Summary
本稿では、急性単離した脳スライスのニューロンにおけるリガンド依存性イオンチャネルの機能を研究するための有用な方法を説明します。このメソッドは、標準パッチクランプ法を用いて記録された神経細胞への薬物のローカルアプリケーションのための薬剤を充填したマイクロピペットの使用を含む。
Abstract
タバコの使用は、がん、心臓病、肺気腫、脳卒中を含む多数の健康上の問題につながる。喫煙への依存症は、中枢神経系全体のニコチン性アセチルコリン受容体（nAChRs）ニコチンの生物物理学的および細胞作用に由来する流行精神神経疾患である。ニコチン中毒に関連する脳領域に存在するさまざまなnAChRをサブタイプを理解することは、主要な優先事項です。
このような全細胞パッチクランプまたは二電極電圧クランプ記録として電気生理学的手法を採用した実験では、目的のnAChRsの薬理学的特性評価のために有用である。このような哺乳動物組織培養細胞やアフリカツメガエル卵母としてnAChRsを発現する細胞は、物理的に分離されているので、簡単に現代の薬理学のツールを用いて研究されている。標的受容体が既に知られていた場合は特に多くの進歩は、これらの技術を用いて製造されていますND異所性発現は容易に達成された。急性実験用マウスまたはラットから採取した脳スライス内のニューロンに：多くの場合、しかし、それは彼らのネイティブ環境でnAChRsを検討する必要がある。例えば、α4L9'Aマウス1およびα6L9のMICE 2として"過敏" nAChRをサブユニットを発現するマウスは、特定のnAChRをサブユニットのそれぞれの機能発現に基づいて神経細胞の明確な識別を可能にします。脳スライスのニューロンからホールセルパッチクランプ記録を日常的に熟練した電気生理学者によって行われていますが、局所的に、アセチルコリンや脳スライス内に記録された細胞にニコチンなどの薬物を適用するために挑戦している。 superfusateに薬の希釈（浴アプリケーション）は、急速に可逆的ではなく、U字管のシステムを容易に脳スライスで動作するように適合されていない。
本稿では、急速に大人メートルで記録ニューロンにnAChRを活性化薬を適用するための方法を説明します脳スライスをウーズ。標準細胞全体の録音は、スライスのニューロンから作られており、興味のある薬剤を充填した第二マイクロピペットは記録セルに近い位置に操縦される。薬剤を充填したピペットに加圧された空気または不活性窒素の注入は、記録されたセル上にピペットから吐出される薬液の少量を引き起こす。この方法を使用して、nAChRを媒介電流は、ミリ秒の精度で解決することができるようになりました。医薬品申請時間は簡単に変えることができ、薬剤を充填したピペットは、単一ニューロンのために作成される濃度応答曲線を可能にする、新しいピペットで後退して交換することができます。 nAChRを神経生物学の文脈で説明しているが、この技術は、脳スライスのニューロンにおけるリガンド依存性イオンチャネルや受容体の多くの種類を研究するための有用なはずである。
Protocol
1。脳切片の調製と電気生理学のための溶液の調製
- 脳スライスの準備のためのソリューションは、以前3,4を記載した。 93 N-メチルD-グルカミン、2.5のKCl、1.2のNaH 2 PO 4、30のNaHCO 3、20 HEPES、25：N-メチルD-グルカミン（NMDG）ベースの以下の組成の切断および復旧ソリューション（mm）を準備グルコース、5 Na +のアスコルビン酸塩、チオ尿素2、3 Na +のピルビン酸、硫酸マグネシウム10 4•7H 2 O 0.5のCaCl 2•2H 2 O NMDGで300から310 mOsmに調整してください。 10 N HClで7.3から7.4にpHを調整する。
- 各2Mの原液を作るためにミリポア水にし、MgSO 4•7H 2 OおよびCaCl 2•2H 2 Oに溶解する。
- 記載されているために、他の成分を秤量し、溶解させるために撹拌しながら、部分的にミリポア水で満たされてメスフラスコに加える。すべてのものが追加されたら、埋めるミリポア水でメスフラスコ。
- pHを測定し、10 N HClで調整してください。
- 浸透圧を測定し、必要に応じてNMDGで調整します。
