Questa procedura produce neuroni telencefalici passando attraverso i punti di controllo che sono simili a quelli osservati durante lo sviluppo umano. Le cellule possono differenziarsi spontaneamente, sono esposti a fattori che li spingono verso il lineage neurale, sono isolati, e vengono piastrate su vetrini per consentire la differenziazione terminale e maturazione.
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Articolo metodologico
La specifica di telencefalici neuroni glutamatergici di cellule staminali umane pluripotenti
In questo articolo
Sommario
Abstract
Qui, una procedura graduale per generare efficacemente telencefalici neuroni glutamatergici da cellule staminali pluripotenti (PSC) è stato descritto. Il processo di differenziazione è iniziato rompendo i PSC umani in ciuffi che completano fino a formare aggregati quando le cellule sono posti in coltura in sospensione. Gli aggregati vengono poi coltivate in terreno hESC da 1-4 giorni per consentire differenziazione spontanea. Durante questo periodo, le cellule hanno la capacità di diventare uno dei tre strati germinali. Da 5-8 giorni, le cellule sono posti in un mezzo di induzione neurale per spingerli nella discendenza neurale. Circa 8 giorni, le cellule vengono fatte attaccare su piastre da 6 pozzetti e differenziare durante i quali la forma neuroepiteliale cellule. Queste cellule possono essere isolate neuroepiteliale al giorno 17. Le cellule possono quindi essere mantenuta come neurosfere finché non sono pronti per essere piastrate su vetrini. Utilizzo di un supporto di base senza alcun fattore caudalizing, cellule neuroepiteliali sono spécifiéd in precursori telencefalici, che possono poi essere ulteriormente differenziate in progenitori telencefalici dorsali e neuroni glutamatergici in modo efficiente. Nel complesso, il nostro sistema fornisce uno strumento per generare neuroni umani glutamatergici per i ricercatori per studiare lo sviluppo di questi neuroni e le malattie che li riguardano.
Introduzione
Le cellule staminali pluripotenti (PSC), includendo sia le cellule staminali embrionali umane (hESC) e cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs), hanno la capacità di generare ogni tipo di cellula del corpo, compresi i neuroni 1-3. Differenziazione diretta dei vari sottotipi neuronali da CSP umani è la chiave per l'applicazione di queste cellule nella medicina rigenerativa. La generazione di funzionali sottotipi neuronali durante lo sviluppo è un processo complesso che coinvolge l'induzione di lignaggio neurale, la specificazione dei progenitori regionali lungo l'asse rostro-caudale, e la differenziazione di post-mitotici tipi di neuroni d....
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Protocollo
1. Generazione di aggregati umani di cellule staminali pluripotenti (D1-D4)
- Le cellule staminali pluripotenti sono coltivati in fibroblasti embrionali di topo (MEF) alimentatori in presenza di terreno hESC supplementato con fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF, 4 ng / ml). Dopo 5-7 giorni di cultura, quando le colonie sono grandi, ma ancora indifferenziati, sono pronti per il passo successivo.
- La soluzione enzimatica deve prima essere preparato. In una provetta da 50 ml, sciogliere il dispasi (o collagenasi) a mg / ml di concentrazione in 1 DMEM/F12 medie. Dal momento che queste soluzioni mescolare meglio quando riscaldato, porre la provet....
