Summary
O protocolo a seguir fornece técnicas para encapsular as células pancreáticas β na etapa de crescimento-PEG-péptido hidrogeles formados por reacções foto-clique tiol-eno. Esta plataforma de material não só proporciona um microambiente cytocompatible para encapsulamento de células, mas também permite que controlado pelo utilizador a recuperação rápida de estruturas de células formadas dentro dos hidrogéis.
Abstract
Os hidrogéis são polímeros reticulados hidrófilos que proporcionam um microambiente tridimensional com tecido semelhante a elasticidade e permeabilidade elevada para a cultura de células ou tecidos terapeuticamente relevantes. Hidrogeles preparados a partir de poli (etileno glicol) (PEG), os derivados são cada vez mais utilizados para uma variedade de aplicações de engenharia de tecidos, em parte devido às suas propriedades e cytocompatible sintonizáveis. Neste protocolo, utilizamos tiol-eno etapa de crescimento photopolymerizations para fabricar PEG peptídeo-hidrogéis para encapsular pancreático MIN6 b-células. Os géis foram formadas por 4 braços PEG-norborneno macrómero (PEG4NB) e um agente de reticulação de péptidos quimotripsina-sensível (CGGYC). A natureza hidrófila e não-incrustante de PEG proporciona um microambiente cytocompatible para sobrevivência e proliferação celular em 3D, enquanto o uso de quimotripsina sensível sequência peptídica (C GGY ↓ C, seta indica local de clivagem da enzima, enquanto cisto terminaiseine resíduos foram adicionados por tiol-eno reticulação) permite uma recuperação rápida de estruturas celulares que formam dentro do hidrogel. O protocolo que se segue desenvolve técnicas para: (1) encapsulamento dos MIN6 β células-tiol-eno hidrogéis, (2) ensaios de viabilidade qualitativa e quantitativa de células para determinar a sobrevivência e proliferação das células, (3) A recuperação de esferóides de células usando quimotripsina mediada gel erosão, e (4) a análise estrutural e funcional dos esferóides recuperados.
Introduction
Hidrogéis são hidrofílicas polímeros reticulados com potencial excepcional como materiais de andaimes para reparar e regenerar os tecidos. 1-3 O alto teor de água de hidrogéis permite fácil difusão de oxigênio e troca de nutrientes e produtos metabólicos celulares, os quais são fundamentais para a manutenção da viabilidade celular. Além disso, os hidrogéis são excelentes veículos para a libertação controlada e distribuição das células, devido a sua alta tunability. Dois hidrogeles sintéticos tais como aqueles preparados a partir de poli (etileno glicol) (PEG) são cada vez mais utilizados em aplicações de engenharia de tecidos, em grande parte devido à sua cytocompatibility, tecido- como a elasticidade, e tunability elevado em material as propriedades físicas e mecânicas. 4-6
Apesar de uma plataforma de hidrogel de uso geral, os estudos mostraram que o PEG diacrilato (PEGDA) hidrogeles formados por cadeia de crescimento photopolymerizations têm uma tendência para danificar as células encapsuladas during reticulação da rede e na encapsulação de células in situ. 7 O dano celular foi largamente atribuída a espécies de radicais livres gerados pelas moléculas de fotoiniciador, que se propagam através dos grupos de vinil sobre PEGDA a cadeias de polímero em ligação cruzada de hidrogéis. Infelizmente, estas espécies radicalares também provocar tensões e danos celulares durante a encapsulação de células, especialmente para radical células sensíveis, tais como as células pancreáticas β. 8-10 De modo a obter um tamanho de malha maior para uma melhor difusão e sobrevivência celular, pesos moleculares mais elevados PEGDA são muitas vezes utilizados para a encapsulação de células. Isto, no entanto, compromete a cinética de polimerização e causa sub-óptimas propriedades de gel biofísicos. 7,11,12 Além das desvantagens acima mencionadas, é muito difícil recuperar as estruturas celulares a partir de hidrogéis PEGDA devido à natureza heterogeneidade e não degradável de as redes reticuladas. Enquanto protease sensíveis péptidos podem ser incorporadosem PEG backbone de macrómero para processar os hidrogéis de outro modo inertes PEGDA sensíveis à clivagem enzimática, a conjugação frequentemente utiliza reagentes dispendiosos e as redes resultantes contêm ainda elevado grau de heterogeneidade devido à natureza da cadeia de crescimento-polimerização. 13-15
Recentemente, o PEG-péptido hidrogeles formados via passo crescimento fotopolimerização-tiol-eno Foi demonstrado que exibem propriedades preferenciais para a encapsulação de células sobre hidrogeles formados por fotopolimerização cadeia crescimento. 7 A cinética de gelificação superiores de tiol-eno hidrogéis é atribuído ao clique " "natureza da reação entre o tiol e funcionalidades Ene. Em comparação com o crescimento da cadeia de polimerização de PEGDA, tiol-eno reacção é menos inibida de oxigénio o que resulta em taxas mais rápidas de gelificação. 16,17 tiol-eno hidrogeles também têm uma maior eficiência de polimerização e melhores propriedades biofísicas do gel comparado com o crescimento da cadeia-PEGDA hidrogéis, 7 , 18 </ Sup>, que resulta em dano celular limitada causada por espécies de radicais livres durante a fotopolimerização.