- 92のNaCl、2.5のKCl、1.2のNaH 2 PO 4、30のNaHCO 3、20 HEPES、25グルコース、5のNa +アスコルビン酸、2チオウレア、3 NA：以下の組成の人工脳脊髄液（ACSF）を（mMで）保持HEPESを準備+ピルビン酸、2し、MgSO 4•7H 2 O 2のCaCl 2•2H 2 Oスクロースと300から310 mOsmに調整してください。 1NのHClまたはNaOHで7.3から7.4にpHを調整する。
- 記載されている順序でコンポーネントを秤量し、溶解させるために撹拌しながら、部分的にミリポア水で満たされてメスフラスコに加える。すべてのものが追加されたら、ミリポア水でメスフラスコを埋める。
- pHを測定し、必要に応じてNaOHまたはHClで調整してください。
- 浸透圧を測定し、必要に応じて、スクロースで調整します。
- 124のNaCl、KClを2.5、1.2のNaH 2 PO 4、24のNaHCO 3、12.5グルコース、2し、MgSO 4•7H 2 O 2のCaCl 2•2H 2 O：次の組成（mMで）の標準ACSF録音ソリューションを準備スクロースと300から310 mOsmに調整してください。 1NのHClまたはNaOHで7.3から7.4にpHを調整する。
2。急性脳スライスの調製
- 脳切片の切断および復旧は、前述の3と4を行っています。 95％酸素/ 5％CO 2ガス（carbogen）、氷上で1皿、33で他の℃までとリカバリソリューションをNMDGでいっぱい泡二つの結晶皿
- バブル1水晶皿は室温でcarbogenとACSFを保持HEPESでいっぱい。
- Na +のペントバルビタール（200 mg / kgを腹腔内）で成体マウス（2〜12ヶ月熟成）麻酔。動物がつま先ピンチへの応答を全く持っていないときの手順に進みます。
- 必要に応じて、後でgenotypの末尾の組織サンプルをカット動物のING。
- 胸腔を開いて心臓を露出し、下行大動脈をクランプします。右心房を裂く。
- Transcardially 0〜4℃NMDGリカバリ·ソリューションの5〜10 mlの動物を灌流する。
- 動物の首を、脳を除去し、1分間4℃NMDGリカバリ·ソリューションに配置します。
- 氷のように冷えた金属板に、関心のある領域を含むように、所望の配向（等、水平、矢状、冠状）で脳をトリミング。
- 接辞振動スライサーの乾燥ステージ表面に瞬間接着剤で脳ブロック（DSK-ゼロ1; Dosaka）、4水没脳ブロックcarbogenと℃のNMDGリカバリ·ソリューション、そして継続的にバブルソリューション。
- 興味のある脳領域のスライスをカット。スライスの厚さは、特定の興味のある脳領域、動物の年齢、および実行する実験に応じて、200〜400μmである。
- すぐに切断後、carbogenatedで所望のスライス、33℃でインキュベートNMDG回復soluti正確に12分間で、その後60分の最初の期間のためのソリューションを保持carbogenated、室温のHEPESに転送されます。この60分間のインキュベーション後、スライスが記録のために使用することができます。スライスは、彼らがレコーディングに使用されるまで、一日を通して溶液を保持HEPESで維持されます。
3。脳スライスのニューロンからパッチクランプ記録
- プログラマブル·フレイミング·ブラウンプラー（サターP-97または同等の垂直プラー）と標準パッチマイクロピペットを引き抜きます。ギガオームシールを形成するための最適なピペットは、典型的には4から6MΩの抵抗を持っている
- 正立顕微鏡（ニコン、FN-1）のステージ上で、録音室（ワーナー·インスツルメンツのRC-27L）に1スライスを転送します。連続して表面かん流する（1.5 - 2.0ml /分）32℃に加熱され、維持carbogenated、標準記録ACSFとスライス℃の代わりに、スライスは室温に維持することができる。
- 用いて、関心のある脳領域を見つけ、センター10X空気目標（ニコンプランフルーア10X、NA 0.3; WD：16ミリメートル）。
- IR-微分干渉コントラスト（DIC）光学と赤外線電荷結合素子の近くに高速に接続40X近赤外（IR）の水浸対物レンズ（3.5ミリメートル;：; WD 0.80 NAニコンAPO 40XW）を使用して、個々の神経細胞を可視化する（CCD）ビデオカメラ（浜松ホトニクスC-7500）。 IR-DIC観察下で、健康なニューロンは滑らかで、明るい灰色の形質膜を示す。
