Summary
في هذه الورقة، ونحن تصف طريقة مفيدة لدراسة يجند القناة الايونية بوابات وظيفة الخلايا العصبية في الدماغ من شرائح معزولة تماما. هذا الأسلوب ينطوي على استخدام المخدرات micropipette مليئة للاستخدام الموضعي من الأدوية إلى الخلايا العصبية باستخدام معيار تقنيات سجلت المشبك التصحيح.
Abstract
تعاطي التبغ يؤدي إلى مشاكل صحية عديدة، بما في ذلك السرطان وأمراض القلب وانتفاخ الرئة، والسكتة الدماغية. الإدمان على تدخين السجائر هو اضطراب السائد العصبية والنفسية التي تنبع من الإجراءات الفيزيائية الحيوية والخلوية من النيكوتين على مستقبلات النيكوتين أستيل (nAChRs) في جميع أنحاء الجهاز العصبي المركزي. فهم أنواع فرعية مختلفة nAChR التي توجد في مناطق الدماغ ذات الصلة لإدمان النيكوتين هو أولوية رئيسية.
التجارب التي تستخدم تقنيات الكهربية مثل المشبك التصحيح خلية كاملة أو ثنائية القطب التسجيلات المشبك الجهد مفيدة لتوصيف الدوائية للnAChRs المصالح. يتم عزل الخلايا جسديا nAChRs التعبير عن مثل الثدييات خلايا البويضات أو زراعة الأنسجة القيطم المورق، وبالتالي فهي تدرس بسهولة باستخدام أدوات علم الأدوية الحديثة. وقد أحرز تقدم كبير باستخدام هذه التقنيات، وخاصة عندما كان معروفا بالفعل لمستقبلات الهدفوقد تحقق بسهولة الثانية خارج الرحم التعبير. في كثير من الأحيان، ومع ذلك، فمن الضروري دراسة nAChRs في بيئتها الأصلية: في الخلايا العصبية داخل الدماغ شرائح تحصد تماما من الفئران المختبرية أو الفئران. على سبيل المثال، الفئران معربا عن "الحساسية" مفارز nAChR مثل الفئران L9'A α4 1 و الفئران α6 L9'S 2، تسمح لتحديد لا لبس فيها من الخلايا العصبية على أساس التعبير الوظيفية من حدة فرعية nAChR محددة. على الرغم من القيام به بشكل روتيني خلية كاملة التسجيلات المشبك التصحيح من الخلايا العصبية في الدماغ من قبل شرائح الكهربية المهرة، فإنه يمثل تحديا لتطبيق محليا المخدرات مثل النيكوتين أستيل أو إلى داخل الخلية سجلت شريحة الدماغ. التخفيف من المخدرات إلى superfusate (تطبيق حمام) لا يمكن عكسها بسرعة، ولا U-أنبوب نظم تتكيف بسهولة للعمل مع شرائح الدماغ.
في هذه الورقة، ونحن تصف طريقة لتطبيق بسرعة nAChR-تفعيل المخدرات إلى الخلايا العصبية المسجلة في م الكبار[أوس] شرائح الدماغ. يتم إجراء القياسية خلية كاملة من الخلايا العصبية في التسجيلات شرائح، وناور لmicropipette الثانية المملوءة دواء من الاهتمام إلى موقف بالقرب من الخلية المسجلة. حقنة من الهواء المضغوط أو النيتروجين خامل في ماصة المخدرات مليئة يسبب كمية صغيرة من المخدرات حل يمكن إخراجه من ماصة على الخلية المسجلة. باستخدام هذا الأسلوب، nAChR بوساطة تيارات قادرة على أن تحل بدقة ميلي ثانية واحدة. يمكنك بسهولة تطبيق مرات المخدرات أن تختلف، ويمكن سحب ماصة المخدرات مليئة واستبدالها ماصة جديدة، والسماح لأن يتم إنشاء منحنيات التركيز والاستجابة لالخلايا العصبية واحدة. على الرغم من وصفها في سياق بيولوجيا الأعصاب nAChR، ينبغي أن تكون مفيدة هذه التقنية لدراسة أنواع عديدة من القنوات الأيونية يجند بوابات أو المستقبلات في الخلايا العصبية من الدماغ شرائح.
Protocol
1. إعداد حلول لإعداد شريحة الدماغ والكهربية
- وقد وصفت سابقا الحلول لإعداد شرائح الدماغ 3 و 4. إعداد N-D-glucamine الميثيل (NMDG) على أساس القطع والانتعاش الحل للتكوين التالية (مم): 93 ن ميثيل D-glucamine، 2.5 بوكل، 1.2 ناه 2 PO 4 و 30 NaHCO 3 و 20 HEPES، 25 الجلوكوز، 5 أسكوربات + نا (2)، ثيوريا، 3 البيروفات + نا، 10 MgSO 4 • 7H 2 O، 0.5 CaCl 2 • 2H 2 O. التكيف مع 300-310 الميلي أسمول مع NMDG. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7،3-7،4 مع حمض الهيدروكلوريك N 10.
