414 nm, den totale fluorescens utslipp av CyPet-(pre-SUMO1)-YPet på 530 nm kan utledes fra tre kilder: den absolutte FRET-indusert YPet utslippsbehov, CyPet direkte utslipp og YPet direkte utslipp (Figur 2).
hvor FL 530/414 </ Sub> er den totale fluorescensemisjon på 530 nm når eksitert ved 414 nm, FL FRET er den absolutte FRET signal, er FL CyPet (forts) den CyPet direkte utslipp når spent på 414 nm, og FL YPet (forts) er YPet Direkte utslipp når spent på 414 nm. Senket av (forts) står for bidraget.
- Den direkte utslipp av CyPet på 530 nm var proporsjonal med dens emisjon ved 475 nm når eksitert ved 414 nm med et konstant forhold av α. CyPet-SUMO1 ble fremstilt i konsentrasjoner på 50, 100, 200, 500, og 750 nm og 1 mM , og utslipp på 475 og 530 nm ble målt etter magnetisering ved 414 nm for å bestemme α (figur 3-1).
- Den direkte utslipp av YPet på 530 nm i henhold eksitasjon ved 414 nm var proporsjonal til utslipp sin på 530 nm når eksitert ved 475 nm med et konstant forhold av β. YPet ble fremstilt i konsentrasjoner på 50, 100, 200, 500, 750 and 1000 nm, og utslipp på 530 nm ble målt når prøvene ble opphisset av bølgelengder fra 414 og 475 nm for å bestemme β (figur 3-2).
- Når CyPet-(pre-SUMO1)-YPet ble fordøyd av SENP1, spalting utgitt CyPet-SUMO1 og SUMO1 halen med YPet. Når forbindelsen var spent på 414 nm, ble fluorescensemisjonen ved 530 nm (FL '530/414) redusert, men kan fortsatt være delt i tre deler som:
hvor FL '530/414 er den totale fluorescensemisjon ved 530 nm etter fordøyelsen når eksitert ved 414 nm, FL' FRET er gjenværende absolutte FRET signalet, FL er 'CyPet (475/414) den CyPet emisjon ved 475 nm etter fordøyelsen når spent på 414 nm (her CyPet utslipp er fra to deler: ufordøyd CyPet-(pre-SUMO1)-YPet og fordøyd CyPet-SUMO1), og FL YPet(530/475) er YPet utslipp når spent på 475 nm, som er konstant enten CyPet-(pre-SUMO1)-YPet er fordøyd eller ikke.
- Etter fordøyelsen ved SENP1, de resterende FRET utslipp (FL 'FRET) er:
hvor C er den totale konsentrasjon av CyPet-(pre-SUMO1)-YPet og x er konsentrasjonen av fordøyd CyPet-(pre-SUMO1)-YPet.
- Ved å kombinere alle elementene, er det oppdaget fluorescensemisjon på 530 nm i henhold eksitasjon av 414 nm (FL '530/414):
4. FRET-baserte Protease Assay for Enzyme Kinetic Study
- CyPet-(pre-SUMO1)-YPet ble inkubert med det katalytiske domene av SENP1 ved 37 ° C i en buffer av 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 50 mM NaCl, 0,1% (v /v) Tween-20 og 1 mM DTT i et totalvolum på 80 ml og overført til 384-brønners plate.
- Forsøk ble utført ved å måle fluorescensemisjonen ved 475 og 530 nm etter en eksitasjon på 414 nm i et fluorescens multiwell plateavleser i 5 min med 15-sek intervaller.
- Reaksjonshastigheten (v) ble korrelert med endringen i mengden av substratet (S) som:
- Konsentrasjonen av produktet økte eksponentielt fra 0 som [S] 0 (opprinnelige substratkonsentrasjon) når t = 0:
- Når t = 0, er den opprinnelige hastighet (V 0):
- Den konsentration av SENP1 ble løst, og konsentrasjonen av CyPet-(pre-SUMO1)-YPet ble økt fra 100 ganger mer enn konsentrasjonen av enzymet, som kreves av Michaelis-Menten-ligningen.
- Alle de fluorescerende avlesninger ble analysert av kvantitative FRET analysemetode og plottet i GraphPad Prism V Programvare å passe Michaelis-Menten ligningen. Den ikke-lineær regresjon kan også utføres ved hjelp av mer vanlige programvarepakker som regnearkprogrammer (for eksempel Microsoft Excel).
5. Representant Resultater
Modning av pre-SUMO1 etter SENP1 kan bestemmes ved å overvåke endringer i fluorescens-signal ved 475 og 530 nm i løpet av prosessen. Resultatet viste at hastigheten av pre-SUMO1 fordøyelse ved SENP1 i et substrat-doseavhengig måte (figur 4). Dette tyder på at den katalytiske domenet SENP1 utstillinger utmerket aktivitet for pre-SUMO1 modning. Den opprinnelige reaksjonsjon lufthastigheter ble beregnet ved ovennevnte analyse med forskjellige substrat-konsentrasjoner (tabell 1).
