Lever Imaging av GFP-merket Proteiner i Published: March 29, 2013 doi: 10.3791/50044

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Nancy Jo Pokrywka¹

¹Department of Biology, Vassar College

Summary

En protokoll for direkte avbildning av GFP-merket proteiner eller autofluorescent strukturer i enkelte

Abstract

Drosophila oocyte er etablert som et allsidig system for å undersøke grunnleggende spørsmål som cytoskeletal funksjon, celle organisasjon, og organelle struktur og funksjon. Tilgjengeligheten av ulike GFP-merket proteiner gjør at mange cellulære prosesser kan overvåkes i levende celler i løpet av minutter eller timer, og bruker denne teknikken, har prosesser som RNP transport, epithelial morphogenesis og vev remodeling blitt beskrevet i stor detalj i Drosophila oocytter ^1,2.

Evnen til å utføre video bildebehandling kombinert med et rikt repertoar av mutanter gir en enorm variasjon av gener og prosesser for å bli undersøkt med utrolige detaljer. Et slikt eksempel er prosessen med ooplasmic streaming, som initierer på midten oogenesen ^3,4. Dette sprek bevegelse av cytoplasmatiske vesikler er microtubule og kinesin-avhengige ⁵ og gir nyttige system for å undersøke cytoskjelettet funksjon på disse trinnene.

Her har jeg samlet en protokoll for tidsinnstilte avbildning av levende oocytter med nesten alle konfokalmikroskopi oppsett.

Protocol

1. Forbereder fluer for Dissection

1. Anesthetize sunne fluer ønskede genotype (for eksempel uttrykke en GFP-merket protein) som er mindre enn en uke gamle. Velg 10-15 store hunner med avrundede kremfargede underlivet.
2. Overføre de valgte fluer og noen (3-5) hanner til et hetteglass inneholdende ny lett yeasted mat og la fluene å fete i to dager ved 25 ° C. Referer til Weil et al. ⁶ for detaljer om Drosophila forberedelse. Fetende fluene sikrer at en rekke trinn, spesielt stadier 8-12, er tilgjengelige for avbildning. Dårlig fattened eller unfattened flyr vanligvis inneholder bare svært tidlige stadier (1-6) og modne (stadium 14) oocytter.

2. Forberedelse av ubefruktede egg for Imaging Bruke en Upright Compound mikroskop

1. Utarbeide en standard glass lysbilde ved å feste to dekkglass til lysbildet, ca 1 cm fra hverandre, ved hjelp av silikon grease. Bare bruke nok fett til å sikre god tetting mellom dekkglasset og lysbilde. Trykke hardt ned på hver dekkglasset vil spre fett tynt og jevnt. Legge til noen halocarbon olje 27 (Sigma) til tidspunktet mellom dekkglass og skyv. De vil tjene som avstandsstykker for å hindre skade isolerte oocytter i etterfølgende trinn. No 1,5 dekkglass fungerer godt, med en gjennomsnittlig tykkelse (0.16 til 0.18 mm) som samsvarer med sent stadium oocytter.
2. Plass 2-3 dråper halokarbon olje 27 på overflaten av en 22 mm ² dekkglasset. For å oppnå de sunneste oocytter mulig, er en individuell kvinnelig fjernet fra maten hetteglasset med Munnpipettering og forsiktig deponert i halocarbon olje uten først bedøvelse.
3. Skarpe dissecting tang (som Dumont # 5), pin flua mot dekkglass og trekk av spissen på magen. Fjern eggstokkene ved å dra dem langs overflaten av dekkglasset, under olje. Dette vil fremme adhesion av oocyttene til dekkglasset.
4. Forsiktig erte hverandre eggstokkene, på jakt etter egg som er minst stadium 10B av oogenesen. Oocytter ved dette stadiet kan identifiseres ved å se etter egg kamre der oocytt opptar minst 50-60% av det totale volum av egget kammeret. På dette punktet i oogenesen, har follicle celler overliggende oocyte blitt columnar, og omgir oocyte på alle kanter bortsett fra en liten region der forbindelser til sykepleier celler forblir. Bruk pinsett til å fjerne enkelte oocytter fra ovariole kappe.
5. Fortsett ved hjelp 1-3 hunner, inntil 5-8 uskadde oocytter har vært isolert på dekkglasset. Fjern eventuelle unuseable vev.
6. Nøye invertere dekkglasset inneholdende oocyttene på forhåndssortere forberedt lysbilde slik at oocyttene blir plassert mellom de to avstandselementene. Ikke trykk ned på den omvendte dekkglass som det vil skade oocytter. Om nødvendig, tilsette en liten mengde av olje til halokarbon than kantene av "sandwich" å sikre at rommet er fylt. (Valgfritt:. La lysbilde hvile i flere minutter for å tillate bosetting av dekkglass) Raset er nå klar for bildebehandling.

