Cette procédure donne des neurones télencéphaliques en passant par les points de contrôle qui sont similaires à ceux observés au cours du développement humain. Les cellules peuvent se différencier spontanément, sont exposés à des facteurs qui les poussent vers la lignée neuronale, sont isolés et sont étalées sur des lamelles couvre-objet pour permettre une différenciation terminale et de maturation.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
La spécification des neurones glutamatergiques télencéphaliques de cellules souches pluripotentes humaines
Dans cet article
Résumé
Résumé
Ici, une procédure par étapes pour générer efficacement télencéphaliques neurones glutamatergiques de cellules souches pluripotentes humaines (CSP) a été décrite. Le processus de différenciation est déclenchée par la rupture des CPP de l'homme en touffes qui complètent pour former des agrégats lorsque les cellules sont placées dans une culture en suspension. Les agrégats sont ensuite cultivées dans un milieu de CSEh jours 1-4 pour permettre une différenciation spontanée. Pendant ce temps, les cellules ont la capacité de devenir l'une des trois feuillets embryonnaires. De 5-8 jours, les cellules sont placées dans un milieu d'induction neurale pour les pousser dans la lignée neuronale. Autour jour 8, les cellules sont autorisés à fixer sur plaque de 6 puits et de se différencier au cours de laquelle la forme des cellules neuro-épithéliale. Ces cellules neuro-épithéliales peuvent être isolés au jour 17. Les cellules peuvent ensuite être conservé sous forme de neurosphères jusqu'à ce qu'ils soient prêts à être étalées sur des lamelles. L'utilisation d'un milieu de base sans aucun facteur de caudalizing, les cellules neuro-épithéliales sont précisésd télencéphaliques en précurseurs, qui peuvent ensuite être davantage différenciées en progéniteurs télencéphaliques dorsales et les neurones glutamatergiques efficacement. Dans l'ensemble, notre système offre un outil pour générer des neurones glutamatergiques de l'homme pour les chercheurs d'étudier le développement de ces neurones et les maladies qui les affectent.
Introduction
Les cellules souches pluripotentes (CSP), y compris les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et cellules souches pluripotentes induites (CISP), ont la capacité de produire tous les types de cellules dans le corps, y compris les neurones 1-3. Différenciation dirigée des différents sous-types neuronaux du PSC de l'homme détient la clé de l'application de ces cellules en médecine régénérative. La génération des sous-types neuronaux fonctionnels au cours du développement est un processus complexe impliquant l'induction de la lignée neuronale, la spécification des progéniteurs régionales le long de l'axe rostro-caudal, et la différenci....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
1. Génération des agrégats cellules souches pluripotentes humaines (D1 à D4)
- Cellules souches pluripotentes humaines sont mises en culture sur des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) alimentateurs en présence d'un milieu additionné de CSEh facteur de croissance des fibroblastes basique (bFGF, 4 ng / ml). Après 5-7 jours de culture, lorsque les colonies sont grandes, mais encore indifférencié, ils sont prêts pour la prochaine étape.
- La solution enzymatique doit d'abord être préparé. Dans un tube de 50 ml, dissoudre la dispase (ou collagénase) à un 1 mg / ml dans du milieu DMEM/F12 concentration. Comme ces solutions mélanger meilleur....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
Ici, un protocole de différencier les CSP de l'homme dans télencéphaliques neurones glutamatergiques au travers de plusieurs étapes essentielles: la formation d'agrégats de la CFP, l'induction de cellules neuro-épithéliales, la production de progéniteurs télencéphaliques et la différenciation terminale de ces progéniteurs en neurones télencéphaliques (Figure 1) a été décrits. Ce système est robuste et efficace dans la production de progéniteurs des neurones glutamatergiques et télencéphaliqu.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Il ya plusieurs étapes importantes au cours du processus de différenciation neurale. Il est important de s'assurer que les CSP sont pluripotentes humaines car, sinon, les cellules peuvent déjà être biaisée en vue de devenir une lignée non neuronales. Cela peut être confirmé par coloration des CSP de l'homme avec des anticorps contre les marqueurs de pluripotence comme Oct4, Sox2, Nanog, et Tra-1-60 1-3. Si les guichets de l'homme n'attache pas très bien après les passages, inhibiteur de ROCK (.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent n'avoir aucun conflit d'intérêts financiers.
