Summary
الثقافات شريحة تسهيل التلاعب تطور الجنين بواسطة الجينات والاضطرابات الدوائية. ومع ذلك، يجب التأكد من أن ظروف ثقافة التطور الطبيعي يمكن المضي قدما في خفض البيئة من شريحة. نحن توضيح البروتوكول الذي يسهل التطور الطبيعي الحبل الشوكي على المضي قدما لمدة لا تقل عن 24 ساعة.
Abstract
يمكن الثقافات شريحة تسهيل التلاعب تطور الجنين على حد سواء من خلال التلاعب عقاقيري والجينات. في هذا النظام انخفاض، يمكن التغلب على الآثار الجانبية المحتملة القاتلة بسبب المخدرات التطبيقات النظامية. ومع ذلك، يجب التأكد من أن الظروف الثقافة عائدات التطور الطبيعي ضمن بيئة مصغرة من شريحة. فقد ركزنا على تطوير الحبل الشوكي، وبخاصة أن الخلايا العصبية الحركية في العمود الفقري. نحن تباينت الظروف بصورة منهجية ثقافة شرائح الدجاج الجنين من النقطة التي ولدت معظم الخلايا العصبية الحركية في العمود الفقري. نحن يعاير عدد ونوع الخلايا العصبية الحركية التي نجت خلال الفترة الثقافة والموقف من تلك الخلايا العصبية الحركية مقارنة بما كان عليه في الجسم الحي. وجدنا أن هناك حاجة إلى نوع المصل وعوامل عصبية خلال الفترة الثقافة وكانت قادرة على الحفاظ على الخلايا العصبية الحركية على قيد الحياة لمدة لا تقل عن 24 ساعة والسماح تلك الخلايا العصبية الحركية للهجرة إلى المواقف المناسبة فيالحبل الشوكي. نقدم هذه الظروف الثقافة ومنهجية إعداد الثقافات شريحة الجنين باستخدام أجنة الدجاج ينتزع منه جزءا لا يتجزأ من الاغاروز وشرائح باستخدام vibratome.
Introduction
خلال تطور الجنين الطبيعي، يتم إنشاء العديد من أنواع مختلفة من الخلايا التي يجب أن تهاجر من نقطة انطلاقها إلى حيث ستعمل في نهاية المطاف في الكائن الحي ناضجة. داخل الحبل الشوكي النامي، وتقع الخلايا الاصلية في منطقة البطين في خط الوسط وتوليد أنواع فرعية عديدة من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية تالية للتفتل التي يجب أن تهاجر إلى الاندماج في دوائر الخلايا العصبية الوظيفية اللازمة لمعالجة الحسية الحركية والمخرجات 1. وقد الخلايا العصبية الحركية في العمود الفقري التي تتحكم في انقباض عضلات الأطراف درس على نطاق واسع وكما هو معروف الكثير من الجزيئات والآليات التي تدفع تشكيل الفئات الفرعية المختلفة. ومع ذلك، فمن المعروف أقل بكثير من الآليات التي تهاجر الخلايا العصبية الحركية، وتلقي المدخلات فصل متشابك.
ويكتسب هوية النوع الفرعي للسيارات خلال الخلايا العصبية التنمية بطريقة هرمية. ويمكن للسيارات فرعية تصنف الخلايا العصبية على نطاق واسع طn لأعمدة متميزة، والانقسامات التي تعرف تجمعات من محور عصبي التوقعات الخاصة بهم. أعمدة المحرك محاور عصبية المشروع إما إلى العضلات، أو أطرافهم المحوري الحشوية. الانقسامات السيارات تقسيم الطرف إسقاط الخلايا العصبية الحركية في العمود الجانبي للسيارات (LMC) في تلك العضلات البطنية لإسقاط أو الظهرية 2. الانقسامات داخل، ووصف مجموعات من الخلايا العصبية الحركية موتور برك مشروع لعضلات الفرد في الطرف 2 و 3. وتعرف الخلايا العصبية الحركية من قبل الأطراف الاصطناعية إسقاط التعبير عنها من عامل النسخ Foxp1 4، 5، في حين يتميز هوية الشعب من التعبير عن عوامل النسخ homeodomain جزيرة-1 (إسقاط بطنيا) أو LHX 1-(إسقاط ظهريا) 6. في الواقع، هناك حاجة LHX-1 التعبير عن التوقعات في ظهري المناسب من الخلايا العصبية الحركية 7. كل من هذه الأنواع الفرعية يشغلون مناصب متميزة داخل الحبل الشوكي؛ بطني الخلايا العصبية الحركية إسقاط تأتي للإقامة الإنسي إلى projecti ظهريانانوغرام الخلايا العصبية الحركية. يتم فصل هذه النتائج في LMC في LMCmedial ما يسمى (LMCm) والانقسامات LMClateral (LMCl). ويكتسب الشعب وتنظيم تجمع السيارات على مرحلتين 8. في المرحلة الأولى، يتم تحقيق العزل الشعب عن طريق الهجرة من الخلايا العصبية الحركية في صفة الإنسي إلى الوحشي الأزياء. يتم إنشاء خلايا LMCl بعد ذلك الخلايا LMCm وLMCl يهاجر من خلال LMCm لتحقيق تسوية موقفها النهائي. المرحلة الثانية تستغرق الخلايا العصبية الحركية داخل الانقسام ومجموعات منهم إلى برك الخلايا العصبية الحركية، ويفترض من خلال الفرز الظهري البطني من الخلايا العصبية الحركية. وقد ثبت أفراد الأسرة catenin التي تعتمد على كادهيرين الكلاسيكية تكتسي أهمية بالغة لكلتا المرحلتين من 8-10 موتور تنظيم الخلايا العصبية. ولكن، كيف يتحكم في حركة كادهيرين ظيفة الخلية ما زال يجهل الكثير.