3. Forberedelse av ubefruktede egg for Imaging Bruke en Inverted Compound mikroskop

1. Oocytter er dissekert hovedsak som beskrevet i § 2, bortsett fra at små petriskåler med et glass nederst innsats (Mattek, 35 mm) brukes i stedet for dekkglass. Det er unødvendig å dekke prøven, og etter disseksjon, kan vev avbildes direkte i rettene, men forsiktighet må tas for å sikre oocyttene forblir dekket med olje og er ikke lov til å tørke ut.

4. Sanntidsavbildning

1. Ta en eggcelle i fokus ved hjelp av DIC eller fase kontrast optikk og undersøke oocyte for tegn på skade, for eksempel lekkasje av cytoplasma, eller svulmende av follicle celler. Kun bilde oocytter som vises sunn og uskadet.
2. Streaming kan overvåkes direkte uten behov for GFP merking, siden eggeplomme vesikler i cytoplasma er autofluorescent ^7. Dette signalet kan fanges i FITC utvalg av omfanget, men vil trolig kreve høyere forsterkning enn de som brukes for GFP-merkede proteiner.
3. De beste bilder av streaming oppnås fra optiske seksjoner som er like under overflaten av en oocytt som ligger mot dekkglass / Petri glass. Her oocyte er litt flat, noe som gjør for en bedre plan fokus. Bilder kan tas på 200X - 1000 X. Bruke ordningen beskrevet her, bør luft målsettinger brukes, siden dekkglasset danner en barriere mellom en oocytt og objektiv. Dette er optimal fordi den sterkt reduserer drift og bevegelse av prøven.
4. Når et område av interesse er i fokus, slå av brighfield optikk og bytte til confocal imaging. Bruke rask skanning / forhåndsvisning av programvaren må du justere fokus og fåsom nødvendig.
5. Innstillinger for fangst vil variere fra mikroskop til mikroskop, men generelle parametere er som følger: Bruk en eksitasjonsbølgelengde på ~ 488 nm og en emisjonsbølgelengde på ~ 515 nm. Sett opp Z-aksen fange slik at Z-aksen forblir konstant, med et etterslep på 10 sek mellom rammer. Capture en testsekvens på 5-10 rammer å sikre en oocytt er stasjonær og fokusplanet er hensiktsmessig.
6. En typisk tid forfalle sekvensen vil fange mellom 20-50 rammer, og kan bli vurdert umiddelbart etter fullføring å vurdere videokvalitet. Prosessen kan gjentas for andre celler i dekselet eller ytterligere hunner kan dissekert etter behov.

5. Feilsøking og vanlige problemer

1. Drift - Når du bruker en oppreist mikroskop, kan cellene noen ganger drive på grunn av spredning av olje. Dette kan reduseres ved å bruke bare nok olje til å dekke området under dekkglasset. Hvis problemet vedvarer, bruker mindre silikon grease å feste avstandsstykker til lysbildet.

Merk: Noen confocal programvarepakker tillate celle sporing, men generelt er det bedre å forlate avbildning av drivende oocytter og i stedet bruke en annen prøve.

2. Ingen tegn til streaming - Hvis streaming er ikke tydelig, er det sannsynligvis på grunn av en av to årsaker, enten fokalplanet for bildeopptak ikke er riktig (som regel for dypt inn i det indre av eggcelle) eller eggcelle er skadet. Tid og praksis kan minimalisere både feil.