Anteriormente, tiol-eno hidrogéis formada por quatro braços-PEG-norborneno (PEG4NB) macrómero e de cisteína bis-reticuladores contendo péptidos, tais como a protease sensíveis péptidos têm sido utilizados para a encapsulação de células. Tunability 7,18 Alta de redes de hidrogel de PEG proporciona um flexível e controlável microambiente 3D para investigar a sobrevivência de células e de actividade, enquanto que a utilização de protease-sensitive sequência peptídica fornece uma forma suave para a recuperação de estruturas celulares formadas naturalmente dentro de hidrogéis. Neste protocolo, utilizamos passo crescimento fotopolimerizável tiol-eno hidrogéis fabricado usando 4-braço PEG-norborneno (PEG4NB) e um agente de reticulação de péptidos quimotripsina-sensível (CGGY ↓ C) para a encapsulação de células β MIN6. Este protocolo sistematicamente elabora técnicas para estudar a formação de proliferação, sobrevivência e esferóide de MIN6β células-tiol-eno hidrogeles. Nós ainda proporcionar um método para a recuperação de células β esferóide e caracterização biológica de esferóides recuperados.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
A. Macrómero e Peptide Synthesis
- Sintetizar quatro braço-PEG-norborneno (PEG4NB) e arylphosphanate fotoiniciador lítio (LAP), usando protocolos estabelecidos 18,19.
- Sintetizar bis-cisteína contendo quimotripsina sensível peptídeo CGGY ↓ C (seta indica quimotripsina local de clivagem) utilizando padrão de síntese de péptidos em fase sólida num sintetizador de péptidos de microondas (CEM Discover SPS).
- Calcula-se a quantidade de resina (Rink amida-resina MBHA) necessário com base na relação de substituição da resina e a escala de síntese. Inchar a resina no seio de dimetilformamida (DMF) num recipiente de reacção (RV), durante 15 min.
- Remover grupo protector Fmoc a partir da resina utilizando uma solução de desprotecção, contendo 20% de piperidina e 0,1 M de HOBt em DMF. Use os parâmetros listados na tabela abaixo para o forno de microondas, Fmoc-desprotecção (para todos os ácidos Fmoc-amino):
Escala de síntese 0,1 mmol 0,2 mmole Poder 20 W 50 W Temperatura 75 ° C 75 ° C Tempo 3 min 3 min - Após desprotecção, lavar a resina com DMF e executar o teste de ninhidrina para confirmar a remoção do Fmoc (exposição de amina N-terminal). Resina deve ficar azul após 2 min a 95 ° C.
- Após a desprotecção bem sucedida par, o Fmoc-aminoácido primeiro no terminal-C (síntese decorre de C-para N-terminal) de uma solução de base de activador (0,28 M di-isopropiletilamina (DIEA) em DMF), com os parâmetros listados na tabela a seguir .
Escala de síntese 0,1 mmol 0,2 mmole Poder 20 W 50 W * Temperatura 75 ° C 75 ° C * Tempo 5 min 5 min
* Para Cisto e Seu, use 50 ° C e 10 min para reduzir racemização. - Enxaguar a resina e executar o teste de ninidrina para qualitativamente confirmar a conclusão do acoplamento (desaparecimento da amina N-terminal). Resina deve ser claro depois de 5 min a 95 ° C. Repita o passo de acoplamento (A.2.d) se o teste de ninidrina retorna resultado positivo (cor azul).