الحصول على هويات عمودي، وتجمع الشعب يتطلب إشارات خارجي هذا النمط intrinsiج التعبير عن عوامل النسخ 11. بالإضافة إلى ذلك، حوالي 50٪ من جميع الخلايا العصبية الحركية عن طريق موت الخلايا المبرمج خلال يموت التطور الطبيعي في عملية تتطلب إشارات خارجي من أطرافه، إلى حد كبير من خلال تقديم الدعم للبقاء عصبية الخلايا العصبية الحركية. وهكذا، الخلايا العصبية الحركية التنمية يتطلب بيئة مناسبة ليتم الحفاظ على مدى timecourse طويلة نسبيا. لهذا السبب، فإن العملية لتوليد الشوكي الثقافات شريحة الحبل للحفاظ على بقاء الخلايا العصبية الحركية تتطلب الكشف عن ظروف التربية المناسبة. وقد استخدمت الثقافات السابقة شريحة الجنين لمتابعة سلوك وأضاف السكان خارجيا تنقية الخلايا العصبية 12-14. ومع ذلك، لدينا ظروف ثقافة المعرفة التي تسهل البقاء على قيد الحياة في الموقع الخلايا العصبية الحركية والهجرة داخل شريحة نفسها لم تنشر. نحن تعديل شرط القياسية التي تسهل الثقافة بقاء تنقيته، فصل الخلايا العصبية الحركية الجمجمة لتسهيل مأذني الخلايا العصبية التنمية داخل ثقافة النظام الجنين شريحة. ونحن أيضا رصد المواقع من الخلايا العصبية الحركية على قيد الحياة وإثبات أن يكتسب المواقف العادية إلى حد كبير من الشعب الخلايا العصبية الحركية خلال الفترة الثقافة.
Protocol
1. جعل الحلول المطلوبة
- 1 العازلة الفوسفات M: زن من 109،4 ز نا 2 HPO 4 و 32 ز ناه 2 PO 4 H 2 0، ومزيج تذوب في الماء إلى الحجم الكلي لل1 لتر.
- التخزين المؤقت المالحة الفوسفات (PBS): إعداد العازلة الفوسفات 0،1 M، 0.15 M كلوريد الصوديوم. ينبغي 100 مل من برنامج تلفزيوني يكفي لتجهيز شرائح من 10 الأجنة.
- الاغاروز: الحرارة PBS حل لحوالي 70 ° C درجة الحرارة وإضافة الصلبة انصهار منخفضة في حين الاغاروز ببطء مع التحريك باستمرار. جعل حل لتركيز النهائي من 4٪ (W / V) الاغاروز. جعل مخزون من 50 مل من هذا الحل. ترك هذا الحل في الاحتفاظ بالحمام المائي في 48 ° C حتى المطلوبة. ويمكن تخزين أي حل غير المستخدمة الاغاروز بعد التجربة في C ° 4 لعدة أسابيع.
- الأجسام المضادة كتلة الحل: إضافة العجل الجنين المصل وتريتون X-100 إلى concentr النهائيأوجه من 1٪ (V / V) العجل الجنين مصل، 0.1٪ (V / V) تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني. و10 مل من محلول كتلة كافية للالمناعية من 5 شرائح من أقسام ناظم البرد.
- مثبت: تحضير هيدروكسيد الصوديوم 0.75 مم، بارافورمالدهيد 4٪ (W / V) (تنبيه). لإعداد كمية الحرارة اللازمة مثبت من المياه إلى 70 درجة مئوية، إضافة إلى تركيز هيدروكسيد الصوديوم المركزة النهائية المطلوبة، إضافة بارافورمالدهيد الصلبة وتخلط حتى يذوب. باردة على الجليد لC. ° 4 و10 مل من هذا الحل يكفي لمدة 20 بئرا من شرائح الجنين.
- الحل السكروز: إعداد 10 مل من محلول السكروز 30٪ (W / V) التي تحتوي على الفوسفات عازلة 0،1 M. و10 مل من هذا الحل يكفي لمدة 10 بئرا من شرائح الجنين.