- حل MgSO 4 • 7H 2 O وCaCl 2 • 2H 2 O في الماء لجعل ميليبور 2 حلول الأسهم M لكل منها.
- تزن من المكونات الأخرى حسب الترتيب المسرود وإضافة إلى تعبئة القارورة الحجمية جزئيا مع الماء مع التحريك ميليبور حل. مرة واحدة يتم إضافة كل شيء، وملءالحجمي قارورة مع الماء ميليبور.
- قياس درجة الحموضة وحمض الهيدروكلوريك مع ضبط N 10.
- قياس وضبط الأسمولية مع NMDG إذا لزم الأمر.
- إعداد عقد HEPES السائل النخاعي الاصطناعي (ACSF) من التشكيل التالي (مم): 92 كلوريد الصوديوم، 2.5 بوكل، 1.2 ناه 2 PO 4 و 30 NaHCO 3 و 20 HEPES، 25 الجلوكوز، 5 أسكوربات + نا (2)، ثيوريا، 3 نا + البيروفات، 2 MgSO 4 • 7H 2 O، 2 CaCl 2 • 2H 2 O. التكيف مع 300-310 الميلي أسمول مع السكروز. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7،3-7،4 مع حمض الهيدروكلوريك هيدروكسيد الصوديوم أو N 1.
- تزن من المكونات في الترتيب المسرود وإضافة إلى تعبئة القارورة الحجمية جزئيا مع الماء مع التحريك ميليبور حل. مرة واحدة يتم إضافة كل شيء، وملء القارورة الحجمية بالماء ميليبور.
- قياس درجة الحموضة وضبط مع هيدروكسيد الصوديوم أو حمض الهيدروكلوريك إذا لزم الأمر.
- قياس وضبط الأسمولية مع السكروز إذا لزم الأمر.
- إعداد معيار حل ACSF من تسجيل على التشكيل التالي (مم): 124 كلوريد الصوديوم، 2.5 بوكل، 1.2 ناه O. 2 PO 4 و 24 NaHCO 3، 12،5 الجلوكوز، 2 MgSO 4 • 7H 2 O، 2 CaCl 2 • 2H 2 التكيف مع 300-310 الميلي أسمول مع السكروز. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7،3-7،4 مع حمض الهيدروكلوريك هيدروكسيد الصوديوم أو N 1.
2. إعداد شرائح الدماغ الحادة
- تتم الدماغ قطع شريحة والانتعاش كما هو موضح سابقا 3 و 4. أطباق الكريستال فقاعة مليئة 2 NMDG الانتعاش الحل مع الأكسجين 95٪ / 5٪ CO غاز 2 (كربوجين)، طبق واحد على الجليد، والآخر في 33 ° C.
- طبق فقاعة الكريستال احدة مليئة HEPES عقد ACSF مع كربوجين في درجة حرارة الغرفة.
- تخدير الماوس الكبار (تتراوح أعمارهم بين 2 إلى 12 شهرا) مع نا + بنتوباربيتال (200 ملغ / كغ، والملكية الفكرية). المضي قدما في الإجراء عند الحيوان لا يوجد لديه استجابة لقرصة أخمص قدميه.
- إذا لزم الأمر، وقطع الذيل لعينة الأنسجة genotyp في وقت لاحقجي للحيوان.
- فتح تجويف الصدر، تعرض القلب، والشريان الأورطي النازل المشبك. ممزق الأذين الأيمن.
- يروي Transcardially الحيوانية مع مل 5-10 من 0-4 ° حل NMDG لاسترداد C.
- قطع رأس الحيوان، وإزالة الدماغ ووضعه في 4 ° حل NMDG لاسترداد C لمدة 1 دقيقة.
- على صفيحة معدنية الجليد المبردة، وتقليم الدماغ في الاتجاه المطلوب (الاكليلية، مجاور للسهمي، أفقي، وما إلى ذلك) لتشمل مجال الاهتمام.
- يضعوا كتلة الدماغ مع superglue إلى السطح مرحلة تقطيع اللحم الجاف لتهتز (DSK الصفر 1؛ Dosaka)، يغرق كتلة الدماغ في 4 ° C NMDG لاسترداد الحل، والحل فقاعة مستمر مع كربوجين.
- قطع شرائح من منطقة الدماغ من الفائدة. سمك شريحة هو 200-400 ميكرون، اعتمادا على المنطقة الدماغ المحددة التي تهم، العمر الحيوان، والتجربة التي يتعين القيام بها.
- مباشرة بعد القطع، احتضان شرائح المطلوب في carbogenated، 33 ° C NMDG لاسترداد solutiعلى لبالضبط 12 دقيقة، ثم نقل إلى carbogenated، HEPES عقد درجة حرارة الغرفة حل لفترة أولية مدتها 60 دقيقة. بعد هذا حضانة 60 دقيقة، يمكن استخدام شرائح للتسجيل. يتم الاحتفاظ شرائح HEPES في حل عقد على مدار اليوم حتى يتم استخدامها للتسجيل.
