Quantitative FRET (transfert de Förster Resonance Energy) Analyse de la protéase SENP1 Kinetics Détermination

Résumé

Une nouvelle méthode qui analyse quantitative de FRET (Förster Resonance Energy Transfer) des signaux est décrite pour l'étude de la cinétique enzymatique. K _{M Et K Cat Ont été obtenus pour l'hydrolyse du domaine catalytique de SENP1 (SUMO / sentrine protéase spécifique 1) de pré-SUMO1 (Small Ubiquitin-comme modificateur). Les principes généraux de cette étude quantitative-FRET à base de protéase cinétique peut être appliquée à d'autres protéases.}

Résumé

Réversibles modifications post-traductionnelles des protéines avec des protéines ubiquitine ou l'ubiquitine-like (UBLS) sont largement utilisés pour réguler dynamiquement l'activité des protéines et jouent des rôles divers dans de nombreux processus biologiques. Par exemple, SUMO modifie de façon covalente un grand nombre ou des protéines avec des rôles importants dans de nombreux processus cellulaires, y compris les cellules cycle de régulation, la survie cellulaire et la mort, la réponse dommages à l'ADN et de réponse au stress 1-5. SENP, comme SUMO protéase spécifique, fonctionne comme une endopeptidase dans la maturation de précurseurs ou sous forme SUMO isopeptidase pour supprimer SUMO de ses protéines cibles et actualiser le cycle ^1,3,6,7 SUMOylation.

L'efficacité ou la spécificité catalytique d'une enzyme est mieux caractérisée par le rapport des constantes cinétiques k _cat / _K m. Dans plusieurs études, les paramètres cinétiques de SUMO-SENP paires ont été déterminées par des méthodes différentes, y compris en gel de polyacrylamide à base de western-blot, radIOActive substrat marqué, un composé fluorescent ou une protéine marquée substrat ^8-13. Cependant, les techniques de polyacrylamide à base de gel, qui étaient les «indigènes» des protéines, mais sont laborieux et techniquement exigeant, qui ne se prêtent pas facilement à une analyse quantitative détaillée. Le obtenues k _cat / K _M d'études utilisant tétrapeptides ou des protéines avec un ACC (7-amino-4-carbamoylmetylcoumarin) ou AMC (7-amino-4-méthylcoumarine) fluorophore étaient soit jusqu'à deux ordres de grandeur plus faible que les substrats naturels ou ne peut pas distinguer clairement les activités et les iso-endopeptidase de SENPs.

Tests de protéase récemment, à base de FRET ont été utilisés pour étudier les enzymes désubiquitination (DUB) ou SENPs avec la paire FRET de la protéine fluorescente cyan (CFP) et la protéine fluorescente jaune (YFP) ^9,10,14,15. Le taux d'émission de l'accepteur d'émission du donneur a été utilisé en tant que paramètre quantitatif de FRET signal de contrôle en courant alternatif pour la protéasetivité détermination. Cependant, cette méthode de signaux ignorés contaminations croisées à l'accepteur et donneur d'onde d'émission accepteur et donneur d'auto-fluorescence et donc n'était pas exacte.

Nous avons développé un roman très sensible et quantitative dosage de protease FRET basée sur la détermination des paramètres cinétiques de la pré-SUMO1 maturation par SENP1. Une ingénierie FRET CyPet paire et avec YPet considérablement amélioré l'efficacité et la fluorescence FRET rendement quantique, ont été utilisés pour générer le CyPet-(pré-SUMO1)-YPet substrat ^16. Nous avons distingué et quantifiés absolues des signaux de fluorescence apportées par le donneur et l'accepteur et FRET aux longueurs d'onde d'émission et accepteurs, respectivement. La valeur de k _cat / K _M a été obtenu comme (3,2 ± 0,55) x 10 ⁷ M ^-1 s ^-1 SENP1 vers pré-SUMO1, qui est en accord avec les généraux paramètres cinétiques enzymatiques. Par conséquent, cette méthode est valable et peut être utilisésa approche générale pour caractériser d'autres protéases ainsi.

Protocole

1. Constructions plasmidiques

1. Amplifier les cadres ouverts de lecture des gènes par PCR et le clonage des produits PCR dans pCRII-TOPO vecteur.
2. Confirmer les produits de séquençage, et cloner l'ADNc codant pour CyPet-(pré-SUMO1)-YPet, CyPet-SUMO1, et YPet domaines catalytiques de SENP1 dans l'pET28 (b) avec un vecteur étiquette hexahistidine N-terminale.

2. Expression et purification des protéines

1. Transformer des cellules d'Escherichia coli de la souche BL21 (DE3) avec pET28 (b) des vecteurs codant CyPet-(pré-SUMO1)-YPet, CyPet-SUMO1, YPet et les domaines catalytiques de ....

Discussion

FRET technologie a été utilisée pour étudier la maturation pré-SUMO1 par SENP1 ^9. CFP-YFP a été utilisé comme la paire FRET et l'analyse ratiométrique, qui est le rapport de l'accepteur d'émissions de bailleurs de fonds, a été utilisé pour caractériser les propriétés cinétiques. Cependant, il n'ya aucune considération de donneur et accepteur d'auto-fluorescence dans le ratiométrique traditionnelle analyse FRET. Le rapport n'est pas directement corrélée avec la quantité de substrat digé.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue
II TOPO PCR Kit	Invitrogen	K466040
2xYT	Recherche sur les produits Internationa.l Corp	X15600
Ni-NTA agarose	Thermo Scientific	88222
Coomassie plus (Bradford) Regent Assay	Thermo Scientific	23238
Plaque de 384 puits (à fond de verre)	Greiner	781892
FlexStation II 384 lecteur de plaque	Appareil moléculaire