- 70٪ (V / V) الإيثانول. تمييع 70 مل من الإيثانول المطلق مع 30 مل من الماء.
- ثقافة المتوسط: إعداد محلول 1٪ الدجاج استخراج الجنين، 1٪ البنسلين / الستربتوميسين، 0.35٪ الجلوتامين L-، 0.1٪ 2-mercaptoethأنول، 4٪ من مصل الدجاج، 2٪ B27 و 100 الملحق النمو ciliaryneurotrophic نانوغرام / مل عامل (CNTF) جميع مخففة في المتوسط neurobasal؛ أعد على الجليد وتستخدم في نفس اليوم. مطلوب 10 مل من مستنبت لل20 بئرا من شرائح الجنين.
2. فرخ الأجنة إعداد
- مكان الدجاج الملقحة البيض مع الجانب الأطول أفقيا في مشروع حاضنة القسري في 38 ° C حتى تطوير لمرحلة 15 24. هذا وعادة ما يتطلب حوالي 4 أيام من الحضانة.
- في اليوم الثاني من الحضانة، تعقيم قشرة البيضة بواسطة المسح مع المناديل الورقية غارقة في الايثانول 70٪. بيرس بعناية نهاية المسطح من قشرة البيضة باستخدام إبرة قياس 21 تعلق على حقنة 5 مل وإزالة 5 مل من الألبومين. هذا يقلل من الجنين بعيدا عن قذيفة حتى لا تضرر الجنين عند فتح قذيفة. العودة إلى البيض الحاضنة واحتضان لهم لمزيد أيام 2.
- باستخدام أضعفت دومون # 5 ملقط جبيرس arefully منتصف أعلى شل وإزالة حوالي 9 سم 2 من قذيفة. قطع حول الجنين ورفع بعناية الجنين ومكان في HBSS خلال تشريح. وينبغي الأجنة وفقا لنظم وهمبرغر هاميلتون (1992) 15. ينبغي لجميع الأجنة المستخدمة تكون على مقربة من المرحلة 24. يجب التخلص من أي الأجنة التي تظهر أي علامات على الشذوذ.
- إزالة الغشاء السلى، الغشاء السقائي المشيماء، رأس، والسقاء باستخدام اثنين من دومون # 5 ملقط. سلب الجنين لإزالة كافة الأعضاء الداخلية. للقيام بذلك، وقطع خط الوسط بطني فتح للجنين مع مقص تشريح الصغرى، وعقد الجنين في جميع أنحاء المنطقة منقاري الجذع مع زوج واحد من الملقط، والاستيلاء على جزء منقاري للامعاء والقلب وسحب نحو caudally. من المهم أن يتم ذلك بوضوح. يجب أن تكون قادرا على رؤية الجنين بشكل واضح somites. قطع الجنين إلى النصف، بشكل مستعرض بين buds.Now أطرافهم العليا والسفلى تقليم الجسم الصدريباستخدام مقص تسليخ مجهري الجدار.
3. الجنين شريحة إعداد
- إزالة الحل الاغاروز من حمام الماء. قطع 5 سم من الجزء السفلي من البلاستيك القابل للتصرف 3 مل ماصة باستور.
- إزالة بلطف النصف القطني للجنين باستخدام اثنين من تشريح ملقط الجنين لمهد للخروج من حل تشريح ومكان في صحن بيتري الجافة. باستخدام ماصة باستور، وإزالة حوالي 2 مل من الاغاروز، حوالي 0.5 مل ماصة على رأس الجنين ومن ثم تمتص شريحة الجنين في ماصة. نقل الجنين والاغاروز إلى قشر بعيدا قالب من البلاستيك الحرص على عدم إدخال أي فقاعات في الاغاروز. خفض بلطف الجنين إلى أسفل الاغاروز في قالب من البلاستيك مع قسم الصدر إلى أسفل. وينبغي وضع الجنين مباشرة إلى استخدام إبرة قياس 21. وسوف تحتوي أيضا على شرائح جزء من أطرافهم النامية وأنه من المهم أن توجه الجنين في أجارسوف OSE يسمح بذلك. وضع القارب على الجليد لضبط الاغاروز. الحرص على أن الجنين لا يغير التوجه خلال هذه الفترة (حوالي 2 دقيقة).
- يجب تعيين VT1000S ايكا vibratome (سرعة 3، 4 التردد، 400 ميكرون شرائح سميكة) مع غرفة تشريح مليئة HBSS وتحيط بها المياه الباردة الجليد. عالق ثم كتلة الاغاروز إلى منصة vibratome مع الغراء عظمى. يتم قطع كتلة الاغاروز مع شفرة حلاقة لمغادرة قطعة الجنين مع مم 1-3 من الاغاروز المحيطة به. يتم تحديد الشرائح التي تشمل أقسام برعم الطرف مع rigde الأدمة قمية واضحة وثم توضع الشرائح في هذه HBSS. عموما، هناك احدة فقط لمدة شرائح مناسبة في الجنين. إزالة بلطف الاغاروز حول شرائح الأنسجة باستخدام اثنين من الإبر. من الضروري أن يتم ذلك بشكل شامل ودقيق.
