De experimentele ontwerpen voorgesteld hier richten op het bestuderen van de effecten van blootstelling aan alcohol in apoptose en de toepassing van neurotrophic peptide tijdens de zwangerschap in de foetale hersenen. Een gedetailleerde beschrijving van de kweek tot de verzameling van foetale hersenen beschreven. Technieken voor de bepaling van apoptose nader omschreven.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Experimentele methoden voor het testen van de effecten van Neurotrophic Peptide, ADNF-9, Tegen Alcohol-geïnduceerde apoptose tijdens de zwangerschap in C57BL / 6 muizen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Experimentele ontwerpen voor onderzoek naar de effecten van prenatale blootstelling aan alcohol tijdens de vroege embryonale stadia in de groei van de foetus hersenen zijn uitdagend. Dit is vooral te wijten aan de moeilijkheid van microdissectie van foetale hersenen en het snijden voor het bepalen van apoptotische cellen door prenatale blootstelling aan alcohol. De hier beschreven experimenten geven gevisualiseerd technieken muizen fokken tot de identificatie van celdood in foetaal hersenweefsel. Deze studie gebruikte C57BL / 6 muizen als diermodel voor de studie van foetaal alcohol blootstelling en de rol van trofische peptide tegen alcohol-geïnduceerde apoptose. De kweek bestaat uit een 2-uur venster matten om de exacte fase van de embryonale leeftijd. Een gevestigde foetale model alcoholblootstelling is gebruikt in deze studie om de effecten van prenatale blootstelling aan alcohol in foetale hersenen bepalen. Het gaat om de vrije toegang tot alcohol of paargevoede vloeibaar dieet als de enige bron van voedingsstoffen voor de zwangere muizen.
Voor het onderzoeken van apoptose, worden foetale hersenen eerst ingebed in gelatine met behulp van een schil-weg mal om hun snijden met een vibratome apparatuur te bevorderen. Foetale hersenen ingebed en gefixeerd in paraformaldehyde zijn gemakkelijk doorgesneden, en de vrij zwevende secties kunnen in superfrost plus dia's worden gemonteerd voor bepaling van apoptose of celdood.
TUNEL (TdT-gemedieerde dUTP Nick End Labeling; TdT: terminal deoxynucleotidyltransferase) assay werd gebruikt om celdood of apoptotische cellen te identificeren. Het is opmerkelijk dat apoptosis en celgemedieerde cytotoxiciteit wordt gekenmerkt door DNA fragmentatie. Dus de gevisualiseerde TUNEL-positieve cellen indicatief celdood of apoptotische cellen.
De experimentele ontwerpen hier vindt u informatie over het gebruik van een gevestigde vloeibaar dieet voor het bestuderen van de effecten van alcohol en de rol van de neurotrofe peptiden tijdens de zwangerschap in de foetale hersenen. Het gaat om het fokken en voederen zwangere muizen, microdissecting foetale hersenen, en het bepalen van apoptose. Samen kunnen deze visuele en tekstuele technieken een bron voor het onderzoeken van prenatale blootstelling aan schadelijke stoffen in de foetale hersenen zijn.
Inleiding
Het doel van het hier beschreven experimentele methoden is om de neuroprotectieve effecten van trofische peptiden beoordelen in een foetale blootstelling model alcohol met behulp van verschillende technieken met fokkerij, voeding, microdissecting, en het opsporen van celdood. Werken vanuit ons laboratorium heeft betrekking op een vloeibaar dieet gemengd met alcohol als een model van matig alcohol drinken, die vergelijkbaar is met een menselijke paradigma drinken in termen van de hoeveelheid alcohol kan zijn geconsumeerd 1-5. Wij en anderen hebben drie peptide derivaten die neuroprotectieve tegen de schadelijke effecten van blootstelling foetaal alcohol geï....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Dieren Fokkerij en Trofische Peptide behandeling
- Breed C57BL/mice door het plaatsen van de vrouwelijke muizen (~ 6 weken oud, gemiddeld gewicht 20 gram) in mannelijke huis kooien voor 2 uur.
- Controleer voor een zaadcel stekker en / of vaginaal uitstrijkje onmiddellijk daarna.
- Indien positief, wijzen dit tijdstip als embryonale dag 0 (E0).
- Op E7, gewicht-match drachtige vrouwtjes om de controle en behandeling groepen (3 groepen) worden toegewezen zoals recent beschreven 4: 1) Alcohol (ethanol) vloeibaar dieet groep (ALC); 2) paarsgewijs gevoerde controlegroep (PF); 3) Peptide behandelgroep, die intraperitoneale (i....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De experimentele methoden hier beschreven tonen aan dat een 2-uur-venster fokken is van essentieel belang om in te schatten nauwkeurige zwangerschapsduur podium. We hebben de dissectie van de embryo's gedemonstreerd op de leeftijd van E13. We hebben ook aangetoond microdissection van foetale hersenen bij E13. De procedure meerdere fasen (ac), zoals beschreven in figuur 1. Foetale hersenen worden ontleed uit de basis van de primordium bulbus olfactorius aan de basis van de metencephalon (figu.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De en-technieken die in deze studie tonen de effecten van prenatale blootstelling aan alcohol in foetale hersenen en de rol van trofische peptiden in de preventie van deze effecten. Deze kunnen informatie over hoe u andere drugs van misbruik of andere giftige chemicaliën in de foetale hersenen tijdens de verschillende stadia zwangerschap bestuderen bieden.
Met betrekking tot het paradigma kweken, in sommige gevallen de detectie van het sperma stekker mogelijk niet waarneembaar. Op dit moment.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen onthullingen worden gedaan.
Dankbetuigingen
Dit onderzoek werd ondersteund door Award Aantal R21AA017735 (YS) van de National Institutes on Alcohol misbruik en alcoholisme. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteur en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van het National Institute on Alcohol Abuse en Alcoholisme of de National Institutes of Health. De auteur wil ook Charisse Montgomery bedanken voor het bewerken van dit manuscript.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Superfrost Plus Slides | VWR | 48311-703 | |
| PAP PEN | Research Products Int. Corp. | 195506 | |
| 5-Plend Open Mailer | Heathrow Scientific, LLC | HS 15983G | |
| Peel away embedding molds | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| In situ cell death detection kit, POD | Roche Diagnostics, Inc | 11684817910 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14170-120 | |
| Gelatin Type A | FisherScientific | G8-500 | |
| Stereomicroscope | W. NUHSBAUM, Inc | Leica M60, KL 200 LED | |
| Micro-Vibratome | Leica, Inc | Leica VT 1000S | |
| Moria Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | 2 paar |
| Graduate 30 ml feeding tubes | Dyets, Inc | 900012 | |
| Vitamin Mix | Bio-Serv. Inc. | F8031 | |
| Mineral Mix | Bio-Serv. Inc. | F8598 | |
| Maltose Dextrin | Bio-Serv. Inc. | 3650 | |
| Ethyl alcohol 190 Proof, 5 gallons | 111000190-SS05 | Pharmco-AAPER | |
| Upright microscope | W. NUHSBAUM, Inc | LEICA DM 4000 |
Referenties
- Sari, Y. Activity-dependent neuroprotective protein-derived peptide, NAP, preventing alcohol-induced apoptosis in fetal brain of C57BL/6 mouse. Neuroscience. 158 (4), 1426-1435 (2009).
- Sari, Y., Chiba, T., Yamada, M., Rebec, G. V., Aiso, S.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