- 適切な細胞内記録液でマイクロピペットを埋める。 135カリウム、グルコン酸、5のEGTA、0.5 CaCl 2で 、2のMgCl 2、10 HEPES、2のMg-ATP、0.1 GTP（pHはトリス塩基、浸透圧で7.25に調整する：ほとんどのアプリケーションでは、我々は次のソリューション（mm）を使用290スクロースmOsm）に調整。可視化ニューロンからホールセル記録を確立します。
4。スライスのニューロンへの薬物のローカルアプリケーション
- 上記のように標準のパッチクランプマイクロピペットを引き抜きます。使い方複数の薬剤溶液が同じセルで使用されるとき、例えば、ガラスの同じ部分からの2同一の "妹"のヒントを生成サッター、P-97などピペットプラーは有利である。それらは、上述の細胞内液を充填した場合MΩ〜5の抵抗を持っているでしょう先端サイズが最適です。
- 埋め戻しcarbogenated、標準記録ACSFで希釈した薬剤の溶液でマイクロピペット。下向きの先端をポイントして、ソリューションの列に閉じ込められた気泡を除去するために薬剤を充填したマイクロピペットをはじく。
- そのようなPicospritzerⅢ（総合バルブ株式会社）などの適切な圧力噴射システムにチューブで接続されたピペットホルダ内の薬物を充填したマイクロピペットをマウントしてください。ピペットホルダは、一般的にパッチクランプ記録（例えば、サッターMP-285）に使用されるマニピュレータと同じ分解能を持つマイクロマニピュレータに取り付けなければならない。また、マニピュレータはに、スライスのうち、斜め移動を考慮するべきです。マンually流体の列の後ろに十分な圧力を構築するために3〜4倍のマイクロピペットに圧力を取り出します。
- IR-DIC光学の下に先端を可視化しながらマイクロマニピュレータのコントロールを使用して、スライスに薬物ピペットを下げる。理想的には、視覚的に識別し、センター前のスライスに記録マイクロピペットを下げる細胞近傍の薬物ピペットの位置決めが続くから記録されるニューロンがあります。薬物ピペットを合わせると、薬物ピペットがgigaohmシールを確立後に所定の位置に移動された場合は、記録が中断される可能性が記録された細胞の周辺に組織の動きを引き起こす可能性があります。
- IRのビデオを使用して、組織切片の上面に薬物マイクロピペットを位置付ける。 1圧力駆とモニタ1）の排出に関連する破片の動きのための先端付近、及び先端が詰まっているかブロックされている兆候がないか2）マイクロピペットチップを実行します。先端がブロック/目詰まりしている場合は、pipettを撤回eと新しいものと交換してください。
- このような最終的な位置に、薬剤を充填したピペットの先端が記録されたセルと記録電極の先端と同じ焦点面（またはそれより少し下）に）が1のとき、そのスライスの上部から斜めに記録されたセルに近づく記録されたセルから、2）は10〜40μm。薬剤を充填したピペットチップ、記録されたセルの上にある場合、圧力放出から力がgigaohmシールを混乱させる可能性があります。
- 電圧クランプモードまたは電流クランプ·モードのセルを保持しつつ、所望の細胞応答を記録します。我々は日常的にアセチルコリンを記録および/または電圧クランプ·モードのニューロンを保持したまま、携帯電流をニコチン誘発した。 Picospritzer IIIを用いたときの圧力吐出が手動で起動することができますが、より再現性のある結果を得るためには、デジタルTTLパルスで取得システム（アクソンDigidata 1440とpClamp 10.3）を使用して圧力吐出をトリガすることをお勧めします。
5。制御圧電トランスレータを使用した薬剤を充填したマイクロピペット