4. زراعة الأجنة شرائح
- إضافة 500 مل من محلول الثقافة (المذكورة أعلاه) إلى اشتراطاتإد عدد من الآبار من 24 بئر منخفضة جدا مرفق المعالجة الأنسجة لوحة الثقافة. نقل شرائح بعناية من الحل HBSS في البئر. بشكل عام، ونحن نحاول أن يكون 2-3 شرائح في كل بئر. وضع لوحة 24 أيضا في الأنسجة حاضنة الثقافة في C ° 37 مع 5٪ CO 2 ل24 ساعة.
5. باجتزاء لشرائح المناعية
- بعد فترة والثقافة، وإضافة 500 ميكرولتر من الإصلاح غير مصقول إلى كل بئر من شرائح الجنين وترك على الجليد لمدة 20 دقيقة. ثم تتم إزالة الحل الكلي بعناية ويتم القيام بثلاث يغسل PBS بها، مع 5 مين فترات. يتم ترك ثم الشرائح في حل السكروز في C ° 4، حتى الحوض شرائح، حوالي 6 ساعة ولكن يمكن أن تترك لفترة أطول (بين عشية وضحاها على سبيل المثال).
- إزالة شرائح وربت قبالة حل السكروز اضافية وتتوازن في جميع أنحاء أكتوبر 1 مل لحوالي 5 دقائق عند درجة حرارة 20 º تحميل كل شقة شريحة في قالب OCT-ملء قشر بعيدا من البلاستيك.بعد تصاعد مستمر، ووضع قوالب الثلج الجاف عموديا على لترسيخ.
- تحميل كتل في أكتوبر ناظم البرد ويوازن الكتل في C ° -24 لحوالي 20 دقيقة. قطع كل شريحة مع 15 مم الأقسام التي شنت على Superfrost زائد الشرائح. ويمكن تخزين الشرائح في -80 درجة مئوية حتى تكون هناك حاجة إليها.
6. المناعي
- ماصة 1-2 مل من برنامج تلفزيوني على الشرائح الأفقية التي عقدت في غرفة مرطب مع الشرائح التي أثيرت من الجزء السفلي من الغرفة (التي نستخدمها 1 أو 2 مل ماصات بلاستيكية ثابتة مع شريط الأوتوكلاف). احتضان المقاطع في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق عند 20 درجة مئوية لإزالة الزائدة أكتوبر إزالة الحل PBS من الشريحة وإضافة 500 مل من محلول كتلة على أقسام، احتضان لمدة 30 دقيقة عند 20 ° C. وأضاف إزالة كتلة الحل وإضافة على الفور 500 مل من الأجسام المضادة الأولية مخففة على الشرائح، احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 18-22 ساعة.
- إزالة الأجسام المضادة الأولية حل وكان على الفورح الشرائح مع 1 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق، ثلاث مرات في 20 ° C لإزالة الزائدة حل الأجسام المضادة الأولية. إضافة 500 مل من الأجسام المضادة الثانوية المخفف على أقسام. ثم تترك الشرائح في C ° 20 لمدة 30 دقيقة. ثم تتم إزالة الأجسام المضادة الثانوية الحل والشريحة تغسل 3 مرات في 5 دقائق PBS في C. ° 20
- بعد هذه يغسل، وإزالة النهائية PBS يغسل، الداب حافة الشريحة لإزالة الزائدة PBS، إضافة قطرتين من vectashield على الشرائح ووضع ساترة بلطف على الزجاج أقسام، وتجنب تكوين فقاعة. إزالة الزائد عن طريق النشاف Vectashield من على حافة الشرائح قبل التصوير.
7. التصوير
- الصورة المقاطع immunostained. نستخدم المجهر مضان نيكون الكسوف E80i مجهزة بكاميرا رقمية ORCA Hamammatsu ER و 10 X، 20X و 40 X العدسات الهدف.
Representative Results
وكان استخدام شرائح مثقف لمتابعة تطور الخلايا العصبية عصبون والإسقاط مؤثر في تقدم فهمنا لجيل من منظمة داخل القشرة 16. في النخاع الشوكي، وقد تم اتباع العصبون الحركي التنمية باستخدام الأجنة الزرد ثقافات كله 17. ومع ذلك، الخلايا العصبية الحركية في العمود الفقري في منظمة الزرد بسيط نسبيا (نظرا لعدم وجود عضلات الأطراف الكبيرة في الأسماك). وحاليا الآليات الجزيئية التي تدفع التسلسل الهرمي للتنظيم الخلايا العصبية الحركية في العمود الفقري خلال تطوير الفقاريات العليا غير مفهومة. ويلزم بالتالي الظروف التي تسهل بقاء الثقافة الخلايا العصبية والخلايا الهجرة الجسم في الثقافات شريحة الجنين من الفقاريات العليا. حاليا، وقد استخدمت الثقافات الشوكي الحبل شريحة من الفقاريات العليا لفصل الخلايا العصبية البذور على أعلى من شرائح 12-14، تحقيق محاور عصبية fluorescently المسمى في محيط شريحة18، أو من سلوك الخلية السلف في وقت مبكر التنمية الحبل الشوكي 19. شريحة الظروف لثقافة النخاع الشوكي في وقت لاحق، لا سيما تلك التي تحافظ على الخلايا العصبية الحركية التنمية تفتقر حاليا.