Representative Results

Avbildning av GFP-merkede proteiner vil variere avhengig av hvor sterkt det kodede protein er uttrykt. A mid-trinns oocyte uttrykker reticulon-lignende 1 (Rtnl-1), ekson merket med GFP ^8,9 produserer sterkt signal. Rtnl-1 ser ut til å co-lokalisere med de lange mikrotubuli stede under ooplasmic streaming ¹⁰ (figur 1A). Rtnl-1 er en god markør for å observere streaming, og er også en indikator på microtubuli organisasjon i sent stadium oocytter.

Ooplasmic streaming i en wildtype egg kammer er tydelig så merkbar bevegelse av autofluorescent eggeplomme vesikler når du bruker en fangst rate på én ramme hver 10 sek (figur 1B). En maksimal projeksjon av fem rammer kan bli generert for å markere banen bevegelige vesikler.

Figur 1. Sanntidsavbildning av både autofluorescent og GFP-merket strukturer. A) En enkelt time-lapse bilde av en scene 11 oocytt uttrykker Rtnl1-GFP på 400x. Rtnl1-GFP fibre flytte med en bølge-lignende bevegelse i streaming oocytter. B) Et fem ramme maksimal projeksjon av en scene 10B egg kammer der autofluorescent eggeplomme vesikler ble avbildes hvert 10 sek for 50 sek sum på 400X forstørrelse. Skala bar = 30 mikrometer

Discussion

Drosophila oocytter er et allsidig modell system for adressering en rekke spørsmål knyttet til funksjon og organisering av celler og subcellulære komponenter. En fullstendig forståelse av protein funksjon krever overvåking av både romlige og tidsmessige aspekter ved protein atferd. Fremskritt i både imaging-systemer og de genetiske verktøy tilgjengelig for Drosophilists gjør det mulig for selv små laboratorier for å utføre høy kvalitet imaging eksperimenter i levende oocytter. Her vil jeg skissere en protokoll for å analysere atferden til GFP-merket eller autofluorescent proteiner og strukturer under midten til slutten av oogenesen som kan brukes i forbindelse med en rekke genetiske bakgrunn for å sondere protein funksjon.

I denne protokollen beskriver jeg den prosessen som oocytter er forberedt for bildebehandling og de grunnleggende confocal innstillinger som vil gjøre kjøp av tid lapse video av fluorescerende proteiner og strukturer. Ytterligere details for oocytten forberedelse er beskrevet av Weil et al. ⁶ Et bredt utvalg av fly-stammer som uttrykker proteiner som er stemt endogent tagget via ekson-fangst er tilgjengelig ^8, og uendelig mer protein varianter kan være konstruert og gjeninnføres til fluer.

I arbeidet med levende vev, er helsen til prøvene av overordnet betydning. Egg kamre fra scenen 10B kan fullføre oogenesen i en hovedsak selvstendig mote ^11, noe som gjør dem ideelle for kortsiktige imaging studier. Care må tas ved flere viktige tiltak for å få data av høy kvalitet. Under disseksjonen er det viktig å manipulere eggstokkene og oocytter så lite som mulig, og for å redusere mengden av tid mellom disseksjon og ferdigstillelsen av bildebehandling. Ideelt sett bør en liten disseksjon stasjonen bli plassert i samme rom som huser confocal omfang, og bare noen få egg kamre gangen skal avbildes. Tallet anbefalt her (5-8) Sikrer at disseksjon tid er minimert samtidig maksimere sannsynligheten for å oppnå gode bilder. Jeg anbefaler å ta en kort serie med bilder for å vurdere bildekvaliteten og bekrefter at fangst innstillingene er optimalisert, før du tar en lengre tid lapse sekvens. Det meste av programvaren tillater individuelle rammer for å bli frelst, og disse bildene kan deretter bli analysert i en rekke måter ved hjelp av ImageJ ¹² eller annen programvare.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Halocarbon oil 27	Sigma-Aldrich	H8773-100ML
#5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Silicon grease	Sigma Aldrich	Z273554-1EA
Glass-bottom Petri dishes	MatTek	P35G-0-20-C