Summary
Les vecteurs viraux permettent une manipulation du gène ciblé. Nous démontrons une méthode pour l'expression génique conditionnelle ou l'ablation de la moelle épinière de souris, par injection stéréotaxique d'un vecteur viral dans la corne dorsale, un important site de contact synaptique entre les afférences somesthésiques primaires et les neurones du système nerveux central.
Abstract
Injection intra-parenchymateux d'un vecteur viral permet la manipulation génétique conditionnel populations distinctes de neurones ou des régions particulières du système nerveux central. Nous démontrons une technique d'injection stéréotaxique qui permet l'expression du gène ciblé ou le silence dans la corne dorsale de la moelle épinière de souris. L'intervention chirurgicale est de courte durée. Il nécessite laminectomie d'une vertèbre unique, offrant pour la récupération rapide de l'animal et de la motilité intacte de la colonne vertébrale. Injection contrôlée d'un volume de suspension petit vecteur à faible vitesse et à l'utilisation d'une micro-canule avec verre biseauté minimiser la lésion tissulaire. La réponse immunitaire locale au vecteur dépend des propriétés intrinsèques du virus utilisé, dans notre expérience, il est mineure et de courte durée quand une adéno-associé recombinant virus est utilisé. Un gène rapporteur tel que le renforcement de la protéine fluorescente verte facilite la distribution spatiale de surveillance du vecteur, et l'efficacité et cellulaire spécificité de la transfection.
Introduction
Les technologies de pointe de la manipulation génétique conditionnelle chez la souris permettent des approches multidimensionnelles à l'exploration des voies synaptiques et les connexions fonctionnelles dans le système nerveux central. Transgènes peut être régulée par petites molécules effectrices telles que la doxycycline agissant sur un transactivateur de tétracycline contrôlée, qui peut être conçu pour fonctionner comme un répresseur ou un activateur de la transcription du gène, ou le tamoxifène reconnaître une mutation de domaine de liaison au ligand du récepteur oestrogène 1 . Modification irréversible transgène est généralement obtenue par l'acide désoxyribonucléique (ADN) recombinases. Cre (recombinaison causes) et Flp (enzyme de recombinaison flippase) catalyser l'excision, inversion ou translocation de fragments d'ADN qui sont flanquées par loxP (lieu de passage sur x, P1) ou Frt (cible de reconnaissance flippase) sites, respectivement 1. Les applications incluent l'activation de gènes ou le silence et l'acide inductible ribonucléique (ARN) des interférences
4. Haute capacité (lâche) adénovirus, virus adéno-associé, l'herpès simplex virus et lentivirus sont couramment utilisés vecteurs neurotropes. Sélection du virus approprié pour une question de recherche est un élément essentiel de la conception expérimentale. Taille du transgène, l'itinéraire de livraison, la spécificité de l'infection des neurones par opposition aux cellules gliales, l'efficacité, l'infection effets secondaires inflammatoires et toxiques doivent être considérées 4.
Nous décrivons ici l'injection stéréotaxique d'un vecteur viral dans la corne dorsale de la moelle épinière, une technique que nous employons pour la régulation des gènes avec sursis dans notre recherche sur la neurobiologie de la douleur. La corne dorsale reçoit influx afférents primaires de neurones somatosensoriels y compris les neurones nociceptifs. Interneurones locaux traiter l'information avant de la transmettre neurones de projection dela corne dorsale du cerveau 5. On démontre l'infection des neurones de la corne dorsale de la colonne vertébrale segmentaire niveau L4 avec un neurotrope recombinant virus adéno-associé (rAAV) qui exprime la protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) sous un promoteur du cytomégalovirus constitutivement actif.
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Protocol
La procédure chirurgicale décrite a été approuvé par le soin des animaux et du Comité institutionnel d'utilisation (IACUC) de l'Université de Columbia.
1. Préparation de l'équipement et de la suspension de particules de virus
- Nettoyer et désinfecter le matériel, stériliser les instruments chirurgicaux et les pointes entaille en V qui seront utilisés pour fixer L1 vertèbre.