في محاولة لمتابعة تطوير الخلايا العصبية في العمود الفقري، وخصوصا ان الخلايا العصبية الحركية في العمود الفقري، ونحن التحقيق الظروف المختلفة التي قد الثقافة تعزيز بقاء الخلايا العصبية الحركية واكتساب أجل الأولية في المؤسسة الحركية من خلال الهجرة الجانبي للخلايا العصبية. أثبتت التجارب الأولية باستخدام مرحلة 18 إلى 20 مرحلة الجنين الفرخ شرائح الحبل الشوكي غير مثمرة، ونحن لم تكن قادرة على الحفاظ على الخلايا العصبية الحركية على قيد الحياة لفترة أطول من بضع ساعات، وعجزوا عن إثبات توليد أعداد كبيرة من الخلايا LMCl خلال الفترة الثقافة (البيانات لا تظهر). نحن التحقيق وبالتالي الثقافات شريحة من مرحلة الأجنة 24، وtimepoint عندما تم إنشاء معظم الخلايا العصبية وLMCl LMCm، ولكن عندما LMCl الخلايا العصبية لا تزال في الهجرة أنا لهاnfancy (الشكل 1A-C). هذه الهجرة من الخلايا العصبية الجانبية LMCl اكتمال المرحلة إلى حد كبير 27، 24 حتي 36 حول الموارد البشرية في وقت لاحق (الشكل 1 DF). وبالتالي يمكن أن تكون مبسطة مقايسة لدينا لتكون قادرة على الحفاظ على الخلايا العصبية على قيد الحياة، وتسهيل هجرتهم أفقيا في القرن البطني. بدأنا تجاربنا مع ظروف ثقافة بسيطة نسبيا تحتوي فقط هانك حل متوازن الملح مع أو بدون مصل الدجاج أو الدجاج استخراج الجنين. في جميع الحالات، على الرغم من أننا كنا قادرين على الحفاظ على الخلايا العصبية LMC في شريحة، وجدنا أدلة تذكر على أن الحفاظ على الخلايا العصبية LMCl (على الأقل من التعبير عن LHX-1). علاوة على ذلك، وجدنا التعبير غير لائق من الجينات مثل HB9 في النخاع الشوكي الظهري، وهي حالة لم تحدث في الجسم الحي (البيانات لا تظهر). وبالتالي، فإن هذه الظروف الثقافة بسيطة ليست مناسبة للتحقيق في الاستيلاء على تنظيم الخلايا العصبية الحركية.
وبالتالي سعينا من conditio أكثر تعقيداNS وكقاعدة استخدام صيغة الذي تم نشره لتسهيل بقاء الخلايا العصبية فصل الدجاج السيارات الجمجمة الجنينية. هذا الشرط 20 (1٪ مستخلص الجنين الفرخ، 1٪ بكتيريا القلم، 0.35٪ الجلوتامين L-، 0.1٪ 2-المركابتويثانول، 2٪ من مصل الحصان، الملحق 2٪ B27 و 50 ciliaryneurotrophic النمو نانوغرام / مل عامل (CNTF) في المتوسط neurobasal (هنا يسمى غوثري متوسطة) لم تبقي الخلايا العصبية الحركية على قيد الحياة أكثر من وسائل الإعلام أكثر بساطة. بالإضافة إلى ذلك، لم تسفر عن التعبير زائفة من عوامل النسخ في النخاع الشوكي الظهري، إلا أن بقاء الخلايا العصبية LMCl كان ضعيفا (الشكل 1 غي، ع)، ونحن بالتالي تفاوتت ما تعتبر عوامل رئيسية في غوثري المتوسطة، وهما من أصل حيواني من المصل، وتركيز المصل وتركيز CNTF في المتوسط. لقد وجدنا أن تغيير المصل من مصل الحصان لمصل الفرخ وزيادة في تركيز CNTF من 50 نانوغرام / مل إلى 100 نانوغرام / مل ر زيادة كبيرةانه البقاء للخلايا LMCl وLMCm ويسمح أيضا هجرتهم إلى القرن البطني على مدار 24 ساعة من الشروط الثقافة (الشكل 1 جى، ص). إجمالي عدد الخلايا العصبية الحركية، نسبة إلى LMCm LMCl، بل ويبدو أن هجرة الخلايا LMCl في القرن البطني مشابهة جدا لأجزاء من الأجنة التي كان قد سمح لتطوير في البيضة وليس في ثقافة شريحة (الشكل 1 كو ع). وبالتالي، فإننا نعتقد أن يعتمد على عدد النسخ التعبير عامل الخلية، وموقف الخلايا العصبية الحركية، وظروف ثقافتنا شريحة ألخص العادية الشوكي الخلايا العصبية الحركية التنمية على الأقل على مدى فترة على مدار 24 ساعة.