- Repetir a desprotecção (passo A.2.b) e de acoplamento (A.2.d passo) para aminoácidos adicionais na sequência termina com uma etapa de desprotecção final.
- Escorra a RV, lavar a resina com 25 ml de diclorometano (DCM). Este passo é para enxaguar DMF, que é uma base e impede a clivagem do péptido.
- Prepare cocktail de clivagem pela mistura de 250 mg de fenol em 4,75 ml de ácido trifluoroacético (TFA), 0,125 ml de triisopropilsilano (TIS) e 0,125 ml de DDQ 2 O.
- Adicionar a solução de clivagem para a RV e decompor durante 30 minutos no micro-ondas sintetizador de péptidos (Power = 20 W; Temperatura = 38 ° C).
- Recolher a solução de péptido em um tubo de centrífuga de 50 ml, utilizando tubagem de vácuo.
- Peptídeo clivado precipitado em 40 ml de éter, o tubo de vórtice e centrifuga-se a 3000 rpm durante 5 min para recolher o péptido.
- Escorra o sobrenadante e repetir A.2.k passo duas vezes.
- Recolher e secar em vácuo de péptidos.
- Purifica-se o péptido por HPLC e caracterizá-lo com a espectrometria de massa.
B. Preparação de Material e Esterilização
- Preparar solução a 20% em peso de PEG4NB em PBS, vórtice a mistura até que o macrómero dissolve-se completamente, e esterilizar a solução de macrómero a utilização de um filtro de seringa. Armazene a solução de esterilização a -20 ° C (preparar alíquotaspara armazenamento de longo prazo).
- Preparar e esterilizar 2% em peso de foto-iniciador (LAP) solução em PBS. Armazene a solução de esterilização a temperatura ambiente, protegida da luz.
- Dissolve-se o peptídeo (CGGYC) em PBS, a mistura de vórtice e seringa filtrar a solução para esterilização. Alíquota da solução de péptido e armazenar a -20 ° C até ser usado (evitar congelar-descongelar).
- Determinar tiol (-SH), concentração na solução do péptido preparado usando o reagente de Ellman (seguir o protocolo do fabricante). Este passo irá dar uma concentração de péptido precisas (isto é, [SH] / 2) que é necessária para o cálculo da quantidade de péptido a ser utilizado em tiol-eno foto-clique reacções.
- Preparar moldes de gelificação, cortando a porção superior fora de seringas de 1 ml estéreis descartáveis usando uma lâmina de barbear (ponta aberta para a remoção do gel). Esterilizar os moldes de seringas em autoclave.
- Com base na formulação de gel desejada (tiol para eno ratio = 1) e as concentrações de mate estoqueriais, calcular o volume necessário de polímero, agente de reticulação de péptidos, fotoiniciador, e soluções tampão requeridas.
C. Preparação celular
- Equilibre meio de cultura celular (alta glucose DMEM contendo 10% de soro fetal de bovino; antibiótico-antimicótico com 100 U / penicilina ml, estreptomicina 100 ug / ml, 250 ng / ml de Fungizone, e 50 uM β-mercaptoetanol), Hank solução salina equilibrada ( HBSS, Ca 2 +, Mg 2 + livre), e de Tripsina-EDTA a 37 ° C.
- Remover frascos contendo MIN6 β células de incubadora de CO 2 e colocar as garrafas no câmara de fluxo laminar.
- Aspirar os meios de cultura de células a partir dos balões e enxaguar a célula com HBSS.
- Tripsinizar as células utilizando 3 ml de 2X (0,1%) Tripsina-EDTA e incubar os balões durante 4 min a 37 ° C e 5% CO 2.
- Nota: Use 2X solução de tripsina permite a dissociação completa do MIN6 β células em suspensão de célula única.
- Após a incubação, os frascos toque na superfície do exaustor suavemente para separar completamente as células. Confirmar o desprendimento e dissociação das células, usando um microscópio.
- Adicionar um volume igual de meio de cultura celular para neutralizar a tripsina. Misture bem a solução por pipetagem suave, em seguida, transferir a mistura para um tubo de centrífuga e canónico durante 5 min a 1000 rpm.
- Aspirar o sobrenadante e gentilmente re-suspender as células em 4-5 ml de meio de cultura.
- Determinar a densidade celular, utilizando 50% de tampão de azul de Trypan, em um hemocitómetro.
