Summary
Nous avons développé une méthode simple, fiable et relativement peu coûteux pour l'intubation endotrachéale chez des souris par laryngoscopie directe en utilisant un otoscope avec un 2.0 mm spéculum. Cette technique est atraumatique et peut être utilisé pour des mesures répétées dans des expériences chroniques. Nous trouvons supérieure de trachéotomie ou précédemment rapporté des techniques non chirurgicales.
Abstract
Souris, à la fois de type sauvage et transgénique, sont le principal modèle mammifère dans la recherche biomédicale pour le moment. Intubation et la ventilation mécanique sont nécessaires pour des expériences animales entières qui nécessitent une intervention chirurgicale sous anesthésie profonde ou des mesures de la fonction pulmonaire. Trachéotomie a été la norme pour l'intubation des voies aériennes chez ces souris pour permettre une ventilation mécanique. Intubation oro-trachéale a été rapportée mais n'a pas été utilisé avec succès dans de nombreuses études en raison de la difficulté technique importante ou une exigence pour l'équipement hautement spécialisé et coûteux. Nous rapportons ici une technique de laryngoscopie directe en utilisant un otoscope équipé d'un 2.0 mm spéculum et l'aide d'un cathéter intraveineux 20 G comme une sonde endotrachéale. Nous avons utilisé cette technique largement et de manière fiable à intuber et procéder à des évaluations précises de la fonction pulmonaire chez la souris. Cette technique s'est avérée sûre, avec pratiquement aucune perte de animal dans des mains expérimentées. De plus, cette techniquepeut être utilisé pour des études répétées de souris dans des modèles chroniques.
Introduction
La souris de laboratoire a supplanté presque toutes les espèces comme le principal modèle mammifère de la biologie et pathobiology. La souris de laboratoire est la plus petite espèce de mammifère qui a été clairement et largement montré pour être de valeur comme un modèle de la maladie humaine et s'est avérée inestimable pour les progrès de notre compréhension de la biologie humaine et la maladie. Le temps de gestation courte et le coût nettement plus faible a permis le développement et l'étude de souris transgéniques nulles et comme un outil banal dans la recherche biomédicale. Toutefois, la taille de la souris de laboratoire moyenne (20-25 g) a limité leur étude dans des études à base physiologique ou chirurgicalement et, par conséquent, certains chercheurs étudient les espèces de mammifères plus grands. Un obstacle à l'utilisation de la souris dans ces études est la difficulté rencontrée avec les techniques d'intubation qui permettraient des mesures physiologiques ou des interventions chirurgicales importantes sous anesthésie profonde. Trachéotomie 1 a été utilisé comme une norme technique la place de l'intubation en raison de la plus grande facilité d'exécution de cette technique et modeste compétence requis. Cependant, la trachéotomie n'est pas propice à des études chroniques ou de récupération chirurgie; ainsi, il est limité à des expériences aiguës. Trachéotomie peut aussi être un facteur de confusion dans la recherche dans laquelle l'inflammation ou réflexes physiologiques sensibles sont importants.
Notre laboratoire a essayé la plupart des techniques décrites par d'autres chercheurs et les a trouvés insuffisants pour une variété de raisons. Trachéotomie est trop traumatisant et induit des saignements et l'inflammation des voies respiratoires. Beaucoup plus problématique est qu'il peut ne pas être faisable répété. Beaucoup de techniques non invasives relativement exigeant un investissement modeste dans les équipements ne sont pas suffisamment fiables. D'autres techniques nécessitent des équipements coûteux qui est difficile à justifier sans savoir si l'équipement fonctionne dans une application spécifique. Ainsi, nous avons cherché à développer une technique non traumatique nécessitant pas plus than un investissement modeste dans l'équipement spécialisé, pourrait être réalisé rapidement et de manière fiable, pourrait être répétée dans les modèles chroniques, et pourrait être utilisé dans un grand nombre d'animaux. Nous rapportons ici une telle technique.
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Protocol
Une. Préparation des animaux
- Obtenir des souris qui sont plus âgés de 8 semaines et plus de 20 g (souris plus petites peuvent être intubés par un expert).
- Anesthésie
- Injecter les souris avec 20 mg / kg, chacune, de la kétamine et de la xylazine par voie intrapéritonéale comme un pré-anesthésique. (Cette dose est insuffisante pour anesthésier complètement la souris, mais facilite le transfert, après l'intubation, ventilation mécanique). Cependant, un ajustement de la posologie peut être nécessaire en fonction de la réponse anesthésique en consultation avec le vétérinaire institutionnel.)