الشكل 1. أ - ج. مركز جيل من LMC (Foxp1 تلطيخ فيب) وLMCl (LHX-1 في تلطيخ) في المرحلة 24. ج هو دمج للقناتين. يظهر خط الوسط كخط منقط في وD، V يظهر اتجاه محور (D، V) ظهري بطني من الحبل الشوكي د - و. . حالة LMC (Foxp1 تلطيخ في د) وLMCl (LHX-1 في تلطيخ ه) تنظيم في مرحلة 27 واو هو دمج للقناتين ز - ط. LHX-1 (ز) وFoxp1 (ح) في التعبير أقسام شريحة مثقف في وسط الجمجمة التي تدعم بقاء الخلية العصبية المحركة (غوثري المتوسطة، لدينا "المتوسط الأولي" انظر المرجع 20). لم يعد أعرب LHX-1 في الخلايا العصبية الحركية، على الرغم من وجود بعض الخلايا بقاء LMC يتضح من Foxp1 التعبير. D، V في (ز) يدل على اتجاه محور (D، V) ظهري بطني من الحبل الشوكي. ML يبين اتجاه محور (M، L) الناصف الوحشي من لياليبينال ي الحبل - لتر. ويمكن ملاحظة الخلايا LMCl (LHX-1 في القرن البطني في ي) وLMC بشكل عام (في Foxp1 ك) في شرائح المستزرعة في المتوسط تحتوي على 4٪ فرخ المصل و 100 نانوغرام / مل CNTF. لاحظ أنه يتم العثور على بعض الخلايا LMCl في موقف الوحشي في القرن البطني. السهم في (ي) ويبين موقف الجانبية لبعض خلايا LMCl. (ل) هو دمج للقناتين م - س. حالة التعبير عن LHX-1 (م) وFoxp1 (ن) في أقسام الجنين في البيضة حافظ خلال ثقافة شريحة من الجنين هو مبين في ي - ل. (س) هو دمج للقناتين. ف. تحديد الكميات من نسبة LMCl (Foxp1 + هاء / Lhx1 + VE) مقابل الخلايا LMC (Foxp1 + هاء / هاء Lhx1) الخلايا الموجودة في الثقافات شريحة في ظروف مختلفة جompared للسيطرة على الأجنة يوضع في البيضة (التي تمثل 100٪). الطالب اختبار تي *** يمثل P <0.01. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
Discussion
بروتوكول الموصوفة هنا يسمح حضنت الأجنة شريحة الدجاج لأكثر من يوم واحد مع إبقاء الخلايا العصبية الحركية على قيد الحياة والاستمرار في ترحيل خلال الفترة الثقافة. في توضيح الظروف للحفاظ على الخلايا العصبية الحركية على قيد الحياة، لقد حددنا عدة الملامح الرئيسية المطلوبة. يبدو أن ما يصل إلى 4٪ فرخ المصل أمر بالغ الأهمية لبقاء الخلايا العصبية الحركية والاستعاضة عنها مصل من الأنواع المختلفة والتسامح لا. ومن المثير للاهتمام، وجدنا أن وجود تركيزات أعلى من المصل لها أثر ضار على شرائح كما روجت فرط نمو الأنسجة مما يؤدي إلى تشوهات جسيمة في شكل شريحة. والأهم من ذلك وجود عامل التغذية العصبية cilliary ثبت أيضا حرجة. يبقى احتمالا واضحا أن شرائح قد تكون قادرة على أن تكون مثقف لفترات أطول بكثير من مجرد 24 ساعة، وربما السماح حتى التصور للمدخلات الحسية وارد إلى الحبل الشوكي. بالإضافة إلى ذلك، طريق مسدودالشروط والأحكام قد تلح هنا يكون مفيدا أيضا لشريحة الثقافات من الدماغ النامية والمخ الأوسط / المخيخ.
ولعل أكبر فائدة محتملة في استخدام هذه الشروط ثقافة شريحة هي أنها تسهل إمكانية للتلاعب الدوائية للوظيفة البروتين في حين التقليل من احتمال حدوث آثار سلبية على بقية الجنين، مثل القلب. ويمكن استخدام عدد كبير من مثبطات ومنبهات مختلفة من مسارات إشارات لتقييم هجرة الخلايا العصبية في العمود الفقري مختلفة الأنواع الفرعية، وربما تأثيرها في تشكيل الدوائر المحلية الشوكي خلال التنمية. بالإضافة إلى ذلك، بعض الاضطرابات الوراثية التعبير البروتين، مثل تلك التي تستخدم siRNAs وأليغنوكليوتيد] morpholino، يعانون من حقيقة أنه لا يمكن أن تكون أدخلت في وقت مبكر من التنمية (بسبب القيود في الإجراءات الصعق الكهربائي في البيضة) وآثار الماضي فقط ل فترة قصيرة من تيمه (عادة يوم واحد). بدء ثقافتنا شريحة في مراحل لاحقة ويتيح إمكانية استخدام هذه التكنولوجيا في وقت لاحق في التنمية في مرحلة تشريح لعرض آثارها خلال الفترة من ثقافة شريحة.