D. Hidrogel de fabricação e encapsulamento celular
- Uma vez que as células estão prontas, mistura (com base numa razão de 1:1 a tiol eno) os volumes necessários de PEG4NB, CGGYC, LAP, a solução da célula e, em HBSS em um tubo de microcentrífuga.
- Misture a solução suavemente com uma pipeta para se obter uma mistura homogénea e adicionar 25 uL da solução resultante para um molde de uma seringa. Expor a seringa à luz UV (365nm, 5 mW / cm 2) durante 2 min.
- Fotopolimerização seguinte, géis mergulhar num meio com 24 cavidades da placa de cultura estéril contendo células e incubar os hidrogéis de 37 ° C e 5% CO 2.
- Lave as células carregadas de hidrogéis em meio de cultura de células durante 30 minutos para lavar as células fracamente ligados e não-reticuladas macrómeros. Transferir o gel para um meio fresco.
- Meios de cultura de células de actualização a cada 2 a 3 dias.
E. Ensaio de viabilidade celular
Morfologia da célula encapsulada pode ser observada usando microscopia de luz (uma vez que os hidrogeles são sintetizados transparente). A viabilidade celular pode ser visualizado e medido qualitativamente utilizando vivo / Dead coloração e quantitativamente utilizando o reagente AlamarBlue.
E.1. Vivo / Morto coloração
- Descongele reagentes ao vivo / Dead coloração à temperatura ambiente.
- Num tubo de canónica adicionar PBS de acordo com o número de amostras (n) a ser corado:
- Pipetar ul de 0,25 calceína AM e 2 ul de EthD-1 por 1 ml de PBS ao tubo contendo PBS canónica. Solução a vórtice para misturar os componentes.
- Incubar células carregadas de hidrogéis à solução de coloração Live / Dead (0,5 ml / amostra) durante 1 hora à temperatura ambiente num agitador orbital.
- Utilizando uma pipeta de Pasteur, remover a solução de corante e lavar a amostra duas vezes com PBS.
- Coloque em uma amostra de lamínula ou lâmina de vidro. Observe e células de imagem usando um microscópio confocal.
E.2. AlamarBlue Ensaio
- Preparar 10 v / v% solução AlamarBlue em meio de cultura celular.
- Remover hidrogéis da incubadora e aspirar a mídia para fora de cada bem, sem fazer qualquer contato com o hidrogel.
- Incubar células carregadas de hidrogéis e um (controle negativo) bem vazio em 500 ul de solução a 10% AlamarBlue durante 16 horas.
- Após a incubação, 200 uL de pipetada solução de AlamarBlue numa placa de 96 poços e fluorescência medida utilizando um leitor de microplacas (excitação: 560 nm, emissão: 590 nm).
- Maior actividade metabólica celular reduz o corante para conferir uma maior leitura de fluorescência.
- Certifique-se de incluir pelo menos dois poços de 10% de solução Alamarblue como espaços em branco. Ao analisar os dados, subtrair o valor em branco média de fluorescência a partir da leitura de fluorescência das amostras.
F. Chymotrypsin Mediada Erosão Gel e Recuperação Spheroid
- Prepare 1 mg / ml de tripsina-livre solução α-quimotripsina em HBBS e estéril da solução no filtro.
- Incubar hidrogéis à solução quimotripsina (500 uL para cada gel) à temperatura ambiente com agitação suave até que a erosão gel completa seja alcançada.
- Para um gel de 25 ul, o tempo para a erosão completa é de cerca de 5 min.
- Colocar a placa em gelo durante alguns minutos para reduzir a actividade dequimotripsina.
- Transferir a solução de células em 1 ml de tubo e centrifuga-se a 300 rpm, 4 ° C durante 2 min.
- Cuidadosamente remover o sobrenadante com uma pipeta de pasto e gentilmente ressuspender os esferóides em HBSS.
- Transferir a solução recuperada esferóide para uma placa de 24 poços e colocar a placa em gelo para permitir que os esferóides se estabelecer.
- Para a análise de tamanho, a aquisição de imagens de contraste de fase dos esferóides liquidadas utilizando um microscópio de luz. Medida recuperado diâmetros esferóides usando softwares como o elemento Nikon software ou ImageJ.