- Induire une anesthésie chez les souris avec 3,5% d'isoflurane / oxygène dans une chambre d'induction de 90 à 120 sec.
- Observez attentivement la fréquence respiratoire. Il devrait ralentir progressivement à pas moins de 45 bpm.
2. Préparation pour intubation
- Débranchez la souris de la chambre d'induction et nuque bien.
- Utilisez une pince fine coussins à gentment étendre la langue de la bouche.
- Maintenir l'extension de la langue en maintenant la langue entre deux doigts et appliquer une force douce.
- Tirez la souris sur le spéculum de l'otoscope avec un mouvement vertical.
- Regardez à travers l'oculaire de l'otoscope tout gommante étroitement et tirez la souris doucement par la langue et la nuque.
- Regardez attentivement pour les cordes vocales. Ils doivent être facilement accessibles à l'heure actuelle. Le aditus de laryngis (la structure de l'ouverture du larynx) devrait paraître relativement blanc. Il devrait y avoir mouvement des cordes à chaque respiration. Si les cordons ne se déplacent pas ou sont mal visualisés, tourner l'animal légèrement et doucement le cou en hyperextension.
- Avec la main dominante, tenez le 20 G, 1 dans le cathéter, d'une longueur de 1 cm de la tubulure PE10 s'étendant à travers l'extrémité du cathéter, comme un crayon et insérez-le dans le côté du spéculum. Le tube PE sert un stylet ou bougie.
- Diriger le tubi de PE10ng (stylet) à travers les cordes vocales et de faire avancer le cathéter 20 G (tube endotrachéale) sur le tube PE jusqu'à ce que le moyeu est au niveau de l'incisive inférieure. Retirer rapidement ce stylet.
- Prendre doucement l'animal hors du spéculum et vérifier l'emplacement du tube en plaçant l'animal sur un ventilateur mécanique continue de 2% d'isoflurane pour maintenir l'anesthésie générale tout au long de l'expérience. Visualisez l'air expiré (bulles) en passant par un piège PEEP pour confirmer l'intubation. Bien que l'intubation oesophagienne peut entraîner quelques bulles, il ne sera pas aussi prononcé ou compatible avec intubation endotrachéale. En outre, observer un tracé de pression des voies aériennes pour les déviations négatives (figure 1). Ceux-ci confirment le positionnement correct du tube. Sinon, placez une petite quantité d'eau dans la tubulure IV et le connecter à la sonde endotrachéale. Vérification de mouvement vers et à partir de la souris avec la respiration 2. Dans le cas d'intubation oesophagienne, la pression traçage va révéler des pressions beaucoup plus élevées et aucun déviations négatives. Bien-expiratoire de CO 2 serait utile, techniquement ce serait très difficile compte tenu des faibles volumes courants (~ 200 pi) et l'équipement pour le faire serait très coûteux. Les techniques simples décrites sont tout à fait suffisante et beaucoup moins cher. Si l'isoflurane n'est pas disponible, toutes les procédures peuvent être menées à l'aide de la kétamine 80-120 mg / kg en association avec la xylazine 10-20 mg / kg pour l'anesthésie générale.
3. Alternative Technique: Direct Laryngoscopie avec la technique otoscope est facilement utilisés à d'autres fins, principalement pour instillation directe de substances d'étude dans le poumon.
- Induire une anesthésie chez les animaux avec de l'isoflurane seul pour cette procédure à 3,5% pour 90 à 120 secondes dans la chambre d'induction.
- Scruff l'animal étroitement à la base du crâne et étendre délicatement la langueavec des pinces fines.
- Tenant doucement la langue, tirez-le vers le haut sur le spéculum (non modifié) jusqu'à ce que l'animal ne peut pas être tiré vers le haut encore.
- Les cordes vocales peuvent être visualisées le plus souvent par cette seule technique, mais tournent l'animal et l'hyper-extension du cou pour les mettre en pleine vue.
- Avancer d'une pipette gel chargement contenant l'instillation de la glotte et instiller le liquide. Parce que le spéculum forme une jonction avec l'hypopharynx la souris aspirer tout liquide résiduel qui ne passe pas à travers les cordes. Ceci est facilement contrôlée par le rhonchorous sons de la souris fait maintenant quand la respiration jusqu'à ce que le fluide est distribué entièrement dans les poumons.