يمكن للبروتوكول ثقافة شريحة تسمح أيضا تصور كل من الخلايا العصبية الحركية في العمود الفقري الظهري وكذلك الهجرة عصبون في الوقت الحقيقي عن طريق الفحص المجهري الفيديو في الوقت الفاصل بين. ويمكن تحقيق ذلك باستخدام المجهر النقيض من المرحلة تحت الضوء الأبيض أو من خلال استخدام التصوير مضان. إذا كان الأسلوب الأخير كان من المقرر أن تستخدم بعد ذلك هناك حاجة إلى إدخال علامات الفلورسنت. ويمكن تحقيق ذلك إما عن طريق إدخال الأصباغ الفلورية مثل مبادرة ديزرتك الصناعية أو إما عن طريق وضع العلامات ديو الوراء من الطرف أو وضع العلامات تقدمي من البطين أو الصعق الكهربائي في البيضة من يبني البروتينات الفلورية لدفع في مجموعة فرعية من الخلايا العصبية.
Disclosures
أي من الكتاب وتتنافس المصالح أو تضارب المصالح.
Acknowledgments
نود أن نشكر شارون المفخرة للمناقشات كثيرة وبصيرة Novitch B. هدية لنوع من الأجسام المضادة لFoxp1. هذا العمل الممول من منحة دراسية لمن ويلكوم ترست لKCT ومنحة المشروع من ويلكوم ترست لSRP (المنح إشارة 094399/B/10/Z رقم).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eggs | Henry Stewart Farms, UK | Fertilised Brown Bovan Gold Hen's eggs (Henry Stewart Farms, UK), stored at 14 °C until incubation | |
| 21 Gauge needle | BD-Microlance-3 | 304432 | |
| 5 ml syringe | BD Plastipak | 302187 | |
| #5 Dumont forceps | Roboz | RS 5045 | |
| Micro Dissecting scissors | Roboz | RS 5910SC | (3.5 in straight) |
| Embryo embedding moulds: Peel away moulds | Agar Scientific | G3764 | Pyramidal shaped 22 mm to 12 mm |
| Super glue | Power Flex, Loctite | ||
| Ethanol | SIGMA | 32221 | |
| Sodium di-hydrogen Phosphate, mono-hydrate | BDH | 102454R | |
| Di Sodium mono-hydrogen Phosphate | VWR/ BDH | 102494C | |
| Sodium Chloride | VWR/BDH | 27810.295 | |
| Low melting temperature agarose | Invitrogen | 16520 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 10500-064 | |
| Triton X-100 | SIGMA | T8787 | |
| Sodium Hydroxide | FLUKA | 71689 | |
| Paraformaldehyde | VWR/BDH | 28794.295 | |
| Plastic disposable pasteur pipettes | ElKay Precision laboratory consumables | 127-P503-000 | Liquipette 3 ml volume |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14170 | |
| Sucrose | SIGMA | S0389 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate | SIGMA | S5761 | |
| Chicken Embryo Extract | Seralabs | CE650-J | |
| Penicillin/ Streptomycin solution | Gibco | 15070 | |
| L-Glutamine solution | Gibco | 25030 | |
| 2-mercapt–thanol | Gibco | 21985 | |
| Horse serum | Southern Group Labs | 9028B | |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Neurobasal medium | Gibco | Cat ~ 2103 | |
| CilliaryNeurotrophic factor (CNTF) | R and D Systems | 557-NT-010 | |
| Chick Serum | SIGMA | C5405 | |
| Primary antibodies | were purchased from Developmental Studies Hybridoma Bank, with the exception of anti-foxP1 antibodies, which were a kind gift from Bennett Novitch of UCLA. Primary antibodies dilutions were Rabbit anti-FoxP1 (1/32000), Mouse anti-Lhx1/2 (4F2) (1/50), Guinea Pig anti-FoxP1 (1/1000). All antibodies were stored at 4 °C. |
||
| Secondary antibodies | Donkey anti-Guinea Pig (cy3) (1:1000) purchased from Jackson Immunoreseach Laboratories Inc. Donkey anti-Mouse (Alexa Fluor 488) (1:1000), Donkey anti-Rabbit (Alexa Fluor 594) (1:1000) purchased from Invitrogen All antibodies were stored at 4 °C. |
||
| 24-well plate | Corning COSTAR | 3473 | ultralow attachment 24-well plate |
| O.C.T. | Tissue Tek, Sakura | 4583 | Optimum Cutting Temperature |
| Vectashield | Vector Labs | H1000 | Vectashield fluorescent mounting medium |
| Slides | Thermo Scientific | Superfrost-Plus positively-charged slides, 25 x 75 x 1.0 mm | |
| Cover Glass | VWR International | 631-0167 | 25x60 mm |
| Forced draft incubator: | Lyon Electric Company | kept humid by ensuring water levels always sufficient, maintained at 38 °C | |
| Cryostat | Brite, Huntingdon, UK | -36 °C | |
| Tissue Culture Incubator | DH Autoflow | Nuaire 38 °C, 5% CO2 | |
| Vibratome | Leica | Leica VT1000-S | |
| Microscope | Nikon | Nikon Eclipse E80i fluorescence microscope | |
| Digital Camera | Nikon | Nikon DS5M and Hamammatsu ORCA ER |
References
- Jessell, T. M. Neuronal specification in the spinal cord: Inductive signals and transcriptional codes. Nature Reviews Genetics. 1 (1), 20-29 (2000).