3. تسجيل التصحيح المشبك من الخلايا العصبية في الدماغ شرائح
- سحب micropipette التصحيح القياسية مع مجتذب المشتعلة براون للبرمجة (سوتر P-97 أو الرأسي مجتذب ما يعادلها). ماصات التي هي الأمثل لتشكيل ختم جيجا أوم المقاومة وعادة ما يكون من 4-6 MΩ
- نقل شريحة واحدة إلى غرفة التسجيل (RC-27L، آلات وارنر) على مسرح المجهر تستقيم (نيكون FN-1). superfuse باستمرار (1،5 حتي 2،0 مل / دقيقة) مع شريحة carbogenated، ACSF القياسية تسجيل والحفاظ على تسخين 32 ° C. وبدلا من ذلك، يمكن الحفاظ على شرائح في درجة حرارة الغرفة.
- تحديد موقع ومركز منطقة الدماغ ذات الاهتمام الخاصهدف الهواء 10X (نيكون خطة فلور 10X؛ NA 0.3؛ WD: 16 مم).
- اتهم متصلة المقابل تدخل IR-الفرق (DIC) البصريات وعالية السرعة بالقرب من الأشعة تحت الحمراء جهاز يقترن تصور الخلايا العصبية الفردية باستخدام الأشعة تحت الحمراء القريبة 40X الغمر بالماء (IR) الهدف (3.5 ملم نيكون APO 40XW؛:؛ NA WD 0.80) (CCD) كاميرا فيديو (C-7500 هاماماتسو). تحت IR-DIC المراقبة، والخلايا العصبية السليمة يحمل على نحو سلس، غشاء البلازما رمادي فاتح.
- ملء micropipette مع حل التسجيل داخل الخلايا مناسب. بالنسبة لمعظم التطبيقات، ونحن نستخدم الحل التالي (مم): 135 غلوكونات البوتاسيوم، 5 EGTA، 0.5 CaCl 2، 2 MgCl 2 و 10 HEPES، 2 ملغ-ATP، و 0.1 GTP (درجة الحموضة تعديلها إلى 7.25 مع قاعدة تريس، الأسمولية تعديل إلى 290 الميلي أسمول مع السكروز). إنشاء تسجيل خلية كاملة من الخلايا العصبية تصور.
4. تطبيق أدوية المحلية إلى الخلايا العصبية في شرائح
- سحب المشبك التصحيح القياسية micropipette كما هو موضح أعلاه. باستخداممجتذب ماصة مثل سوتر P-97 التي ينتج اثنين متطابقة "الشقيقة" نصائح من نفس قطعة من الزجاج هو مفيد عندما المخدرات حلول متعددة لاستخدامها في الخلية نفسها. تلميح الأحجام التي من شأنها أن يكون لها مقاومة ~ 5 MΩ إذا أنها كانت تملأ الحل داخل الخلايا المذكورة أعلاه هي الأمثل.
- الردم وmicropipette بمحلول مكون من المخدرات مخففة في carbogenated، ACSF تسجيل القياسية. ويشير الطرف الأسفل، ونفض الغبار micropipette المخدرات مملوءة لإزالة أي فقاعات الهواء المحبوس في العمود من الحل.
- تحميل micropipette المخدرات مليئة في حامل ماصة متصلة مع أنابيب الضغط لنظام طرد مناسبة، مثل III Picospritzer (عام شركة صمام). يجب أن يتم تنظيمها حامل ماصة في الصعود إلى مياداة مجهرية لهذا القرار نفس المتلاعبين تستخدم عادة لتسجيل المشبك التصحيح (على سبيل المثال، سوتر MP-285). بالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن تتلاعب تسمح للحركة داخل وخارج قطر للشريحة. رجلإخراج ually الضغط 3 إلى 4 مرات في micropipette من أجل بناء الضغوط الكافية وراء عمود من السوائل.
- باستخدام عناصر التحكم مياداة مجهرية، وانخفاض ماصة المخدرات في حين تصور شريحة غيض تحت IR-DIC البصريات. من الناحية المثالية، ينبغي للمرء تحديد البصر ومركز الخلايا العصبيه التي سيتم تسجيلها من، تليها المواقع من المخدرات بالقرب من ماصة الخلية قبل تخفيض micropipette تسجيل في شريحة. يمكن تحديد المواقع ماصة المخدرات تسبب حركة الأنسجة في محيط الخلية مسجل يمكن ان تعطل تسجيل إذا تم نقل ماصة المخدرات في موقف بعد إنشاء ختم gigaohm.
- باستخدام الفيديو IR، ضع micropipette المخدرات على السطح العلوي للشريحة الأنسجة. تنفيذ واحدة طرد الضغط ورصد 1) على مقربة من الحافة لحركة الحطام المتصلة طرد، و 2) الطرف micropipette عن أي دلائل أن انسداد تلميح أو مسدودة. إذا تم حظر غيض / انسداد، التراجع عن pipettه واستبدالها بأخرى جديدة.