Remerciements
Les auteurs tiennent à remercier le Dr Y. Sasai pour avoir généreusement fourni l'anticorps FOXG1. Ce travail a été soutenu par des subventions souches Connecticut recherche sur les cellules (08-SCB-UCHC- 022 et 11-SCB24) et la Fondation paraplégie spastique.
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Milieu d’aigle modifié de Dulbecco avec mélange de nutriments F12 (DMEM/F12) | Gibco | 11330-032 | |
| Substitut de sérum Knockout | Gibco | 10828-028 | |
| L-glutamine (200 mM) | Gibco | 25030 | |
| Acides aminés non essentiels | Gibco | 1140-050 | |
| 2-Mercapt– ; thanol (14.3 M) | Sigma | M-7522 | |
| Milieu neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| B27 | Gibco | 12587-010 | |
| Héparine | Sigma | H3149 | |
| Poly-L-ornithine hydrobromure (polyornithine) | Sigma | 116K5103 | |
| Laminine (humain) | Sigma | L-6274 | |
| Laminine (souris) | Invitrogen | 23017-015 | |
| FBS | Gemini | 100-106 | |
| Albumine sérique bovine (BSA) | Sigma | A-7906 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Collagénase | Invitrogen | 17104-019 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Inhibiteur de ROCK | Stemgent | 04-0012 | |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010 | |
| Dorsomorphine | Stemgent | 04-0024 | |
| Facteur de croissance des fibroblastes 2 (FGF2, bFGF) | Invitrogen | 13256-029 | |
| Inhibiteur de trypsine | Gibco | 17075 | |
| 0,1 % gélatine | Anticorps Millipore | ES-006-B | |
| Foxg1 | Anticorps Dr. Y. Sasai | ||
| Hoxb4 (1:50) | Études développementales Hybridoma Bank | I12 | |
| Pax6 anticorps (1:5000) | Études développementales Hybridoma Bank | PAX6 | |
| Nkx2.1 anticorps (1:200) | Chemicon | MAB5460 | |
| Tbr1 anticorps (1:2000) | Chemicon | Anticorps AB9616 | |
| vGLUT1 (1:100) | Systèmes synaptiques | 135302 | |
| facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF) | PrepoTech Inc. | 450-02 | |
| Facteur neurotrophique dérivé de la glie (GDNF) | PrepoTech Inc. | 450-10 | |
| Facteur de croissance de l’insuline 1 (IGF1) | PrepoTech Inc. | 100-11 | |
| Cyclique AMP (cAMP) | Sigma | D-0260 | |
| Sonic hedgehog (SHH) | R& D | 1845-SH | |
| Tubes de 50 ml | Becton Dickinson (BD) | 352098 | |
| Tubes de 15 ml | 352097 | ||
| Plaques à 6 puits | BD | 353046 | |
| Plaques à 24 puits | Flacons 353047 | ||
| T25 (non traités) | Flacons 353009 | ||
| T75 (non traités) | Sacs | 353133 | |
| Couvre-objectifs | Chemiglass Life Sciences | 1760-012 | |
| 6 cm Boîtes de Pétri | BD | 353004 | |
| 9'' pipettes en verre | Fisher | 13-678-20D | |
| Filtres Steriflip (0.22 &mu ; M) | Filtres Millipore | SCGP00525 | |
| Stericup 1 000 ml (0,22 &mu ; M) | Millipore | SCGPU10RE | |
| (Observer A1) | de dioxyde de carbone Zeiss | R2625 | |
| (Hera Cell 150) | Thermo Electron Corporation | ||
| (Sterilgard III Advance) | Centrifugeuse The Baker Company | ||
| (5702 R) | Eppendorf |
Références
- Takahashi, K., Tanabe, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