- En variante, un tube PE10 connecter à une seringue de 0,5 ml contenant 50 ul de fluide avec un bol d'air derrière le liquide. Avancer le tube PE attentivement les cordes vocales pour 0,5 cm et décharger le contenu dans les voies respiratoires lentement. Cependant, traumatisme occasionnel voies respiratoires inférieures u se produitchanter cette technique sans une meilleure prestation de l'échantillon.
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Representative Results
Intubation avec la technique ci-dessus est fiable et rapide. Le placement approprié de la sonde endotrachéale est plus facilement vérifiée en observant expiré bulles de gaz provenant de la branche expiratoire immergée du du circuit de ventilation (habituellement dans un piège de la PEEP) et déviations négatives sur une pression des voies aériennes traçage (Figure 1). Les déviations négatives sur les voies respiratoires pression traçage sont les plus fiables. D'autres ont utilisé le mouvement d'une petite gouttelette de liquide dans un tube intraveineux relié au circuit expiratoire du ventilateur 2. Bien que nous n'avons pas utilisé cette technique largement, il devrait être suffisant pour vérifier l'emplacement du tube. Un opérateur expérimenté peut intuber souris en utilisant cette méthode environ 90% du temps sur la première passe. Pour ceux qui ne parviennent pas, le tube est immédiatement retiré, l'animal est reinduced avec l'isoflurane, et la mise en place de nouveau tenté. Si l'animal est laissé reliée au circuit de ventilateur dans le cas d'un esointubation œsophagienne, l'estomac va progressivement génère insuffler hautes pressions pic des voies respiratoires, une hypoxémie, et finalement la mort si il n'ya pas d'intervention. Si les pressions de crête élevée des voies respiratoires sont observés sans efforts inspiratoires négatives, l'animal doit être enlevé rapidement du ventilateur et extubé. Toutefois, la suppression de l'animal à partir du ventilateur et le retrait du tube endotrachéal facilement inverser cette. Au cours des 300 dernières études sur les animaux nécessitant une intubation un opérateur expérimenté intubé 80% à la première tentative et plus de 95% par la deuxième tentative. Tous les animaux ont été intubés par la troisième tentative des opérateurs expérimentés. Le temps nécessaire pour intuber des souris est de 5 min pour le pré-anesthésique, de 90 à 120 secondes pour induire la souris avec de l'isoflurane et 30 s pour identifier et fait intuber les voies aériennes. Nous avons trouvé que les nouveaux stagiaires doivent apprendre à visualiser les cordes vocales en premier. Si ils peuvent réussir à démontrer une vue complète des cordes vocales dix fois, ils sont prêts to commencer la formation à intuber. Une fois les stagiaires ont intubé avec succès 10 fois, comme l'a démontré par des déviations négatives sur une pression des voies aériennes traçage dans un animal respirant spontanément, ils sont prêts à réaliser des études sur des animaux expérimentaux. Cependant, une vidéo de formation va grandement accélérer la courbe d'apprentissage. Seuls les opérateurs inexpérimentés induisent des voies respiratoires traumatisme par cette technique et les décès d'animaux peuvent se produire dans ce cadre tout en apprenant la technique. Toutefois, la perte des animaux avec un opérateur expérimenté est rare. C'est notre expérience dans plus de 1000 animaux au cours des 4 dernières années.
A 20 G cathéter est utilisé comme une sonde endotrachéale chez la souris, car elle fait un joint étanche avec les voies respiratoires, ce qui permet des mesures précises de la pression des voies aériennes et il est d'un diamètre suffisant pour les mesures de résistance des voies aériennes. Cependant, en utilisant le tuyau de PE comme un stylet ou la bougie 20 permet de passer facilement à G et de manière plus fiable à travers les cordes vocales. L'une en(2,5 cm) la longueur du cathéter permet au tube d'être placé avec le moyeu au niveau des incisives inférieures en matière de stabilité, mais sans provoquer de traumatisme pour les voies respiratoires inférieures ou d'intubation du bras principal de bronches.
Nous utilisons cette technique pour faire des mesures de résistance des voies aériennes, effectuer courbes dose-réponse méthacholine (figure 2), et pour mesurer les relations pression-volume dans le poumon (figure 3). Pour l'ensemble de ces mesures, les animaux doivent être entièrement paralysés à obtenir des données précises et exploitables. Pour ce faire, nous avons utilisé le bromure de pancuronium comme un paralytique peu coûteux non dépolarisants dans des expériences non-recouvrement. Toutefois, le pancuronium n'est plus disponible et ne peut pas être utilisé sur les animaux qui vont récupérer en raison de sa longue demi-vie. Par conséquent, nous avons opté pour le vécuronium (30 min) ou de la paralysie rocuronium en raison de leur demi-vie plus courte, offrant la possibilité de mesures répétées au cours du temps. D'autres chercheurs ont utilisésuccinylcholine comme un paralytique dépolarisants, mais sa demi-vie a été trop courte pour la majorité de nos expériences. Il peut également provoquer la libération d'histamine succinylcholine 3 et serait donc un facteur de confusion potentiel.