- الاقتراب من الخلية مسجل قطريا من الجزء العلوي من شريحة بحيث عندما تكون في موقف نهائي، غيض من ماصة المخدرات مملوءة هو 1) في الطائرة التنسيق نفسه (أو أقل قليلا) كما سجلت الخلية وغيض من القطب تسجيل ، و 2) 10 حتي 40 ميكرون من الخلية المسجلة. إذا غيض ماصة المخدرات مملوءة هو أعلى الخلية المسجلة، يمكن لقوة الضغط من طرد تعطيل ختم gigaohm.
- تسجيل الاستجابة المطلوبة الخلوية في حين عقد الخلية في وضع المشبك الجهد أو التيار وضع المشبك. نسجل بشكل روتيني أستيل و / أو النيكوتين أثار التيارات الخلوية أثناء الضغط الخلايا العصبية في وضع المشبك الجهد. على الرغم من أن يمكن أن تسبب طرد ضغط يدويا عند استخدام III Picospritzer، من أجل البحث استنساخه فإنه من المستحسن لتشغيل طرد الضغط باستخدام نظام الحصول على (أكسون Digidata 1440 وpClamp 10.3) مع نبض TTL الرقمية.
5. السيطرةوMicropipette المخدرات مليئة مترجم كهرضغطية
- إذا كان ذلك ممكنا، تحميل حامل ماصة المخدرات مملوءة لمترجم واحد البعد كهرضغطية (مثل Piezojena PA-100 أو بيرلي PZM-150) التي هي قادرة على قبول المدخلات الجهد التناظرية (مرة أخرى، من نظام الحصول على)، والذي هو ثم شنت على لمياداة مجهرية عالية الدقة (سوتر MP-285). A مترجم كهرضغطية مفيد لأنه يمكن لحركة ماصة المخدرات مملوءة داخل وخارج الشريحة، بما في ذلك توقيت وسرعة الدخول / الخروج، وتسيطر بسهولة أكبر مستنسخة من التجربة في تجربة. عند دراسة nAChRs، وآثار مزيل للتحسس من تسرب النيكوتين من المخدرات ماصة مملوءة، إذا ما وقعت أي وقت مضى، إلى أدنى حد ممكن عند نقل فقط ماصة بالقرب من الخلية مع مترجمة كهرضغطية لحظة طرد الضغط.
- باستخدام الجهد يدويا التي تسيطر عليها مكبر للصوت على السيطرة على الجهد كهرضغطية، اطلب الجهدإلى قيمته القصوى.
- باستخدام مياداة مجهرية، ضع ماصة المخدرات مليئة في شريحة حيث سيتم إخراج ماصة محتوياته على الخلية المسجل، وسحب ماصة عن طريق تخفيض الجهد يدويا إلى الصفر على مكبر للصوت الجهد السيطرة كهرضغطية.
- باستخدام إشارة خرج التناظرية من تسجيل نظام حيازة، نقل المخدرات ماصة مملوءة إلى شريحة على مدى فترة من 250 ميللي ثانية ابتداء 300 ميللي ثانية قبل ضغط طرد TTL نبض يحدث. سحب ماصة على مدى فترة من 250 ميللي ثانية، ابتداء 50 ميللي ثانية بعد انتهاء نبض TTL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في تجاربنا، ونحن بشكل روتيني من تسجيل الدوبامين (DA) الخلايا العصبية المنتجة للفي المنطقة الجوفية السقيفية (VTA) والمادة السوداء الجزء المكتنزة (SNC). في الجهد المشبك واسطة، وتطبيق ضغط أستيل النيكوتين أو لهذه الخلايا يؤدي عادة في السريع، الموجبة الحالية التي تصل إلى ذروتها الداخل 100-200 ميللي ثانية في (الشكل 1A-B). وأملت إلى حد كبير من تسوس الحالي بنسبة انتشار المخدرات من موقع العمل، وعما إذا كانت الإنزيمات في شريحة موجودة على استقلاب الدواء في شكل غير نشط. على سبيل المثال، هو أدن تشافيز تحلل بسرعة عن طريق acetylcholinesterases الموجودة على سطح الخلايا في مناطق الدماغ التي هي غنية في الخلايا العصبية DA 5. وهذا يؤدي إلى تسوس السريع للتيار أثار (الشكل 1A). في المقابل، لا تحلل النيكوتين هو النيكوتين وأثار التيارات لا تتحلل بسرعة، كما أدن تشافيز أثار التيارات (1B الشكل)، مما يسمح لها بقوة أكتيفيأكلون وتوعي nAChRs 6.
نظم طرد ضغط يسمح للمشغل لتغيير الوقت من ضغط النبض. هذه الميزة مفيدة في دراسة nAChRs على سطح الخلايا العصبية داخل الدماغ شرائح، لأنه يتيح للمحقق لتحديد ما إذا كان قد تم تحقيق الحد الأقصى الحالي أثار ردا على نبض المخدرات. على سبيل المثال، آثار اثنين في 2 إظهار أن 250 ميللي ثانية الشكل من التطبيق المخدرات (رمادي التتبع) قد أو قد لا تكشف عن وجود أثار نهائي الأقصى الحالية، في حين ميللي ثانية من 1000 تطبيق المخدرات (أسود التتبع) تعطي أقصى اضحة الحالية بالإضافة إلى بعض ثابت الدولة الحساسية. حل "الذروة" هذه التيارات أمر بالغ الأهمية عند بناء دقيق التركيز على الاستجابة منحنى، أو عند دراسة الحساسية nAChR.