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Risultati
Qui, un protocollo per differenziare PSCs umani in telencefalici neuroni glutamatergici attraverso diverse fasi fondamentali: la formazione di aggregati PSC, l'induzione di cellule neuroepiteliali, la generazione di progenitori telencefalici, e la differenziazione terminale di questi progenitori in neuroni telencefalici (Figura 1) ha stato descritto. Questo sistema è robusto ed efficiente nella generazione dei progenitori telencefalici e neuroni glutamatergici. Come esempio (Figura 2),
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Discussione
Ci sono diversi passaggi critici durante il processo di differenziazione neurale. È importante garantire che i PSC umani sono pluripotenti perché altrimenti le cellule possono già essere polarizzato verso diventare un non-lineage neuronale. Ciò può essere confermato dalla colorazione dei PSC umani con anticorpi contro marcatori pluripotenza come Oct4, Sox2, Nanog, e Tra-1-60 1-3. Se i PSC umani non attribuiscono molto bene dopo passaging di loro, inibitore ROCK (Y27632) può essere aggiunto per aiutare. Per co.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi finanziari.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Y. Sasai generosamente per fornire l'anticorpo Foxg1. Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni ricerca con le cellule staminali (Connecticut 08-SCB-UCHC- 022 e 11-SCB24) e della Fondazione Paraplegia spastica.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Terreno di coltura Dulbecco's modified eagle con miscela di nutrienti F12 (DMEM/F12) | Gibco | 11330-032 | |
| Knockout Serum Replacer | Gibco | 10828-028 | |
| L-glutammina (200 mM) | Gibco | 25030 | |
| Aminoacidi non essenziali | Gibco | 1140-050 | |
| 2-Mercapt– tanolo (14,3 M) | Sigma | M-7522 | |
| Mezzo neurobasale | Gibco | 21103-049 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| B27 | Gibco | 12587-010 | |
| Eparina | Sigma | H3149 | |
| Poli-L-ornitina bromidrato (poliornitina) | Sigma | 116K5103 | |
| Laminina (umana) | Sigma | L-6274 | |
| Laminina (topo) | Invitrogen | 23017-015 | |
| FBS | Gemini | 100-106 | |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Sigma | A-7906 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Collagenasi | Invitrogen | 17104-019 | |
| Accutase | Innovative Cell Tecnologie | AT104 | |
| ROCK Inibitore | Stemgent | 04-0012 | |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010 | |
| Dorsomorfina | Stemgent | 04-0024 | |
| Fattore di crescita dei fibroblasti 2 (FGF2, bFGF) | Invitrogen | 13256-029 | |
| Inibitore della tripsina | Gibco | 17075 | |
| 0,1% gelatina | Millipore | ES-006-B | |
| Foxg1 | . Y. Sasai | ||
| Anticorpo Hoxb4 (1:50) | Anticorpo Hybridoma Bank | I12 | |
| Pax6 (1:5000)Anticorpo | Hybridoma Bank | PAX6 | |
| Nkx2.1 (1:200)Anticorpo | Chemicon | MAB5460 | |
| Tbr1 (1:2000) | Chemicon | AB9616 | |
| vGLUT1 anticorpo (1:100) | Sistemi sinaptici | 135302 | |
| Fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF) | PrepoTech Inc. | 450-02 | |
| Fattore neurotrofico derivato dalla glia (GDNF) | PrepoTech Inc. | 450-10 | |
| Fattore di crescita dell'insulina 1 (IGF1) | PrepoTech Inc. | 100-11 | |
| AMP ciclico (cAMP) | Sigma | D-0260 | |
| Riccio sonico (SHH) | R& D | 1845-SH | |
| Provette da 50 ml | Becton Dickinson (BD) | 352098 | |
| Provette da 15 ml | BD | 352097 | |
| Piastre da 6 pozzetti | BD | 353046 | |
| Piastre da 24 pozzetti | BD | 353047 | |
| Palloni T25 (non trattati) | Balloni BD | 353009 | |
| T75 (non trattati) | BD | 353133 | |
| Vetrini coprioggetti | Chemiglass Life Sciences | 1760-012 | |
| Piastre Petri da 6 cm | BD | 353004 | |
| Pipette in vetro da 9'' | Filtri Steriflip Fisher | 13-678-20D | |
| (0,22 &; M) | Millipore | SCGP00525 | |
| filtri Stericup 1.000 ml (0,22 μ M) | Millipore | SCGPU10RE | |
| Microscopio a contrasto di fase (Observer A1) | Incubatore ad anidride carbonica Zeiss | R2625 | |
| (Hera Cell 150) | Thermo Electron Corporation | ||
| Cappa di biosicurezza (Sterilgard III Advance) | The Baker Company | ||
| Centrifuga (5702 R) | Eppendorf |
Riferimenti
- Takahashi, K., Tanabe, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science.
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Ristampe e permessi
