במאמר זה, אנו מתארים שיטה יעילה ללמוד לתפקד ערוץ יון יגנד מגודר בנוירונים של פרוסות מוח מבודד בחריפות. שיטה זו כרוכה בשימוש בתרופה micropipette מלא ליישום מקומי של תרופות לתאי עצב שנרשמו באמצעות טכניקות מהדקות תיקון סטנדרטיות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
יישום מקומי של תרופות לללמוד לתפקד קולטן אצטילכולין ניקוטינית בפרוסות מוח עכבר
במאמר זה
סיכום
תקציר
שימוש בטבק מוביל לבעיות בריאותיות רבות, כולל סרטן, מחלות לב, אמפיזמה, ושבץ. התמכרות לעישון סיגריות היא הפרעה נפוצה נוירופסיכיאטריות שנובעת מפעולות biophysical והסלולריות של ניקוטין על קולטני אצטילכולין ניאציניות (nAChRs) ברחבי מערכת העצבים המרכזית. ההבנה תת nAChR השונה שקיימת באזורי המוח רלוונטיים להתמכרות לניקוטין היא בעדיפות עליונה.
ניסויים המשתמשים בשיטות electrophysiology כגון מהדק תיקון כל תאים או הקלטות מהדק מתח 2 ואלקטרודות שימושיים לאפיון תרופתי של nAChRs של עניין. תאים המבטא nAChRs, כגון תאי יונקי רקמות תרבות או ביציות Xenopus laevis, מבודד מבחינה פיזית ולכן הם למדו בקלות להשתמש בכלים של פרמקולוגיה המודרנית. התקדמות הרבה כבר נעשתה שימוש בטכניקות אלה, במיוחד כאשר הקולטן היעד כבר היה ידועביטוי אקטופי nd הושג בקלות. אולם לעתים קרובות, יש צורך ללמוד nAChRs בסביבה הטבעית שלהם: בתאי עצב בתוך פרוסות מוח חריף נקטפו מעכברים או חולדות מעבדה. לדוגמה, עכברים להביע יחידות משנה "רגישות יתר" nAChR כגון α4 עכברי L9'A 1 ועכברי α6'S L9 2, מאפשר זיהוי חד משמעי של נוירונים המבוססים על ביטוים התפקודי של מקטע nAChR ספציפי. למרות שהקלטות מהדקות תיקון כל תא מתאי עצב בפרוסות מוח נעשות באופן שגרתי על ידי electrophysiologist המיומן, הוא מאתגר מקומי כדי להחיל תרופות כגון אצטילכולין או ניקוטין לתא נרשם בתוך פרוסת מוח. הדילול של תרופות לתוך superfusate (יישום אמבטיה) הוא לא מהירות הפיך, ומערכות U-צינור אינן מותאמות בקלות לעבודה עם פרוסות מוח.
במאמר זה, אנו מתארים שיטה ליישום במהירות תרופות nAChR-מפעילות לנוירונים שנרשמו במבוגרים מ 'ouse פרוסות מוח. קלטות סטנדרטיות כל תאים עשויות מנוירונים בפרוסות, וmicropipette שני, מלאי סמים של הריבית תמרן לעמדה ליד התא המוקלט. הזרקה של אוויר דחוס או חנקן אינרטי לתוך פיפטה תרופה המלאה גורמת לכמות קטנה של פתרון תרופה להיפלט פיפטה אל התא המוקלט. באמצעות שיטה זו, זרמי nAChR בתיווך יכולים להיפתר ברמת דיוק של האלפית שני. זמני יישום תרופה בקלות יכולים להיות מגוונים, ופיפטה תרופה המלאה ניתן חזרה בו והחליפה עם פיפטה חדשה, המאפשרת לעקומות ריכוז בתגובה לתיוצרנה לנוירון בודד. למרות שתאר בהקשר של nAChR נוירוביולוגיה, טכניקה זו צריכה להיות שימושית ללימוד סוגים רבים של ערוצי יגנד מגודרי יון או קולטנים בתאי עצב מפרוסות מוח.