Nous avons également utilisé la technique de laryngoscopie directe intensivement pour la livraison des substances d'essai dans le poumon basée sur une technique rapporté initialement chez le rat par Hastings 4. La plupart des enquêtes ont utilisé instillation nasale pour la livraison de substances d'essai pour les voies respiratoires inférieures parce que les souris respirent nécessairement par le nez et par instillation nasale est facile. Cependant, nous avons trouvé le procédé d'instillation nasale pour ne pas être fiable pour la livraison quantitative. En utilisant la technique de laryngoscopie directe, nous avons trouvé que la livraison quantitative est plus fiable et la distribution dans le poumon est plus uniforme. Notre principale utilisation de la technique d'instillation directe a été de livrer antigène de l'appareil respiratoire inférieur ina modèle de l'inflammation allergique (figure 4) et une hyper-réactivité des voies aériennes (Figure 2). Nous avons également livré autres substances d'essai tels que des cytokines et des médicaments par l'intermédiaire de ce procédé.
Figure 1. Airway pression traçage. La ligne bleue reflète la pression des voies aériennes et la ligne rouge reflète le volume de marée de trace dans la souris immédiatement après l'intubation. Les négatifs déviations (baisse) de la courbe de pression (flèches noires) indiquent la génération de pression négative intrathoracique chez la souris (C57BL / 6, 24 g) par l'effort respiratoire spontanée et indique le positionnement correct de la sonde endotrachéale. S'il vous plaît cliquer ici pour v IEW une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Résistance des voies aériennes et de courbes dose-réponse à la méthacholine. Souris (C57BL / 6), intubés par cette technique peut subir des mesures de résistance des voies aériennes et la réactivité bronchique en utilisant des doses de doublement de méthacholine envoyé par nébuliseur ultrasonique. Dans cet exemple représentatif, un animal de contrôle a une réponse minimale à la méthacholine jusqu'à 25 mg / ml et l'ovalbumine immunisé et contesté la souris montre hyperréactivité à la métacholine. Ces mesures sont effectuées avec des souris intubés avec un cathéter 20 G et sont indiscernables de ceux réalisés dans une souris trachéotomisés.
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Figure 3. Pression-volume courbe. C'est une courbe pression-volume représentatif de 20 g souris qui a été intubé avec un cathéter intraveineux 20 G, paralysé par le pancuronium, et est ventilé mécaniquement. Il démontre que le cathéter ne fuit pas jusqu'à 30 cm H de pression 2 O et peut donc être utilisé pour effectuer des mesures précises des relations pression-volume chez la souris.
Figure 4. modèle de l'ovalbumine de l'inflammation allergique. C'est un hématoxyline éosine et représentant la section teinté de poumon de souris qui a été immunisé et contestée avec de l'ovalbumine. Il démontre l'effet généralisé de l'instillation de ovalbumin administré par la méthode de la laryngoscopie directe (grossissement 4X).
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Discussion
Dans ce rapport, nous décrivons une technique simple et fiable pour intuber les souris qui est non traumatique et peuvent être utilisés à plusieurs reprises dans le même animal. Cette technique peut être réalisée avec une simple laboratoire ou équipements médicaux qui peuvent être achetés pour une somme modique. La technique de laryngoscopie directe, à l'origine par Hastings et collaborateurs 4, peut également être utilisé pour une variété de buts, mais principalement pour délivrer avec précision les substances d'essai pour les voies respiratoires inférieures. Nous avons trouvé cette technique supérieur à ceux rapportés par d'autres chercheurs à ce jour en raison de sa facilité, la rapidité, la simplicité, la fiabilité, peu de frais, et le potentiel de mesures répétées.