K cat / K M forholdet er vanligvis brukt til å sammenligne effektiviteten av forskjellige enzymer med en substrat eller et spesielt enzym med forskjellige substrater. K M og V max kan fås fra Michaelis-Menten ligningen ved å plotte de ulike initielle hastigheter, tilsvarende til de forskjellige konsentrasjoner av CyPet-(pre-SUMO1)-YPet (figur 5) k katten ble oppnådd som.:
Ifølge ovennevnte analyse, var den beregnede K M 0,21 ± 0,04 uM, k katten var 6,90 ± 0,28 s -1, og K cat / K M forholdet var (3,2 ± 0,55) x10 7 M -1 > S -1.
Figur 1. Diagram over FRET-baserte protease analysen for SENP pre-sumos modning.
Figur 2. Kvantitativ analyse av fluorescerende signal som bidrag fra giveren, akseptor og gnage. Disseksjon av utslipp spektra fra CyPet-(pre-SUMO1)-YPet etter magnetisering ved 414 nm. FL CyPet (530/414) er CyPet er utslipp på 530 nm i henhold eksitasjon av 414 nm, FL FRET er FRET-indusert YPet utslipp på 530 nm i henhold eksitasjon av 414 nm, og FL YPet (530/414) er YPet er utslipp på 530 nm i henhold eksitasjon av 414 nm.
load/4430/4430fig3.jpg "/>
Figur 3. Beregning av retning utslippsfaktor α og β.
Figur 4. Kvantitativ analyse av CyPet-(pre-SUMO1)-YPet fordøyd av forskjellige forhold mellom det katalytiske domenet av SENP1. Reaksjonene ble overvåket i de første 5 min.
Figur 5. Michaelis-Menten grafisk analyse av CyPet-(pre-SUMO1)-YPet fordøyelse av SENP1. Data ble plottet og analysert av GraphPad Prism V og ikke-lineær regresjon.
| [S] (uM) | V 0 (uM / s) | ||
| 0.115 | 0,0023 ± 0,00005 | 0.214 | 0,0028 ± 0,00004 |
| 0.407 | 0,0033 ± 0,00007 | ||
| 0.594 | 0,0037 ± 0,00013 | ||
| 0.725 | 0,0043 ± 0,00012 | ||
| 1.471 | 0,0051 ± 0,00036 | ||
| 1.899 | 0,0050 ± 0,00031 | ||
| 2.300 | 0,0050 ± 0,00062 |
Tabell 1. Innledende hastigheter bestemmelse av pre-SUMO1 modning av SENP1. I hver substratkonsentrasjon ble fire prøver brukt til å måle fordøyelsen. Standardavviket kom fra variasjoner av disse fire prøver.
| K M (uM) | k cat (s-1) | k cat / k M (M -1 • s-1) |
| 0,21 ± 0,04 | 6,90 ± 0,28 | 3.2 ± 0.55 × 10 7 |
Tabell 2. Kinetikkparametre av pre-SUMO1 modning av SENP1 av kvantitativ FRET analyse. Standardavviket kom fra de fire prøvene i hver substratkonsentrasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
FRET teknologi har blitt brukt til å studere pre-SUMO1 modning av SENP1 9. CFP-YFP ble anvendt som FRET pair og Proporsjonal analyse, som er forholdet av akseptor til donor utslipp, ble brukt til å karakterisere de kinetiske egenskaper. Det er imidlertid ingen behandling av donor og akseptor selvstendig fluorescens i den tradisjonelle Proporsjonal FRET analyse. Forholdet ikke direkte korrelerer med mengden av fordøyd substrat.
Her rapporterer vi en utviklet svært følsomme FRET-baserte protease analysen for å studere den kinetiske av pre-SUMO1 modning av SENP1. I motsetning til den forrige Proporsjonal tilnærming, vi fundamentalt forbedret metode med en ny teori for FRET signal for kinetisk analyse og en eksperimentell prosedyre for å utlede kinetiske parametere ved å bestemme de kvantitative bidrag av selv-fluorescens fra donor og akseptor, og den virkelige FRET- indusert akseptor er utslipp. Proporsjonal analyse kan ikke gjøre dette. Denuvitenhet av selvtillit fluorescerende utslipp av donor og akseptor kan føre til en overvurdering av FRET signalet og donor utslipp. De overestimations kanskje ikke i stor grad påvirke den endelige k cat / K M ratio (3,81 x10 7 M -1 s -1 for Proporsjonal analyse, 3,2 x10 7 M -1 s -1 ved vår kvantitative FRET analyse), men effekten er mer opplagt når man studerer de enkelte parametre, K M (0.098 vs 0,21 mikroM) og k katt (3,43 s -1 vs 6,90 s -1), som er viktig for å avgjøre det hastighetsbegrensende trinn og hemmer potens av enzymer.