פרוטוקול
1. הכנה של פתרונות להכנת Slice מוח ואלקטרופיזיולוגיה
- פתרונות להכנת פרוסות מוח תוארו בעבר 3, 4. הכן N-methyl-D glucamine (NMDG)-מבוסס פתרון התאוששות וחיתוך של הרכב הבא (במ"מ): 93 N-methyl D-glucamine, 2.5 KCl, 1.2 nah 2 PO 4, 30 3 NaHCO, 20 HEPES, 25 גלוקוז, 5 Na + ascorbate, 2 Thiourea, 3 Na + פירובט, 10 MgSO 4 • 7H 2 O, 0.5 CaCl 2 • 2H 2 O. התאם ל300-310 mOsm עם NMDG. התאם לחומציות 7.3-7.4 עם 10 N HCl.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בניסויים שלנו, אנחנו באופן שגרתי להקליט מדופמין (DA)-ייצור תאי עצב באזור גחון tegmental (VTA) וsubstantia nigra החלקי compacta (SNC). במצב מתח מהדק, יישום לחץ של אצטילכולין או ניקוטין לתאים אלה בדרך כלל תוצאה נוכחית מהירה, פנימה קטיון שמגיע לשיא תוך 100-200 אלפיות (איור 1 א, ב). דעיכתו של הזרם מוכתבת במידה רבה על ידי הפצת הסמים מהאתר של פעולה, והאם אנזימים בפרוסה נמצאים לעכל את התרופה לצורה פעילה. לדוגמה, אח הוא במהירות על ידי הידרוליזה acetylcholinesterases הנמצא.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
השיטה שהוצגה במאמר זה היא רחב שימושית לחקר תפקוד ערוץ היון יגנד מגודר בהכנות פרוסות מוח. עם זאת, יש מספר גורמים שישפיעו באופן משמעותי את האיכות והשחזור של נתונים ניסיוניים הנובעים מניצול שיטה זו. לדוגמה, זרמים מעוררים רגישים מאוד לקוטר של קצה פיפטה תרופה המלאה. טיפים קטנים יגרמו קושי בלהוציא את פתרון הסמים, וטיפים גדולים עם התנגדות נמוכה יהיו יותר סיכוי לשבש את חותם gigaohm בין התא המוקלט והחוט הרושם. מגבלה של השיטה הוצגה אחת אחרת היא שתאים בתוך 10 מיקרומטר של התא נרשם עלולים להיו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) המענק DA030396. תודה לחברים במעבדת Drenan לדיון וביקורת של כתב היד מסייע. תודה מיוחדת למי ראן קים לסיוע טכני וג'ונתן תומס טינג לייעוץ לגבי פרוסות מוח עכבר בוגרות.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שם המגיב חברה מספר קטלוג | |||
| N-מתיל D-glucamine | סיגמא | M2004 | |
| KCl | סיגמא | P3911 | |
| Nah 2 PO 4 | סיגמא | S9638 | |
| NaHCO 3 | סיגמא | S6014 | |
| HEPES | סיגמא | H3375 | |
| גלוקוז | סיגמא | G5767 | |
| Na + Ascorbate | סיגמא | A4034 | |
| Thiourea | סיגמא | T8656 | |
| Na + פירובט | סיגמא | P2256 | |
| MgSO 4 • 7H 2 O | סיגמא | 230391 | |
| CaCl 2 • 2H 2 0 | סיגמא | 223506 | |
| NaCl | סיגמא | S9625 | |
| Na + פנטוברביטל | פרמצבטיקה Vortech | 76351315 | |
| גלוקונאט האשלגן | סיגמא | G4500 | |
| EGTA | סיגמא | E3889 | |
| Mg-ATP | סיגמא | A9187 | |
| GTP | סיגמא | G8877 | |
| DSK-Zero 1 רטט פורס | טד פלה, Inc | ||
| P-97 Flaming / בראון micropipette חולץ | סאטר | ||
| קאמרי RC-27 הקלטה | וורנר | ||
| בקר דוד זלוף TC-344B | וורנר | 640101 | |
| SH-27B | וורנר | 640102 | |
| ניקון FN-1 | ניקון | ||
| C-7500 מצלמת וידאו CCD | Hamamatsu | ||
| Picospritzer III | כללי Valve ושות | ||
| MP-285 micromanipulator | סאטר | ||
| רשות-100 מתורגמן פיזואלקטריים | Piezosystem Jena, Inc | ||
| 12V40 piezo מגבר | Piezosystem Jena, Inc | ||
| Axopatch 200B | התקנים המולקולרי קורפ | ||
| Digidata 1440A | התקנים המולקולרי קורפ |
מקורות
- Tapper, A. R. Nicotine activation of ?4* receptors: sufficient for reward, tolerance, and sensitization. Science. 306, 1029-1032 (2004).
- Drenan, R. M. In vivo activation of midbrain dopamine neurons via sensi....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