- Tirez et pipettes en verre coniques. Nous utilisons des pipettes qui ont un diamètre de pointe de 40 um et sont biseautés à un angle de 20 °. Stériliser les pipettes en verre.
- Mettre en place le cadre stéréotaxique, monter l'injecteur microseringue sur le manipulateur et de connecter l'injecteur au dispositif de commande.
- Fixez l'un des pipettes en verre à l'aide de la microseringue kit raccord à compression.
- Retirer le piston de la microseringue et remplissez la seringue avec de l'huile minérale. Oil Red O (1 - (2,5-diméthyl-4-(2,5-dimethylphenylazo) phénylazo)-2-naphtol) peut être ajouté à l'huile minérale pour augmenter sa visibility. Réinsérez le piston et le pousser à tout le chemin à la pointe. Soigneusement éviter de créer une bulle d'air.
- Préparer la suspension de particules de virus dans une enceinte de sécurité biologique. Décongeler le virus congelé dans la glace et, juste avant utilisation, le diluer avec de stérile saline tamponnée au phosphate à la concentration de particules souhaitée.
- Insérez la microseringue dans le support de l'injecteur.
- 5 ul de la suspension de virus sur une feuille de plastique faible, par exemple Parafilm. Abaissez la pointe de la pipette en verre dans la goutte et tirez sur le piston pour remplir la microseringue. Créer une petite bulle d'air à la pointe de la pipette pour l'empêcher de se boucher.
2. Laminectomie
- Préparer le secteur de la chirurgie en essuyant banc et coussin chauffant avec un désinfectant.
- Anesthésier la souris. Nous utilisons l'anesthésie par inhalation avec l'isoflurane (3% lors de l'induction, 2% -3% lors de l'entretien).
- Placez lubrifiant sur chaque œil afin de protéger les yeux de séchage pendant lafonctionnement.
- Raser les poils de la partie inférieure arrière de la nuque de la souris et désinfecter la peau avec une alternance de lingettes d'un antiseptique topique telles que la chlorhexidine ou la povidone-iode et de l'éthanol 70%. Isoler le site de manière aseptique avec champ opératoire et infiltrent le site de l'incision avec de la bupivacaïne (0,25%, 1:10 dilué avec du sérum physiologique).
- Inciser la peau à l'extrémité caudale de la cage thoracique le long de la ligne médiane (2-3 cm) et séparer le fascia recouvrant la colonne vertébrale.
- Parce que la moelle épinière arrête de pousser plus tôt au cours du développement postnatal de la colonne vertébrale, segment vertébral L4 se trouve sous la première vertèbre lombaire (L1). Vertèbre L1 est situé en aval de la vertèbre qui contient la dernière paire de nervures. Identifier et dénoncer L1 vertèbre en enlevant les petits muscles spinaux et les ligaments attachés à sa surface dorsale.
- Soulevez légèrement et maintenez L1 vertèbre avec une pince Adson. Utilisez une pince à laminectomie dédiés pour enlever la dorsale portion de la vertèbre (colonne vertébrale et de la lame) et exposer la moelle épinière. Éviter d'endommager la moelle épinière.
- Transfert de la souris sur la plaque chauffante dans le cadre stéréotaxique. Surveiller la température de la souris pendant l'opération ultérieure.
3. Injection
- Fixer vertèbre L1 avec des pointes entaille en V. Les pointes doivent stabiliser la colonne vertébrale de sorte que la vertèbre ne se déplace pas pendant la respiration.
- Apportez de la microseringue de plus près afin que la pointe de la pipette est au-dessus du site de laminectomie. Abaissez le piston jusqu'à ce que vous voyez la suspension de virus sortant de la pipette. Retirer la gouttelette avec un coton-tige stérile.
- Positionner la pointe de la pipette à la partie rostrale plus de la moelle épinière exposée. Centre de la pipette au-dessus du sillon médian postérieur, puis déplacez la pointe 500 um latéralement. Abaissez la pointe à la surface de la corde et à la perforation de la dure-mère ou, si vous travaillez avec une pipette en verre unbeveled, utiliser une canule en acier biseauté pour perforer la dura. Abaissez la pointe de la pipette en verre les 300 um dans la moelle épinière.