G. Ensaio Funcional de esferóides Recuperadas
G.1. Glucose a secreção de insulina estimulada a partir dos esferóides de células recuperadas
- Numa placa de 24 poços, incubam os géis em 500 ul de 2 mM de glucose baixa Kerbs-tampão de Ringer (KRB), durante 1 hora.
- Corroer o gel e recuperar esferóides de células utilizando passos F.1 a F.6.
- Aspirar o sobrenadante cuidadosamente, sem fazer qualquercontacto com os esferóides de células e ressuspender os esferóides em 500 ul de 2 mM de glucose KRB baixo.
- Transferir 100 uL de solução de esferóides de células para um tubo de 0,6 ml e colocá-lo em gelo para a quantificação de ATP intracelular.
- Dividir a solução de células remanescente em esferóide metade (em dois tubos de microcentrifugação) e centrifugar durante 2 minutos a 300 rpm e 4 ° C.
- Aspirar o sobrenadante (quase para o fundo) e ressuspender a primeira metade de esferóides de células em 1 ml de 25 mM de glicose alta KRB e segunda metade, em 1 ml de 2 mM de glucose KRB baixo.
- Pipetar suavemente e transferir a solução contendo esferóides de células recuperadas a uma placa de 24 poços. Incubar a placa durante 1 hora a 37 ° C e 5% CO 2.
- Após a incubação, transferir a solução para um tubo de microcentrifugação e centrifugar durante 2 minutos a 1.000 rpm e 4 ° C.
- Transferir 500 uL do sobrenadante a partir do tubo centrifugado para outro tubo de microcentrífuga e armazenar a 4 ° C para insulinaELISA.
- Executar o protocolo do fabricante de insulina ELISA seguinte.
G.2. CellTiter Ensaio Glo
- Padrões de ATP: Prepara-se uma solução de ATP 10 uM e realizar diluições em série para se obter uma série de 8 de soluções-padrão.
- Para uma placa de 96 branco cavidade, adicionar 50 ul de uma solução de esferóide célula (a partir do passo G.1.6) e padrões.
- A cada poço contendo as amostras e os padrões, adicionar 50 ul de reagente CellTiter Glo e incubar à temperatura ambiente durante 15 min.
- Após a incubação, a contagem de medida de luminescência das amostras e padrões usando um leitor de microplacas e calibrar as concentrações de ATP de amostras, utilizando uma curva de regressão linear gerados pelos padrões de ATP.
- Determinar a concentração de ATP total em amostra e multiplicar pelo factor de diluição da amostra para obter a concentração de ATP intracelular em uma célula carregada de hidrogel.
G.3. Determinar a secreção de insulina
- Calcular a amount de insulina secretada a partir dos esferóides recuperados, tendo a razão entre a quantidade de insulina segregada no meio de glucose elevada a quantidade de insulina segregada no meio de glucose baixa.
- Normalizar o teor de insulina quantificados de esferóides de células com respectiva quantidade de ATP intracelular dos esferóides celulares recuperados.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
As Figuras 1-4 mostram os resultados de sobrevivência representativos para a encapsulação, a proliferação, a formação de esferóides, e recuperação esferóide tiol-eno em hidrogéis. Figura 1 mostra o esquema da reacção de (1) um passo de crescimento de fotopolimerização tiol-eno usando PEG4NB e CGGYC, e ( 2) a quimotripsina erosão gel mediada que segue um mecanismo de erosão de superfície. Figuras 2 e 3 apresentam os resultados obtidos utilizando-se a viabilidade de coloração Live / Dead e ensaio AlamarBlue. Observa-se que as células proliferaram no PEG4NB-CGGYC hidrogéis mesmo a baixa densidade de empacotamento das células, indicando que o cytocompatibilty de tiol-eno sistema hidrogel. Figura 4 mostra imagens de contraste de fase das células encapsuladas e recuperou-β esferóides, bem como a distribuição do tamanho da recuperado β células esferóides.
_upload/50081/50081fig1highres.jpg "src =" files/ftp_upload/50081/50081fig1.jpg / "/>
Figura 1. Esquemática do passo de crescimento-tiol-eno foto-clique reacção utilizando PEG4NB e CGGYC para formar PEG-péptido conjugado. Os hidrogéis podem ser erodida rapidamente pelo tratamento quimotripsina.