- 可能であれば、その後でアナログ電圧入力を受け入れることができる一次元圧電変換器（ 例えば Piezojena、PA-100またはバーレイPZM-150）（再び、アクイジション·システムから）、に薬物を充填したピペットホルダをマウント高精度マイクロマニピュレーター（サッターMP-285）の上に取り付けられた。圧電トランスレータは入口/出口のタイミングや速度などのスライスの薬剤を充填したピペット内外への移動に便利ですので、より容易に制御、実験に実験から再生することができる。ピペットが圧力のみの吐出の瞬間のための圧電トランスレータを用いて細胞の近くに移動されたときnAChRsを勉強するとき、薬剤を充填したピペットからニコチン漏れの減感効果は、彼らがこれまで発生した場合、最小化されます。
- 圧電電圧制御アンプ上で手動で制御されたポテンショメータを使用して、電圧をダイヤルその最大値に設定します。
- マイクロマニピュレータ、ピペット位置が記録されたセルにその中身を取り出し、手動圧電電圧制御アンプ上ゼロに電圧を低減することによりピペットを撤回するスライスにおける薬剤を充填したピペットを用いて。
- 記録収集システムからのアナログ出力信号を用いて、圧力吐出TTLパルスが発生する前に、300ミリ秒を開始する250ミリ秒の期間にわたってスライスに薬剤を充填したピペットを移動します。 TTLパルスの終了後50ミリ秒を開始し、250ミリ秒の期間にわたってピペットを収納してください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
我々の実験では、我々は日常的にドーパミン（DA）産腹側被蓋野（VTA）と黒質緻密部（SNC）のニューロンをから記録します。電圧固定モードでは、これらの細胞にアセチルコリンやニコチンの圧力アプリケーションでは、通常100から200ミリ秒（ 図1A-B）内にピークに達した迅速、内向き陽イオン電流になります。電流の減衰は、主に作用部位からの薬物の拡散によって決定され、スライス内の酵素が存在するかどうかを不活性型に薬物を代謝する。例えば、アセチルコリンは、DAニューロン5に富んでいる脳の領域の細胞の表面上に存在するアセチルコリンエステラーゼによって急速に加水分解される。誘発電流（ 図1A）の急速な崩壊をもたらす。これとは対照的に、ニコチンは加水分解されないとニコチン誘発電流は、それが強くACTIVすることができますACH-誘発電流（ 図1B）、できるだけ急速に減衰しない食べnAChRs 6鈍感。
高圧噴射システムにより、オペレータは圧力パルスの時間を変化させることができます。それが最大電流を誘発するかどうかを決定するために、治験責任医師は、薬物のパルスに応答して達成されていることができますので、この機能は、脳スライス内の神経細胞の表面にnAChRsの研究に有用である。医薬品申請の1,000ミリ秒（黒trace）は、現在の明確な最大値に加えていくつかの着実なをもたらすのに対し、薬物アプリケーションの250ミリ秒（グレートレース）または、決定的な最大誘発現在明らかにしなくてもよいこと、例えば、 図2の2つのトレースはショー状態の脱感作。正確な濃度 - 応答曲線とき、またはnAChRを脱感作を勉強を構築するときに、このような "ピーク"電流を解決することは非常に重要です。
急性脳スライス7,8内に記録されたときに腹側中脳DAニューロンは、しばしば自発的活動電位を発生させる。 α6L9のMICE、どのEXニコチンまたはアセチルコリン2、9月11日の10〜100倍低い濃度に強く反応nAChRsを押し、ニコチン注射に反応して増加運動を示す。行動と神経活動（活動電位の発火）を相関させるためには、現在のクランプモードで記録α6L9'S DAニューロンにニコチンを適用することが有用である。通常、α6L9'S DAニューロンにニコチン（1μM）のローカル·アプリケーションは、30〜40秒2（ 図3上段）内にベースラインに戻って減衰その発射の急速かつ一過加速になります。ニコチンへのそのような応答は、適切な解析ソフトウェア（モレキュラー·デバイス社など pClamp）と（ 図3、下部パネル）容易に定量化されています。