الخلايا العصبية في المخ الأوسط DA بطني إطلاق إمكانات العمل في كثير من الأحيان عندما سجلت عفوية ضمن شرائح الدماغ الحاد 7 و 8. الفئران α6 L9، والذي السابقيناضغط nAChRs التي تستجيب بقوة 10 إلى 100-أضعاف تركيزات أقل من النيكوتين أو أدن تشافيز 2، 9-11، تظهر زيادة في تنقل استجابة لحقن النيكوتين. لربط نشاط الخلايا العصبية (العمل اطلاق المحتملة) مع السلوك، من المفيد تطبيق النيكوتين إلى خلايا عصبية DA α6 L9 المسجل في وضع المشبك الجاري. عادة، سوف تطبق على المستوى المحلي من النيكوتين (1 ميكرومتر) لالخلايا العصبية DA α6 L9'S يؤدي إلى تسارع وعابرة على اطلاق أن يضمحل إلى خط الأساس داخل ثوانى 30-40 2 (الشكل 3، لوحة العلوي). هذه الاستجابات على النيكوتين هي قابلة للقياس الكمي بسهولة (الشكل 3، اللوحة السفلى) مع برامج التحليل المناسب (على سبيل المثال pClamp؛ الجزيئية الأجهزة كورب).
تجارب في الخلايا المستزرعة أو البويضات القيطم مع nAChRs أعرب ectopically تتمتع بميزة التي يمكن تطبيقها سلسلة من تركيزات المخدرات إلى كل خلية سجلت 12. فيالخلايا العصبية داخل الدماغ شرائح، وعادة منحنى التركيز والاستجابة غير ممكن، وغالبا ما يتم الإبلاغ عن الردود على تركيز واحد من المخدرات 1. ومع ذلك، يمكن ماصة المخدرات مملوءة كما هو موضح في هذه الورقة تغيرت مرارا للسماح لتركيزات متعددة من المخدرات ليتم تطبيقها على خلية تم تسجيلها خلال نفس شريحة الدماغ 2 و 8 و 13 و 14. ويبين الشكل 4 بيانات تمثيلية من واحد الخلايا العصبية DA التي تم تسجيلها حفز مع ثلاثة تركيزات أدن تشافيز. تجربة المحقق، جنبا إلى جنب مع درجة عالية من الاستقرار مياداة مجهرية عقد ماصة المخدرات مملوءة، من العوامل التي تؤدي إلى نجاح حاسم في هذا النوع من التجارب. عندما ناجحة، فإن هذا النهج يوفر معلومات قيمة عن nAChRs الدوائية المحلية.
وغالبا ما تصنف الخلايا العصبية في الدماغ شرائح، بما في ذلك أنواع الخلايا uncharacterized أو تلك الموجودة في مناطق الدماغ التي يبلغ عدد سكانها غير متجانسة، وذلك باستخدام مختلف ايلى الأساسيةctrophysiological و / أو تدابير المورفولوجية 15. على سبيل المثال، والتعبير عن I ح الحالية، وإمكانات غشاء الراحة، عفوية معدل إطلاق النار، وحجم الخلية هي التدابير المعتادة المستخدمة لوصف الخلايا العصبية DA 2 و 7 و 8 و 16 و 17. باستخدام طريقة لدينا، فمن الممكن أيضا أن تميز الخلايا العصبية على أساس استجابتها للنيكوتين محليا أو أدن تشافيز تطبيق 18 و 19. على سبيل المثال، أكيمة متفوقة (SC) هي منطقة الدماغ وغير متجانسة نسبيا مع uncharacterized التعبير عالية للغاية من nAChRs المختلفة، بما في ذلك تلك التي تحتوي على الوحدات الصغرى α6 20. في شرائح المخ من الفئران L9'S α6، سجلنا من الخلايا العصبية SC عدة والنيكوتين تطبيق (1 ميكرومتر) باستخدام الضغط طرد النيكوتين مع ماصة شغلها. نوعين استجابة متميزة لوحظت: 1) تفعيل التيارات بعد المشبكي المثبط (IPSCs) (الشكل 5، النوع الأول الردود)، و 2) التيارات الكبيرة الموجبة الداخل مع بعض inductiعلى التيارات بعد المشبكي مثير (EPSCs) (الشكل 5، نوع الاستجابات II).