Figura 2. Viabilidade inicial e esférica de células formadas em hidrogéis PEG4NB/CGGYC. (A) Live / Dead coloração foi realizada imediatamente após a foto-encapsulação. (B) Live / Dead coloração realizada após 10 dias de cultivo in vitro. Representativos confocal z-stack imagens de MIN6 β células encapsuladas em hidrogéis% 4WT PEG4NB/CGGYC (2 x 10 6 células / ml, escala = 100 um). A viabilidade das células foi definida como a percentagem de tempo real (verde), as células mais células totais (verde + vermelho) contagem. (2 x 10 6 células / ml, N = 4, média ± DP).
Figura 3. A actividade metabólica de células β MIN6 medido como uma função do tempo pelo reagente AlamarBlue (N = 3, média ± DP). MIN6 β células encapsuladas em 3WT%,% 4WT e hidrogéis PEG4NB/CGGYC 5wt% a 2 x 10 6 células / ml.
Figura 4. Caracterização de células recuperadas MIN6 β-esferóides. Esferóides de células foram recuperadas a partir de PEG4NB/CGGYC usando 40 uM quimotripsina após 10 dias de cultura in vitro. (A) representativas da imagem de contraste de fase das células encapsuladas β-esferóides. (B) Representante imagem de contraste de fase das células recuperadas β-esferóides. (C) o Distribuiçãof diâmetros esferóides (densidade celular = 1 x 10 7 células / ml).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O protocolo descrito apresenta detalhes sobre a encapsulação de células simples em tiol-eno hidrogeles formados a passo de crescimento de fotopolimerização. Enquanto uma proporção estequiométrica de 1:1 de norborneno para grupos funcionais tiol foi utilizada neste protocolo, a razão pode ser ajustada de acordo com as experiências. Para além de uma formulação correcta, é importante para manter a homogeneidade da solução de pré-polímero. Em particular, a utilização de pipetagem suave para assegurar que as células são bem distribuídas na solução de pré-polímero, a fim de evitar a aglutinação de células e variação nas propriedades de gel. Apesar de um tempo de polimerização de 2 min foi usado para reticulação de gel, gel para o ponto de tiol-eno hidrogéis é inferior a 10 segundos, na maioria das células-encapsulação relevantes formulações (por exemplo, o ponto de gel para 4% em peso de hidrogel PEG4NB/CGGYC é de 7 ± 2 sec e 5% em peso de 6 ± 1 seg.) A gelificação rápida deste sistema hidrogel rapidamente bloqueia as células no local, resultando em melhor celdistribuição l em 3D em comparação com outros sistemas de fotopolimerização que levar minutos ou até horas para alcançar o ponto de gel. 7,20
Além disso, β-esferóides de células formados naturalmente em tiol-eno hidrogéis foram recuperados por quimotripsina mediada por erosão do gel. Quimotripsina, no entanto, é uma enzima da família da tripsina e da alta concentração ou do tempo de incubação longo desta enzima podem afectar negativamente a interacções célula-célula ou mesmo perturbar a arquitetura esferóide durante a recuperação. A fim de evitar esta potencial limitação, os hidrogéis podem ser reticulados por outros substratos tiolados e erosão gel pode ainda ser conseguida por enzimas adequadas que não provocam interacção célula-célula adversa.
No geral, tiol-eno hidrogéis proporcionar um ambiente cytocompatible para promover a proliferação das células-β em 3D. Este sistema pode ser utilizado para a cultura e estudar o comportamento fisiológico de vários tipos de células em 3D. Além disso,este sistema permite a recuperação fácil de estruturas celulares formados no interior da matriz de hidrogel para caracterizações mais funcionais e biológicas. Este sistema hidrogel diversificada e cytocompatible fornece a plataforma gel para complexos de engenharia de tecidos em 3D para aplicação medicina regenerativa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este projeto foi financiado pelo NIH (R21EB013717) e OVCR IUPUI (RSFG). O autor agradece a Sra. Han Shih por sua assistência técnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-arm PEG (20kDa) | Jenkem Technology USA | 4ARM-PEG-20K | |
| Fmoc-amino acids | Anaspec | ||
| Live/Dead cell viability kit | Invitrogen | L3224 | Includes Calcein AM and Ethidium homodimer-1 |
| AlamarBlue reagent | AbD Serotec | BUF012 | |
| CellTiter Glo reagent | Promega | G7570 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | Without Ca+2 and Mg+2 |
| HBSS | Lonza | 10547F | Without Ca+2 and Mg+2 |
| High Glucose DMEM | Hyclone | SH30243.01 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| β-Mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522-100ML | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | |
| Trypsin-free α-chymotrypsin | Worthington Biochemical Corp | LS001432 | |
| Mouse Inusin ELISA kit | Mercodia | 10-1247-01 | |
| 1 ml disposable syringe | BD biosciences |
References
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and bioengineering. 103, 655-663 (2009).