異所的に発現nAChRsによる培養細胞やアフリカツメガエル卵母細胞での実験では、薬物濃度のシリーズがそれぞれ記録されたセル12に適用することができるという利点を楽しむことができます。で脳スライス内の神経細胞は、典型的には、濃度-反応曲線は不可能であり、薬剤の単一濃度に対する応答は多くの場合、1に報告されている。しかし、本稿で説明したように薬剤を充填したピペットを繰り返し脳スライス2、8、13、14内に記録された同じセルに適用される薬剤の複数の濃度を可能にするために変更することができます。 図4から、代表的なデータを示していますシングルAChの3つの濃度で刺激した、DAニューロンが記録された。薬剤を充填したピペットを保持する安定性の高いマイクロマニピュレーターと組み合わせて研究者の経験は、この種の実験の成功につながる重要な要素です。成功した場合、このアプローチは、ネイティブnAChRsに関する貴重な薬理学的情報を提供します。
未同定の細胞型または不均一な集団と脳領域中に存在するものを含む脳スライスのニューロンは、多くの場合、様々な基本的なエレメントを使用して分類されctrophysiologicalおよび/ または形態的措置15。例えば、 私は現在の時間 、静止膜電位、自然発火率、およびセルサイズの発現は、DAニューロン2、7、8、16、17を特徴づけるために使用される代表的な指標である。我々の方法を使用して、それはローカルに適用されたニコチンまたはアセチルコリン18、19への応答に基づいて、神経細胞を特徴づけることも可能です。たとえば、上丘（SC）はα6サブユニット20を含有するものを含む様々なnAChRs、極めて高度の発現と異質かつ比較的特徴づけられていない脳の領域です。 α6L9'Sマウスの脳スライスでは、我々はいくつかのSCニューロンから記録し、ニコチンを充填したピペットで圧力吐出を使ってニコチン（1μM）を適用しました。つのタイプが観察された別個の応答：1）抑制性シナプス後電流（性IPSC）の活性化（ 図5、私の応答を入力します）、およびいくつかのinductiと2）大内側陽イオン電流興奮性シナプス後電流（EPSCS）（ 図5、タイプIIの応答）の上に。
圧電トランスレータの使用は、それが急速に圧力吐出用のセルに隣接する移動するまで薬剤を充填したピペットが少なくとも100μm離れて記録セルから静止位置に保持することができるという利点を提供する。これは、ピペットの動きを自動化することができるので便利ですし、細胞から細胞へと日々に一貫しています。それが今まで発生した場合、それが薬剤を充填したピペットからニコチンリーク電流の影響を最小限に抑えることがニコチンの高濃度（nAChRsを脱感作する）、記録されたセルに適用されるときにも便利です。ピエゾトランスレータを使用しているときnAChRを電流の整合性を実証するために、我々はα6L9'Sマウスの脳切片におけるVTA DAニューロンから記録。 図6は同じα6L9'S VTAのDAニューロンの連続した応答を示し、nの濃度に応じて、強く過敏α6* nAChRs（：;： 図6B、10μM図6A 1μM）を活性化するicotine。連続して記録されたセルに漏れ出ることを許容した場合には、ニコチンのこれらの濃度は、細胞表面上nAChRsを脱感作することが予想されると、2番目の応答は、最初の応答に減衰相対的であろう。
図1のDAニューロンにおける代表nAChRを応答。 WTマウスの脳切片におけるDAニューロンは電圧が第二薬剤を充填したピペットを用いて圧力噴出（250ミリ秒）を介してアセチルコリン（100μM）のローカルアプリケーションに続いて、クランプした。スケールバー：100 pA以下、3秒、B。で説明したように実験は、DAニューロンに適用されたニコチン（100μM）を除き、行われた。スケールバー：60 pA以下、3秒。
図2：薬物印加時間を変化させることにより、ピーク電流を解決。 WTマウスの脳切片におけるDAニューロンは、電圧がアセチルコリン（100μM）のローカルアプリケーションに続いて、クランプした。二つの回答はACHが250ミリ秒（グレーのトレース）または1000ミリ秒（黒トレース）の薬剤を充填したピペットから排出されたものと同じ録音し細胞、のために示されている。スケールバー：50 PA。
図3局所的な薬物適用後発射活動電位を学ぶ。 α6L9のマウス脳切片におけるDAニューロンは電流クランプ（I = 0）モード、および自発活動電位が観察されたに計上された。ニコチン（1μM）を圧力噴出（250ミリ秒）を使用して適用され、活動電位発火率と静止膜電位の変化があった観測された。 pClampソフトウェア（閾値探索）を使用して、瞬時発火率を導出したと下のパネルに示されている。