استخدام مترجم كهرضغطية يقدم ميزة أنه يمكن عقد ماصة المخدرات مليئة في موقف ثابت لا يقل عن 100 ميكرون بعيدا عن الخلية سجلت حتى يتم تحريكها بسرعة أنها مجاورة للخلية لطرد الضغط. وهذا مفيد لأنه يمكن أن يكون آليا حركة ماصة ويتسق من خلية إلى أخرى وعلى يوم لآخر. ومن المفيد أيضا عندما يتم تطبيق تركيزات عالية من النيكوتين (التي توعي nAChRs) إلى الخلية سجلت، كما يقلل من تأثير تسرب النيكوتين من المخدرات ماصة مليئة حال حدوثه من أي وقت مضى. للتدليل على اتساق التيارات nAChR عند استخدام مترجم كهرضغطية، سجلنا من الخلايا العصبية DA VTA في الدماغ شرائح من الفئران L9'S α6. ويبين الشكل 6 ردود على التوالي في نفس α6 L9'S الخلايا العصبية DA VTA ردا على تركيزات ن icotine التي تنشط بقوة شديدة الحساسية α6 * nAChRs (1 ميكرومتر: الشكل 6A و 10 ميكرومتر: الشكل 6B). إذا ما سمح ليتسرب منها الماء باستمرار على الخلية مسجل، يتوقع هذه التركيزات من النيكوتين لتوعي nAChRs على سطح الخلية، والرد الثاني سيكون الموهن نسبة إلى أول رد.
الشكل 1. ردود nAChR الممثل في الخلايا العصبية DA. A. وكان من الخلايا العصبية DA في شريحة الدماغ الماوس WT الجهد فرضت، ثم طلب من أدن تشافيز المحلية (100 ميكرومتر) عن طريق الضغط طرد (250 ميللي ثانية) باستخدام دواء مليئة 2 ماصة. مقياس بار: 100 PA، 3 ثوانى B. تم إجراء التجربة كما هو موضح في A، إلا أن النيكوتين (100 ميكرومتر) تم تطبيقها على الخلايا العصبية DA. شريط النطاق: 60 PA، 3 ثوانى.
ogether.within صفحة = "دائما"> 
الشكل 2. حل التيارات الذروة من خلال تغيير المخدرات تطبيق وقت. وكان من الخلايا العصبية DA في شريحة الدماغ الماوس WT الجهد فرضت، ثم طلب من أدن تشافيز المحلية (100 ميكرومتر). وترد ردين لنفس الخلية مسجل، حيث تم طرد أدن تشافيز من المخدرات ماصة مليئة ل 250 مللي ثانية (رمادي التتبع) أو 1000 ميللي ثانية (أسود التتبع). مقياس بار: 50 السلطة الفلسطينية.
الشكل 3. دراسة إمكانات العمل بعد اطلاق تطبيق المخدرات المحليين. وسجلت الخلايا العصبية DA في L9 α6'S الماوس شريحة الدماغ في المشبك الحالي (I = 0) واسطة، وإمكانات العمل العفوي لوحظت. تم تطبيق النيكوتين (1 ميكرومتر) باستخدام الضغط طرد (250 ميللي ثانية)، وكانت التغيرات في معدل اطلاق إمكانات العمل والراحة المحتملة غشاءولاحظ. باستخدام البرمجيات pClamp (البحث عتبة)، وقد اشتق حظية معدل اطلاق النار ويظهر في اللوحة السفلى.
الشكل 4. تطبيقات متعددة المخدرات إلى الخلية نفسها المسجلة. وسجلت الخلايا العصبية DA في L9 α6'S الماوس شريحة الدماغ في وضع المشبك الجهد. واستخدم ماصة المخدرات مليئة تطبيق محليا أدن تشافيز (1 ميكرومتر و 250 ميللي ثانية). مع الاستمرار في تسجيل من الخلية، تم سحب دواء مليئة ماصة من شريحة واستبدالها بأخرى مملوءة ماصة 3 ميكرومتر أدن تشافيز. تم تسجيل استجابة لأدن تشافيز ميكرومتر 3، وتكررت العملية مرة أخرى لمدة 10 ميكرومتر أدن تشافيز. شريط النطاق: 100 السلطة الفلسطينية، 1.5 ثانية.
الشكل 5. تصنيف الخلايا العصبية وفقا لنوع الاستجابة nAChR.وكانت مجموعة من الخلايا العصبية متفوقة (SC) أكيمة في α6 L9'S الماوس شريحة الدماغ الجهد فرضت، ثم طلب من النيكوتين المحلية (1 ميكرومتر) عن طريق طرد الضغط. عرضت النوع الأول الخلايا العصبية بعد تطبيق IPSCs زيادة النيكوتين. عرض نوع الخلايا العصبية II التيارات الداخل كبيرة وEPSCs متزايدة استجابة لطلب النيكوتين. شريط النطاق: 20 PA، 3 ثوانى.