- Landmesser, L. Distribution Of Motoneurons Supplying Chick Hind Limb Muscles. Journal of Physiology-London. 284, 371-389 (1978).
- Romanes, G. J. The motor pools of the spinal cord. Progress in Brain Research. 11, 93-119 (1964).
- Dasen, J. S., De Camilli, A., Wang, B., Tucker, P. W., Jessell, T. M. Hox repertoires for motor neuron diversity and connectivity gated by a single accessory factor, FoxP1. Cell. 134 (2), 304-316 (2008).
- Rousso, D. L., Gaber, Z. B., Wellik, D., Morrisey, E. E., Novitch, B. G. Coordinated actions of the forkhead protein Foxp1 and Hox proteins in the columnar organization of spinal motor neurons. Neuron. 59 (2), 226-240 (2008).
- Tsuchida, T., Ensini, M., et al. Topographic organization of embryonic motor-neurons defined by expression of limhomeobox genes. Cell. 79 (6), 957-970 (1994).
- Kania, A., Johnson, R. L., Jessell, T. M. Coordinate roles for LIM homeobox genes in directing the dorsoventral trajectory of motor axons in the vertebrate limb. Cell. 102 (2), 161-173 (2000).
- Price, S. R., Garcia, N. V. D., Ranscht, B., Jessell, T. M. Regulation of motor neuron pool sorting by differential expression of type II cadherins. Cell. 109 (2), 205-216 (2002).
- Demireva, E. Y., Shapiro, L. S., Jessell, T. M., Zampieri, N. Motor Neuron Position and Topographic Order Imposed by β- and γ-Catenin Activities. Cell. 147 (3), 641-652 (2011).
- Bello, S. M., Millo, H., Rajebhosale, M., Price, S. R. Catenin-Dependent Cadherin Function Drives Divisional Segregation of Spinal Motor Neurons. Journal of Neuroscience. 32 (2), 490-505 (2012).
- Haase, G., Dessaud, E., et al. GDNF acts through PEA3 to regulate cell body positioning and muscle innervation of specific motor neuron pools. Neuron. 35 (5), 893-905 (2002).
- Hotary, K. B., Landmesser, L. T., Tosney, K. W. Embryo slices. Methods in Cell Biology. 51 (51), 109-124 (1996).
- Hotary, K. B., Tosney, K. W. Cellular interactions that guide sensory and motor neurites identified in an embryo slice preparation. Developmental Biology. 176 (1), 22-35 (1996).
- Krull, C. E., Tosney, K. Embryo slices and strips: Guidance and adhesion assays in the avian embryo. Methods in Cell Biology: New Methods in Avian Embryology. Bronner-Fraser, M. 87, 2nd Edition, Elsevier Academic Press Inc. San Diego. 97-113 (2008).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. (Reprinted From Journal Of Morphology, Vol. 88, 1951). Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
- Rakic, P. A century of progress in corticoneurogenesis: From silver impregnation to genetic engineering. Cerebral Cortex. 16, I3-I17 (2006).
- Bingham, S. M., Sittaramane, V., Mapp, O., Patil, S., Prince, V. E., Chandrasekhar, A. Multiple mechanisms mediate motor neuron migration in the zebrafish hindbrain. Dev. Neurobiol. 70 (2), 87-99 (2010).
- Brachmann, I., Jakubick, V. C., Shaked, M., Unsicker, K., Tucker, K. L. A simple slice culture system for the imaging of nerve development in embryonic mouse. Developmental Dynamics. 236 (12), 3514-3523 (2007).
- Das, R. M., Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium. J. Vis. Exp. (62), e3920 (2012).
- Barnes, S. H., Price, S. R., Wentzel, C., Guthrie, S. C. Cadherin-7 and cadherin-6B differentially regulate the growth, branching and guidance of cranial motor axons. Development. 137 (5), 805-814 (2010).