図4複数の薬物のアプリケーションが同じセルに記録された。 α6L9のマウス脳切片におけるDAニューロンは電圧クランプモードで記録された。薬剤を充填したピペットは、ローカルでAChを（; 250ミリ1μM）を適用するために使用されていました。細胞から記録し続けている間、薬剤を充填したピペットは、スライスから撤退および3μMアセチルコリンでいっぱい別のピペットに置き換えられました。 3μMのアセチルコリンへの応答を記録した、プロセスを10μMAChのために再び繰り返された。スケールバー：100 PA、1.5秒。
図5 nAChRを応答型によるニューロンの分類。α6L9のマウス脳切片における上丘（SC）のニューロンのグループは、電圧、圧力排出経由ニコチン（1μM）のローカルアプリケーションに続いて、クランプした。タイプIニューロンはニコチン適用後増加した性IPSCを示した。タイプIIニューロンはニコチンアプリケーションに応じて、大規模な内向き電流の増大EPSCSを示した。スケールバー：20 pA以下、3秒。
図6圧電トランスレータは、一貫性を提供し、薬剤の漏れから保護します。 α6L9のマウスの脳スライスにおけるVTAのDAニューロンは1μMのニコチンの適用時に電圧クランプモードで記録された。ニコチンに満ちたピペットは、圧力排出する前の最後の位置に操縦と圧電トランスレータを使用して排出した後に撤回された。第二の応答が2分Fiの後に記録された全くnAChRを脱感作が発生しなかったことを示すために、RST。スケールバー：100 PA、8秒、B。 α6L9'S VTA DAニューロンにおけるnAChRを応答は、以下のように記録されていましたが、10μMのニコチンが適用された。スケールバー：100 PA、8秒。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
本論文で提示した方法は、脳スライス標本におけるリガンド依存性イオンチャネルの機能を研究するために広く便利です。しかし、かなりの実験データは、このメソッドを利用した結果としての品質と再現性に影響を与える要因がいくつかあります。例えば、誘発電流は、薬剤を充填したピペットの先端の直径に非常に敏感です。小さなヒントを吐出する薬液の難しさの原因となり、低抵抗で大きなヒントは、記録されたセルと記録電極の間にgigaohmシールを混乱させる可能性が高くなります。提示された方法の一つは、他の制限は、記録されたセルの10μm以内の細胞を、それらの活性を高める可能性があり、潜在的に記録された細胞に影響を及ぼす可能性薬剤を充填したピペットから、薬剤にさらされるかもしれないということです。
同じ薬物ピペットでセルを複数回に薬物を適用する場合は、ピペットに返されることが重要である各アプリケーション用のスライスで正確に同じ位置。次の1つの応答から配置であっても小さな偏差（ 例えば 1から2μm）を頻繁に観測されたピークのレスポンスの大幅な違いになります。プログラマブルピエゾトランスレータ（上述のように）またはロボットマニピュレーターは、薬物ピペットを位置決めするために有利である。別の重要な考慮事項は、スライス内の記録されたセルの深さである。スライスの奥深くに位置しているセル上に排出するとき薬剤はスライス内に "閉じ込められた"ことができるのに対し、薬剤はしばしば、より迅速にスライスの表面に細胞から拡散されます。露光時間は100から200ミリ秒よりも長いときに容易にnAChRsをdesensitizesニコチンを適用する際には、多くの場合、重要な考慮事項です。同様に、薬剤を充填したピペットと圧力が印加されている時間の長さ（ 図2）に排出される圧力（PSI）のnAChRを現在のDAを解釈するための重要な考慮事項ですTA。我々は日常的に圧力の10から12 psiを使用しており、我々は250ミリ秒では、広範受容体の脱感作を引き起こすことなく、nAChRをピーク電流を解決するのに十分な時間であることがわかります。
私たちが説明する方法の主な利点は、複数の薬物濃度が同じニューロンに適用できるように交換薬剤を充填したピペットのヒントできることです。ピペットチップの隣に1濃度から場所、ピペット先端径の2）変動の交換ピペットは1アールの重要な考慮事項）が変動。ピペットチップの位置は、通常、十分に高解像度の近赤外ビデオカメラや精密マイクロマニピュレータを制御することができる。ピペットチップの直径のばらつきは、可能な限り正確性と一貫性の高いマイクロピペットを引っ張るピペットプラーを使用して、 "姉妹ピペット"を使用して制御できます。