Techniques pour intubation souris ne sont pas nouvelles. Un des premiers rapports, transillumination utilisé de la trachée suivie par intubation orale avec un cathéter 24 G 5. Cependant, cette étude et d'autres 6,7 n'ont pas fourni suffisamment d'informations pour reproduire le technique dans notre laboratoire. Récemment, d'autres chercheurs ont utilisé cette technique de radiographie avec plus de succès 8,9. La première étude détaillée par Brown et ses collègues a rapporté une étude dans laquelle des souris, suspendu sur un panneau de 45 °, avaient leurs trachées transilluminé et leur trachée intubés par voie orale avec PE90 tubes sous visualisation directe à l'aide d'une lame de laryngoscope fabriqué 10. Cette technique s'est révélée difficile à reproduire et, par conséquent, n'a pas été largement utilisée. D'autres rapports décrivent l'utilisation de télescopes ou des fibres optiques optiques rigides pour améliorer la fiabilité des techniques. Vergari et ses collègues ont utilisé un rigide 11,12 arthroscope de 1,7 mm de diamètre extérieur pour visualiser les cordes vocales et ensuite placés un fil de guidage à travers la glotte. Les auteurs rapportent le succès avec cette technique qu'ils effectués avec un équipement spécialisé et coûteux à 100%. Le coût de ce matériel chirurgical semble prohibitif pour une utilisation généralisée chez les souris. D'autres techniques ont été développées en utilisant un microscope opératoire et un fil de guidage de 13 2f. Cette technique est similaire à la nôtre, mais nécessite l'utilisation d'un microscope opératoire, et donc on favorise l'utilisation d'un otoscope qui est sensiblement moins coûteuse.
Techniques d'intubation à fibres optiques ont également été rapportés en utilisant une batterie relativement peu coûteux alimenté source de fibres optiques 14. Nous avons tenté d'utiliser cette technique à fibre optique, mais nous avons trouvé la lumière moins utile, car il n'ya pas de canal de visualisation fibre optique correspondant. MacDonald et ses collègues ont utilisé une source de lumière halogène plus puissant et rapporté succès dans un petit échantillon. Ils ont pu mesurer à plusieurs reprises la résistance des voies aériennes 15 également. Mesures répétées de la résistance des voies aériennes à différents points dans le temps a été rapportée par d'autres 16. Zhao et al. Utilisé une technique rétrograde par la perforation de la trachée et de l'alimentation d'un fil de guidage à travers l'hypo-17 et de l'oropharynx. Plus récemment Singer, et al. Ont effectué une intubation sélective de la bronche souche gauche chez la souris en utilisant un microscope opératoire et la fluoroscopie pour documenter l'emplacement du cathéter 18. Ils ont ensuite utilisé cette méthode pour inculquer substances d'essai sélectivement dans les poumons. Cependant, ce nouveau ne serait pas une méthode qui pourrait être utilisée sans dépense importante et une formation très technique. En outre, la fluoroscopie également ajouter un risque d'irradiation pour l'étude.
En résumé, la laryngoscopie directe de souris en utilisant un otoscope pédiatrique est une technique précieuse pour l'intubation, l'intubation répétée et la livraison de la substance d'essai sans intubation. On retrouve cette technique supérieure de trachéotomie et méthodes d'exécution de manière non invasive l'intubation endotrachéale chez des souris précédemment rapporté.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Une subvention de mérite du ministère des Anciens combattants et une subvention T32-HL098062 du NHLBI des Instituts nationaux de la santé pris en charge ce travail. Nous tenons à remercier sincèrement les conseils de Randolph H. Hasting, MD, Ph.D. et les conseils et le soutien de l'Unité des médecins vétérinaires du Système de Santé de VA San Diego.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Operating Otoscope Head | Welch Allyn | 21700 | $188.98 |
| Otoscope Handle | Welch Allyn | 71000 | $112.20 |
| Reuseable Speculum | Welch Allyn | 22002 | $3.98 |
| Fine Forceps | Miltex | 18-779 | $107.18 |
| Small clamp stand to hold otoscope | |||
| Isoflurane Vaporizer (multiple circuit with vacuum waste gas handling) | Summit Medical | $3,000 | |
| Flexivent (Animal Ventilator) | SCIREQ | $35,000 | |
| Intravenous catheter (20 G, 1 in) | BD | 381233 | $9.62 |
| Polyethylene tubing (PE10) (0.011 in I.D., 0.024 in O.D.) 100 ft | Intramedic, Clay-Adams | 427401 | $115.70 |
| Ketamine 100 mg/ml (10 ml bottle) | Butler | 23061 | $10.00 |
| Xylazine (100 ml bottle) | Vedco | 24105 | $20.00 |
| Isoflurane (250 ml bottle) | $15.00 | ||
| Vecuronium bromide 10 mg/10 ml | Pfizer | NDC 0069-0094-01 | $15.00 |
References
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