- Injecter 1 ul de la suspension virale à un taux de 200 nl / min.
- À la fin de l'injection, attendez au moins 2 minutes avant de se rétracter lentement la pipette.
- Répéter les étapes de 3,3 à 3,5 à la partie caudale plus de la moelle épinière exposée pour obtenir une distribution complète du vecteur viral dans L4 segment rachidien. Les deux points d'injection sont situés rostrale et caudale du segment L4 pour éviter d'endommager les tissus dans la région cible.
4. Fermeture des plaies
- Communiqué vertèbre L1 des pinces entaille en V et retirez la souris à partir du cadre stéréotaxique.
- Suturer l'aponévrose avec 5,0 vicryl. Le fascia fermé offre une couverture pour le site de laminectomie.
- Fermer la peau avec des sutures de nylon ou d'agrafes chirurgicales.
5. Soins postopératoires
- Transfert de la souris dans une cage de récupération de doux, de la literie nonparticular. Placez-le sur tIl côté pour respirer à l'aise. Surveiller l'animal jusqu'à ce qu'il soit en état d'alerte, ambulatoire et commence à boire.
- Nous fournissons une analgésie postopératoire pendant 72 heures par jour avec des injections sous-cutanées de carprofène (5,0 mg / kg).
- Surveiller le rétablissement post-opératoire par une inspection quotidienne pour les 3 premiers jours, puis tous les deux jours ou 3 jours par semaine jusqu'à ce que l'expérience est terminée.
- Enlever les sutures ou des agrafes de 7 à 10 jours après l'opération, lorsque la cicatrisation est complète.
- Euthanasier l'animal après la fin de l'expérience.
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Representative Results
Rendements de transfection avec succès l'expression des gènes robuste neurones de la corne dorsale injecté (figure 1), épargnant la corne dorsale du côté controlatéral, la corne ventrale et les ganglions de la racine dorsale.
Figure 1. La transfection de neurones de la corne dorsale. (A) Expression de l'EGFP rapporteur fluorescent (vert) dans la corne gauche dorsale de la moelle épinière L4, deux semaines après l'injection stéréotaxique de rAAV-EGFP (sérotype AAV2 / 8, 10 9 copies de génome / ul). Les neurones ont été immunocolorées pour les protéines noyaux neuronaux (NeuN, rouge). Têtes de flèche pointent vers éparpillés transfectées des cellules gliales dans la colonne dorsale. La barre d'échelle, 150 um. (B) Environ 80% des neurones de la corne dorsale médiale ont été infectés. La barre d'échelle, 20 um. Un anticorps monoclonal dirigé contre NeuN (EMD Millipore) a été utilisé à une dilution de 1:2,000 pour l'immunomarquage.
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Discussion
Injection stéréotaxique vecteur de ciblage permet neurones de la moelle épinière pour des applications telles que la cartographie du réseau neuronal sur la base de virus d'étalement transsynaptique 6,7 ou 8 optogenetic dissection, guidage axonal pendant la régénération de lésions 9,10, la thérapie génique ou pour la prévention ou le traitement de la neurodégénérescence 11, 12. Les vecteurs viraux ont été utilisés pour la manipulation génétique dans la moelle épinière pour étudier les voies somato-sensoriel, moteur et autonome 9,10,13-15. La souris est l'organisme modèle le plus largement utilisé dans des études impliquant l'injection stéréotaxique d'un vecteur viral dans le cerveau ou la moelle épinière, mais la technique a été utilisée dans d'autres espèces, y compris les primates non humains 16.
Injection stéréotaxique vecteur dans la moelle épinière de souris est sans danger; la procédure chirurgicale décrite ici nécessite une laminectomie unique au niveau du site d'injection de sorte que l'animal récupère sans instabilitésté dans ses mouvements du rachis. Injection et le retrait lent de la canule sont complètes dans les 10 minutes, toute la procédure, y compris la préparation de la peau et la fermeture des plaies dure environ 40 min. Nous fournissons une anesthésie postopératoire pendant 72 heures avec le carprofène, un anti-inflammatoire analgésique.