全体的には、本稿で述べた薬剤を充填したピペット法は非常に有用なアプローチであるときstudyi急性脳スライスで見つかった神経細胞で発現ngのネイティブnAChRs。ニコチン依存症とニコチン性コリン作動性生物学、神経生物学を研究するのに有用であることに加えて、この方法は、他のリガンド依存性イオンチャネルに容易に適用できる。 5-HT 3受容体、GABA受容体、グリシン受容体は、これらの技術21を用いて検討することができる他、 "のCys-ループ"受容体のいくつかある。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
この作品は、国立衛生研究所（NIH）の助成DA030396によってサポートされていました。役立つ議論と原稿の批評のためにDrenanラボのメンバーに感謝します。 MIへの特別な感謝は成体マウスの脳スライスに関する助言のための技術支援とジョナサン·トーマスティンのために金を実行しました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N-Methyl D-glucamine | Sigma | M2004 | |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| glucose | Sigma | G5767 | |
| Na+ ascorbate | Sigma | A4034 | |
| thiourea | Sigma | T8656 | |
| Na+ pyruvate | Sigma | P2256 | |
| MgSO4∙7H2O | Sigma | 230391 | |
| CaCl2∙2H20 | Sigma | 223506 | |
| NaCl | Sigma | S9625 | |
| Na+ pentobarbital | Vortech Pharmaceuticals | 76351315 | |
| potassium gluconate | Sigma | G4500 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | |
| GTP | Sigma | G8877 | |
| DSK-Zero 1 Vibrating slicer | Ted Pella, Inc. | ||
| P-97 Flaming/Brown micropipette puller | Sutter | ||
| RC-27 Recording chamber | Warner | ||
| TC-344B Perfusion heater controller | Warner | 640101 | |
| SH-27B Solution heater | Warner | 640102 | |
| Nikon FN-1 | Nikon | ||
| C-7500 CCD Video camera | Hamamatsu | ||
| Picospritzer III | General Valve Co. | ||
| MP-285 Micromanipulator | Sutter | ||
| PA-100 Piez–lectric translator | piezosystem jena, Inc. | ||
| 12V40 piezo amplifier | piezosystem jena, Inc. | ||
| Axopatch 200B | Molecular Devices Corp. | ||
| Digidata 1440A | Molecular Devices Corp. |
References
- Tapper, A. R. Nicotine activation of ?4* receptors: sufficient for reward, tolerance, and sensitization. Science. 306, 1029-1032 (2004).