- Lin, C. C., Anseth, K. S. PEG hydrogels for the controlled release of biomolecules in regenerative medicine. Pharmaceutical research. 26, 631-643 (2009).
- Lin, C. C., Metters, A. T. Hydrogels in controlled release formulations: network design and mathematical modeling. Advanced drug delivery reviews. 58, 1379-1408 (2006).
- Khetan, S., Burdick, J. A. Patterning hydrogels in three dimensions towards controlling cellular interactions. Soft Matter. 7, 830-838 (2011).
- Aimetti, A. A., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Human neutrophil elastase responsive delivery from poly(ethylene glycol) hydrogels. Biomacromolecules. 10, 1484-1489 (2009).
- Weber, L. M., He, J., Bradley, B., Haskins, K., Anseth, K. S. PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled beta-cell microenvironments. Acta biomaterialia. 2, 1-8 (2006).
- Lin, C. C., Raza, A., Shih, H. PEG hydrogels formed by thiol-ene photo-click chemistry and their effect on the formation and recovery of insulin-secreting cell spheroids. Biomaterials. 32, 9685-9695 (2011).
- Lin, C. C., Anseth, K. S. Glucagon-like peptide-1 functionalized PEG hydrogels promote survival and function of encapsulated pancreatic beta-cells. Biomacromolecules. 10, 2460-2467 (2009).
- Lin, C. C., Anseth, K. S. Cell-cell communication mimicry with poly(ethylene glycol) hydrogels for enhancing beta-cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 6380-6385 (2011).
- Hui, H., Nourparvar, A., Zhao, X., Perfetti, R. Glucagon-like peptide-1 inhibits apoptosis of insulin-secreting cells via a cyclic 5'-adenosine monophosphate-dependent protein kinase A- and a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway. Endocrinology. 144, 1444-1445 (2003).
- Weber, L. M., Lopez, C. G., Anseth, K. S. Effects of PEG hydrogel crosslinking density on protein diffusion and encapsulated islet survival and function. Journal of biomedical materials research. Part A. 90, 720-729 (2009).
- Weber, L. M., Hayda, K. N., Haskins, K., Anseth, K. S. The effects of cell-matrix interactions on encapsulated beta-cell function within hydrogels functionalized with matrix-derived adhesive peptides. Biomaterials. 28, 3004-3011 (2007).
- Hsu, C. W., Olabisi, R. M., Olmsted-Davis, E. A., Davis, A. R., West, J. L. Cathepsin K-sensitive poly(ethylene glycol) hydrogels for degradation in response to bone resorption. Journal of biomedical materials research. Part A. 98, 53-62 (2011).
- Leslie-Barbick, J. E., Moon, J. J., West, J. L. Covalently-immobilized vascular endothelial growth factor promotes endothelial cell tubulogenesis in poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels. Journal of biomaterials science. Polymer. 20, 1763-1779 (2009).
- Moon, J. J., Hahn, M. S., Kim, I., Nsiah, B. A., West, J. L. Micropatterning of poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels with biomolecules to regulate and guide endothelial morphogenesis. Tissue engineering. Part A. 15, 579-585 (2009).
- Hoyle, C. E., Bowman, C. N. Thiol-ene click chemistry. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 49, 1540-1573 (2010).
- Hoyle, C. E., Lowe, A. B., Bowman, C. N. Thiol-click chemistry: a multifaceted toolbox for small molecule and polymer synthesis. Chemical Society reviews. 39, 1355-1387 (2010).
- Fairbanks, B. D., et al. A Versatile Synthetic Extracellular Matrix Mimic via Thiol-Norbornene Photopolymerization. Adv. Mater. 21, 5005 (2009).
- Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30, 6702-6707 (2009).
- Zustiak, S. P., Leach, J. B. Characterization of protein release from hydrolytically degradable poly(ethylene glycol) hydrogels. Biotechnology and bioengineering. 108, 197-206 (2011).