Afin de minimiser le traumatisme tissulaire, nous employons de canules de verre tiré avec un diamètre de pointe de 40 um. Une forte pointe biseautée canule facilite l'insertion dans la moelle épinière, ce qui justifie l'investissement dans un broyeur micropipette. Utilisation d'un broyeur permet également le maintien d'un angle de biseau uniforme dans chaque expérience, ce qui réduit la variation des résultats d'injection. Nous préférons de contrôle automatisé de la vitesse d'injection de plus de 17 dispense manuel pour une répartition uniforme de la suspension de particules de virus dans la corne dorsale et de réduire le risque d'une erreur d'injection. Tout aussi critique est une extraction lente de la canule, qui doit être initié 2-5 min après la fin de la injectipour éviter de tirer sur la suspension de virus en arrière et provoquant un déversement extrarachidienne.
Étendue et la répartition de la transfection intra-rachidienne dépendent de la dose injectée particules et les propriétés intrinsèques du vecteur viral tel sérotype et l'efficacité infection. La dilution optimale des particules doit être déterminée empiriquement pour chaque sérotype du virus et et peut varier entre différents lots d'un même virus. Efficacité de l'infection et la transduction d'ADN peut également varier en fonction de la population cible des neurones 18,19. AAV réalise le transfert de gènes dans les neurones sans pathogène et un minimum d'effets secondaires immunitaire 20. Dans notre expérience, l'infection des neurones de la corne dorsale est complète dans les 1-2 semaines et stables. Nous avons observé des réponses mineures microgliales au point d'injection, mais ceux-ci résolus en une semaine.
Nous vous recommandons de comparer différents sérotypes de vecteurs qui expriment un gène rapporteur tel que l'EGFP à evalluer les taux de transfection, déterminer les intervalles de temps entre l'injection et la transfection stable et déterminer si l'infection est limitée aux neurones. Spécificité dépendra du tropisme cellulaire du vecteur, le gène transfecté et son promoteur. Les enquêteurs étudient les voies somesthésiques devrait également examiner les neurones ganglionnaires de la racine dorsale pour une expression potentielle du gène rapporteur, qui peut résulter d'une infection de ces neurones à leurs bornes centrales dans la corne dorsale ou de la contamination du liquide céphalorachidien 19.
Aux États-Unis, l'utilisation de vecteurs viraux pour la manipulation des gènes est régulée par les lignes directrices du NIH pour la recherche avec des molécules d'ADN recombiné ( http://oba.od.nih.gov/rdna/nih_guidelines_oba.html ). Ces lignes directrices précisent les exigences pour la formation des chercheurs, la protection personnelle, de confinement vecteur viral, decontamination, l'élimination des matériaux contaminés tels que seringues et canules, et la stabulation après l'injection. Les chercheurs devraient travailler avec leur IACUC locale ou un organisme équivalent de la surveillance institutionnelle afin de déterminer les règles et les règlements qui s'appliquent à leur recherche.
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Disclosures
Les auteurs déclarent n'avoir aucun conflit d'intérêts financiers.
Acknowledgments
Nous remercions Bakhos A. Tannous, Ph.D., directeur du développement et de la production Vector dans la Neuroscience Center du Massachusetts General Hospital, Charlestown, Massachusetts, pour nous avoir fourni le vecteur rAAV-EGFP, et John Whang pour l'assistance technique. Ce travail a été soutenu par une bourse R01 NS050408 (JS) de l'Institut national des troubles neurologiques et des maladies.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spinal base plate | David Kopf Instruments | 912 | |
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Mouse gas anesthesia head holder | David Kopf Instruments | 923-B | |
| Adjustable base mounts | David Kopf Instruments | 982 | |
| V notch spikes | David Kopf Instruments | 987 | |
| Small animal temperature control system | David Kopf Instruments | TCAT-2LV | |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| UltraMicroPump (one) with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 | |
| Microsyringe, 65RN | Hamilton | 7633-01 | |
| RN compression fitting, 1 mm | Hamilton | 55750-01 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 |
References
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