- Drenan, R. M. In vivo activation of midbrain dopamine neurons via sensitized, high-affinity ?6* nicotinic acetylcholine receptors. Neuron. 60, 123-136 (2008).
- Zhao, S. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat. Methods. 8, 745-7452 (2011).
- Peca, J. Shank3 mutant mice display autistic-like behaviours and striatal dysfunction. Nature. 472, 437-442 (2011).
- Zhou, F. M., Wilson, C. J., Dani, J. A. Cholinergic interneuron characteristics and nicotinic properties in the striatum. J. Neurobiol. 53, 590-605 (2002).
- Pidoplichko, V. I. Nicotine activates and desensitizes midbrain dopamine neurons. Nature. 390, 401-404 (1997).
- Nashmi, R. Chronic nicotine cell specifically upregulates functional ?4* nicotinic receptors: basis for both tolerance in midbrain and enhanced long-term potentiation in perforant path. J. Neurosci. 27, 8202-8218 (2007).
- Xiao, C. Chronic nicotine selectively enhances ?4?2* nicotinic acetylcholine receptors in the nigrostriatal dopamine pathway. J. Neurosci. 29, 12428-12439 (2009).
- Cohen, B. N. Nicotinic cholinergic mechanisms causing elevated dopamine release and abnormal locomotor behavior. Neuroscience. 200, 31-41 (2012).
- Drenan, R. M. Cholinergic modulation of locomotion and striatal dopamine release is mediated by α6β4* nicotinic acetylcholine receptors. J. Neurosci. 30, 9877-9889 (2010).
- Grady, S. R. Structural differences determine the relative selectivity of nicotinic compounds for native α4β2*-, α6β2*-, α3β4*- and α7-nicotine acetylcholine receptors. Neuropharmacology. 58, 1054-1066 (2010).
- Drenan, R. M. Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled α6 and β3 subunits. Mol. Pharmacol. 73, 27-41 (2008).
- Keath, J. R. Differential modulation by nicotine of substantia nigra versus ventral tegmental area dopamine neurons. J. Neurophysiol. 98, 3388-3396 (2007).
- Mansvelder, H. D. Bupropion inhibits the cellular effects of nicotine in the ventral tegmental area. Biochem. Pharmacol. 74, 1283-1291 (2007).
- Lee, S. The largest group of superficial neocortical GABAergic interneurons expresses ionotropic serotonin receptors. J. Neurosci. 30, 16796-16808 (2010).
- Margolis, E. B. Reliability in the identification of midbrain dopamine neurons. PLoS One. 5, e15222 (2010).
- Margolis, E. B. The ventral tegmental area revisited: is there an electrophysiological marker for dopaminergic neurons. J. Physiol. 577 (Pt 3), 907-924 (2006).
- Couey, J. J. Distributed network actions by nicotine increase the threshold for spike-timing-dependent plasticity in prefrontal cortex. Neuron. 54, 73-87 (2007).
- Yang, K. Distinctive nicotinic acetylcholine receptor functional phenotypes of rat ventral tegmental area dopaminergic neurons. J. Physiol. 587, 345-361 (2009).
- Endo, T. Nicotinic acetylcholine receptor subtypes involved in facilitation of GABAergic inhibition in mouse superficial superior colliculus. J. Neurophysiol. 94, 3893-3902 (2005).
- Bouzat, C. New insights into the structural bases of activation of Cys-loop receptors. J. Physiol. Paris. , (2011).