Metoden vi rapporterer her er en ett-trinns analyse av protease kinetikk parametere og krever kun molekylær kloning og protein uttrykk uten radioaktiv merking eller dyre instrumenter. Den ett-trinns prosedyre ikke bare forenkler eksperimentelle prosedyren, men også begrenser myevariasjoner. De fluorescerende-kodede proteiner er i den vandige fase, som er vanligvis lik deres naturlige miljø i celler. Fluorescensintensitet kan bestemmes ved generell fluorescensspektroskopi eller fluorescens plate lesere som er allment tilgjengelige. Sammenlignet med den tradisjonelle "gel-basert"-metoden, og tilbyr våre FRET-baserte protease analysen flere fordeler, blant annet økt følsomhet, real-time måling, og mindre tid og arbeid er nødvendig. Videre metodikk og fremgangsmåte av protease kinetikk parameter bestemmelser er miljøvennlige og ikke-farlige materialer, som for eksempel radioisotoper eller sterke kjemikalier. I tillegg, kan den meget følsomme FRET-baserte analysen brukes i høy gjennomstrømming biologiske analyser, for eksempel proteasehemmer screenings. Den kinetiske undersøkelsen kan også brukes til å karakterisere egenskapene til de hemmere (f.eks Ki, IC50).
Derfor den svært følsomme kvantitative FRET-based protease analyser kan være et kraftig tilnærming i utviklingen genom-wide protease-substrat profilering og hemmer screenings.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi er veldig takknemlig til Victor GJ Rodgers for verdifulle råd. Vi takker alle medlemmer av Liao gruppe for svært nær samarbeid og for å få hjelp med denne studien. Denne studien ble støttet av National Institutes of Health (Grant AI076504 til JL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR II TOPO Kit | Invitrogen | K466040 | |
| 2xYT | Research Products Internationa.l Corp. | X15600 | |
| Ni-NTA Agrose | Thermo Scientific | 88222 | |
| Coomassie plus (Bradford) Assay Regent | Thermo Scientific | 23238 | |
| 384-well plate (glass bottom) | Greiner | 781892 | |
| FlexStation II 384 plate reader | Molecular Device |
References
- Johnson, E. S. Protein modification By SUMO. Annual Review of Biochemistry. 73, 355-382 (2004).
- Gill, G. SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms. Genes & Development. 18, 2046-2059 (2004).
- Hay, R. T. SUMO: a history of modification. Molecular Cell. 18, 1-12 (2005).
- Müller, S., Hoege, C., Pyrowolakis, G., Jentsch, S. SUMO, ubiquitin's mysterious cousin. Nature. , 202-210 (2001).
- Hochstrasser, M. SP-RING for SUMO: new functions bloom for a ubiquitin-like protein. Cell. , 5-8 (2001).
- Drag, M., Salvesen, G. S. DeSUMOylating enzymes-SENPs. IUBMB Life. 60, 734-742 (2008).
- Mukhopadhyay, D., Dasso, M. Modification in reverse: the SUMO proteases. Trends in Biochemical Sciences. 32, 286-295 (2007).
- Reverter, D., Lima, C. D. Structural basis for SENP2 protease interactions with SUMO precursors and conjugated substrates. Nature Structural & Molecular Biology. 13, 1060-1068 (2006).
- Shen, L., et al. SUMO protease SENP1 induces isomerization of the scissile peptide bond. Nature Structural & Molecular Biology. 13, 1069-1077 (2006).
- Horton, R., Strachan, E., Vogel, K., Riddle, S. A substrate for deubiquitinating enzymes based on time-resolved fluorescence resonance energy transfer between terbium and yellow fluorescent protein. Analytical Biochemistry. 360, 138-143 (2007).
- Mikolajczyk, J., et al. Small Ubiquitin-related Modifier (SUMO)-specific Proteases: PROFILING THE SPECIFICITIES AND ACTIVITIES OF HUMAN SENPs. Journal of Biological Chemistry. 282, 26217-26224 (2007).
- Kolli, N., Mikolajczyk, J., Drag, M., Mukhopadhyay, D., Moffatt, N., Dasso, M., Salvesen, G., Wilkinson, K. D. Distrubition and paralogue specificity of mammalian deSUMOylating enzymes. Biochem. J. , 335-344 (2010).
- Drag, M., Mikolajczyk, J., Krishnakumar, I. M., Huang, Z., Salvesen, G. S. Activity profiling of human deSUMOylating enzymes (SENPs) with synthetic substrates suggests an unexpected specificity of two newly characterized members of the family. Biochemical Journal. 409, 461 (2008).
- Engels, I. H., et al. A time-resolved fluorescence resonance energy transfer-based assay for DEN1 peptidase activity. Analytical Biochemistry. 390, 85-87 (2009).
- Martin, S., Hattersley, N., Samuel, I., Hay, R., Tatham, M. A fluorescence-resonance-energy-transfer-based protease activity assay and its use to monitor paralog-specific small ubiquitin-like modifier processing. Analytical Biochemistry. 363, 83-90 (2007).
- Nguyen, A. W., Daugherty, P. S. Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET. Nature Biotechnology. 23, 355-360 (2005).