الشكل 6. المترجم كهرضغطية يقدم الاتساق ويحمي من تسرب المخدرات. A. تم تسجيل DA VTA الخلايا العصبية في الدماغ شريحة من الفأر L9 α6 في وضع المشبك الجهد خلال تطبيق النيكوتين ميكرومتر 1. وقد هيأ ماصة النيكوتين مملوءة إلى موقف نهائي قبل طرد الضغط وتراجع بعد طرد باستخدام مترجم كهرضغطية. تم تسجيل الرد الثاني 2 دقيقة بعد فايRST لإظهار أنه لا يوجد الحساسية nAChR وقعت. شريط النطاق: 100 السلطة الفلسطينية، 8 ثانية B. وسجلت الاستجابات nAChR في الخلايا العصبية DA α6 L9'S VTA كما في A، ولكن تم تطبيق 10 ميكرومتر النيكوتين. شريط النطاق: 100 السلطة الفلسطينية، 8 ثانية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الأسلوب الواردة في هذه الوثيقة على نطاق واسع هو مفيد لدراسة يجند القناة الايونية بوابات ظيفة في الأعمال التحضيرية شريحة الدماغ. ومع ذلك، هناك عدد من العوامل التي من شأنها أن تؤثر تأثيرا كبيرا على نوعية واستنساخ البيانات التجريبية التي تنتج عن استخدام هذه الطريقة. على سبيل المثال، أثار التيارات هي حساسة جدا لقطر غيض من ماصة المخدرات شغلها. نصائح صغيرة سوف يسبب صعوبة إخراج الحل مع المخدرات، ونصائح كبيرة مع انخفاض المقاومة سوف تكون أكثر عرضة لتعطيل ختم gigaohm بين الخلية ومسجل القطب التسجيل. واحد قيد آخر على الطريقة المعروضة هي التي يمكن أن تتعرض الخلايا خلال 10 ميكرون من الخلية سجلت على المخدرات من المخدرات ماصة مملوءة، والتي قد تزيد من نشاطها ويمكن أن يؤثر على الخلايا المسجلة.
عند تطبيق المخدرات إلى خلية عدة مرات مع نفس ماصة المخدرات، من الأهمية بمكان أن يتم إرجاع ماصة للبالضبط نفس الموقف في شريحة لكل تطبيق. وحتى الانحرافات صغيرة (على سبيل المثال 1-2 ميكرون) في موضع واحد ردا على من التالي غالبا ما تؤدي إلى اختلافات كبيرة في الاستجابة الذروة المرصودة. A مترجم للبرمجة كهرضغطية (كما هو موضح أعلاه) أو مياداة مجهرية الروبوتية هو مفيد لتحديد المواقع ماصة المخدرات. وهناك اعتبار آخر هو مفتاح عمق الخلية سجلت ضمن شريحة. المخدرات ونشر في كثير من الأحيان بعيدا عن خلية على سطح شريحة بسرعة أكبر، في حين يمكن المخدرات "محاصرين" في شريحة عندما طرد على خلية التي تقع في عمق شريحة. هذا هو في كثير من الأحيان أحد الاعتبارات الرئيسية عند تطبيق النيكوتين، التي تبلد بسهولة عندما nAChRs مرات أطول من التعرض 100-200 ميللي ثانية. وبالمثل، فإن الضغط (في PSI) أن يتم إخراج ماصة في المخدرات ومليئة مقدار الوقت الذي يتم تطبيقه الضغط (الشكل 2) هي اعتبارات هامة لتفسير دا nAChR الحاليتا. نستخدم عادة 10-12 رطل من الضغط، ونجد أن 250 ميللي ثانية ما يكفي من الوقت لتسوية التيارات الذروة nAChR دون أن تسبب الحساسية واسعة مستقبلات.
والميزة الرئيسية لأسلوب وصفنا هو القدرة على تبادل النصائح ماصات المخدرات مملوءة حتى يمكن تطبيقها أن تركيزات المخدرات متعددة إلى نفس الخلايا العصبية. الاعتبارات الرئيسية عند تبادل ماصات هي 1) الاختلاف في تلميح ماصة الموقع من تركيز واحد إلى آخر، و 2 تقلب) في قطر تلميح ماصة. يمكن عادة ماصة تلميح يمكن السيطرة عليها بشكل كاف الموقع مع كاميرا الفيديو عالية الدقة بالقرب-IR ومياداة مجهرية دقيقة. يمكن التحكم تقلب في القطر تلميح ماصة باستخدام "ماصات الشقيقة" كلما كان ذلك ممكنا، وباستخدام ماصة مجتذب التي تشد micropipettes مع وجود درجة عالية من الدقة والاتساق.
وعموما، فإن الأسلوب ماصة المخدرات مليئة وصفها في هذه الورقة هو نهج مفيد جدا عندما studyinAChRs الأصلي نانوغرام أعرب في الخلايا العصبية الموجودة في الدماغ شرائح حادة. بالإضافة إلى كونها مفيدة لدراسة بيولوجيا الأعصاب من الاعتماد على النيكوتين وعلم الأحياء الكولينية النيكوتينيك، وهذه الطريقة قابلة للتطبيق بسهولة لغيرها من القنوات الأيونية يجند بوابات. 5-HT 3 المستقبلات، GABA A المستقبلات، ومستقبلات جليكاين العديد من المستقبلات الأخرى "السيستئين حلقة" التي يمكن دراستها باستخدام هذه التقنيات 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) منحة DA030396. بفضل أعضاء المختبر Drenan للمناقشة ونقد مفيدة للمخطوطة. ران مي شكر خاص لكيم للمساعدة التقنية وجوناثان تينغ توماس للمشورة بشأن الكبار شرائح مخ الفأر.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N-Methyl D-glucamine | Sigma | M2004 | |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| glucose | Sigma | G5767 | |
| Na+ ascorbate | Sigma | A4034 | |
| thiourea | Sigma | T8656 | |
| Na+ pyruvate | Sigma | P2256 | |
| MgSO4∙7H2O | Sigma | 230391 | |
| CaCl2∙2H20 | Sigma | 223506 | |
| NaCl | Sigma | S9625 | |
| Na+ pentobarbital | Vortech Pharmaceuticals | 76351315 | |
| potassium gluconate | Sigma | G4500 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | |
| GTP | Sigma | G8877 | |
| DSK-Zero 1 Vibrating slicer | Ted Pella, Inc. | ||
| P-97 Flaming/Brown micropipette puller | Sutter | ||
| RC-27 Recording chamber | Warner | ||
| TC-344B Perfusion heater controller | Warner | 640101 | |
| SH-27B Solution heater | Warner | 640102 | |
| Nikon FN-1 | Nikon | ||
| C-7500 CCD Video camera | Hamamatsu | ||
| Picospritzer III | General Valve Co. | ||
| MP-285 Micromanipulator | Sutter | ||
| PA-100 Piez–lectric translator | piezosystem jena, Inc. | ||
| 12V40 piezo amplifier | piezosystem jena, Inc. | ||
| Axopatch 200B | Molecular Devices Corp. | ||
| Digidata 1440A | Molecular Devices Corp. |
References
- Tapper, A. R. Nicotine activation of ?4* receptors: sufficient for reward, tolerance, and sensitization. Science. 306, 1029-1032 (2004).
- Drenan, R. M. In vivo activation of midbrain dopamine neurons via sensitized, high-affinity ?6* nicotinic acetylcholine receptors. Neuron. 60, 123-136 (2008).
- Zhao, S. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat. Methods. 8, 745-7452 (2011).
- Peca, J. Shank3 mutant mice display autistic-like behaviours and striatal dysfunction. Nature. 472, 437-442 (2011).
- Zhou, F. M., Wilson, C. J., Dani, J. A. Cholinergic interneuron characteristics and nicotinic properties in the striatum. J. Neurobiol. 53, 590-605 (2002).
- Pidoplichko, V. I. Nicotine activates and desensitizes midbrain dopamine neurons. Nature. 390, 401-404 (1997).
- Nashmi, R. Chronic nicotine cell specifically upregulates functional ?4* nicotinic receptors: basis for both tolerance in midbrain and enhanced long-term potentiation in perforant path. J. Neurosci. 27, 8202-8218 (2007).
- Xiao, C. Chronic nicotine selectively enhances ?4?2* nicotinic acetylcholine receptors in the nigrostriatal dopamine pathway. J. Neurosci. 29, 12428-12439 (2009).
- Cohen, B. N. Nicotinic cholinergic mechanisms causing elevated dopamine release and abnormal locomotor behavior. Neuroscience. 200, 31-41 (2012).
- Drenan, R. M. Cholinergic modulation of locomotion and striatal dopamine release is mediated by α6β4* nicotinic acetylcholine receptors. J. Neurosci. 30, 9877-9889 (2010).
- Grady, S. R. Structural differences determine the relative selectivity of nicotinic compounds for native α4β2*-, α6β2*-, α3β4*- and α7-nicotine acetylcholine receptors. Neuropharmacology. 58, 1054-1066 (2010).
- Drenan, R. M. Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled α6 and β3 subunits. Mol. Pharmacol. 73, 27-41 (2008).
- Keath, J. R. Differential modulation by nicotine of substantia nigra versus ventral tegmental area dopamine neurons. J. Neurophysiol. 98, 3388-3396 (2007).
- Mansvelder, H. D. Bupropion inhibits the cellular effects of nicotine in the ventral tegmental area. Biochem. Pharmacol. 74, 1283-1291 (2007).
- Lee, S. The largest group of superficial neocortical GABAergic interneurons expresses ionotropic serotonin receptors. J. Neurosci. 30, 16796-16808 (2010).
- Margolis, E. B. Reliability in the identification of midbrain dopamine neurons. PLoS One. 5, e15222 (2010).
- Margolis, E. B. The ventral tegmental area revisited: is there an electrophysiological marker for dopaminergic neurons. J. Physiol. 577 (Pt 3), 907-924 (2006).
- Couey, J. J. Distributed network actions by nicotine increase the threshold for spike-timing-dependent plasticity in prefrontal cortex. Neuron. 54, 73-87 (2007).
- Yang, K. Distinctive nicotinic acetylcholine receptor functional phenotypes of rat ventral tegmental area dopaminergic neurons. J. Physiol. 587, 345-361 (2009).
- Endo, T. Nicotinic acetylcholine receptor subtypes involved in facilitation of GABAergic inhibition in mouse superficial superior colliculus. J. Neurophysiol. 94, 3893-3902 (2005).
- Bouzat, C. New insights into the structural bases of activation of Cys-loop receptors. J. Physiol. Paris. , (2011).
