Summary
Måling av glomerulær filtrasjonshastighet (GFR) er gullstandarden for nyrefunksjonen vurdering. Her beskriver vi en high-throughput fremgangsmåte som tillater bestemmelse av GFR i bevisste mus ved hjelp av en enkelt bolusinjeksjon, bestemmelse av fluorescein-isothiocyanat (FITC)-inulin i plasma og beregning av GFR av en to-fase eksponentiell modell.
Abstract
Måling av glomerulær filtrasjonshastighet (GFR) er gullstandarden i nyrefunksjonen vurdering. Foreløpig undersøkere bestemme GFR ved å måle nivået av endogent eller eksogent biomarkør kreatinin anvendt radioaktivt merket inulin (3 H, eller 14 C). Kreatinin har betydelig ulempe at proksimale tubulære sekresjon utgjør ~ 50% av total renal kreatinin i nyrene, og derfor kreatinin er ikke en pålitelig GFR markør. Avhengig av resultatene av eksperimentet, kan inulin clearance bestemmes ved en intravenøs enkelt bolusinjeksjon eller kontinuerlig infusjon (intravenøs eller osmotisk minipump). Begge tilnærminger krever innsamling av plasma eller plasma og urin, henholdsvis. Andre ulemper med radioaktivt merket inulin omfatte bruk av isotoper, tidkrevende kirurgiske forberedelse av dyrene, og kravet til en terminal eksperiment. Her beskriver vi en fremgangsmåte som anvender en enkelt bolusinjeksjon avfluorescein isothiocyanat-(FITC) merket inulin og måling av fluorescens i dens 1-2 mL fortynnet plasma. Ved å anvende en to-kammer-modellen, med 8 blodprøvetakinger pr mus, er det mulig å måle GFR i opp til 24 mus pr dag ved hjelp av en spesiell arbeidsflytgenerator protokollen. Denne metoden krever bare kort isoflurananestesi med alle blodprøver blir samlet i en ikke-behersket og våken mus. En annen fordel er at det er mulig å følge mus over en periode på flere måneder og behandlinger (dvs. gjør parvise forsøk med kosten endringer eller stoffet applikasjoner). Vi håper at denne teknikken for å måle GFR er nyttige for andre etterforskere som studerer mus nyrefunksjon og vil erstatte mindre nøyaktige metoder for estimering av nyrefunksjonen, slik som plasma kreatinin og blodureanitrogen.
Introduction
Satsen for dannelse av plasma ultrafiltratet glomerulus har blitt grunnlag for å vurdere nyrefunksjonen (glomerulær filtrasjonshastighet, GFR). Den ideelle markør for å avgjøre GFR bør være fritt filtrert verken skilles eller reabsorberes og ikke metaboliseres. En slik atferd ble funnet å være sant for inulin, og inulin clearance har blitt en gullstandard for bestemmelse av GFR tre. Mens clearance av kreatinin er mye brukt som et mål på GFR hos mennesker og dyr, ikke kreatinin ikke oppfyller kravene til et ideelt GFR markør. Rundt 10-40% av kreatinin-clearance hos mennesker er konsekvensen av aktiv tubulær sekresjon 1, 11, og renal utskillelse av kreatinin er også fremtredende i mus og rotter 4, 7, 9, 22. Renal dysfunksjon er kjent for å øke den rørformede sekresjon av kreatinin noe som begrenser dens verdi som en markør på en GFR, 2.. Vi har tidligere vist at organisk anion transporter isoform3 (OAT3) bidrar til murine nedsatt kreatinin utskillelsen 22. Imidlertid krever inulin klaring typisk bruk av radioaktivt merket inulin (3 H, eller 14 C). Den radioaktive bestemmelse av inulin kan brukes både i bedøvede og bevisste mus, men havner ulempene ved tallrike og strenge sikkerhetsforskrifter håndteringsspørsmål iboende ved bruk av radioaktive isotoper. Langs disse linjene, kirurgiske klaring forberedelsene til bestemmelse av GFR er tidkrevende så vel som terminal i naturen. I 1999 Lorenz et al. 12. innført FITC-inulin som en markør av single nephron GFR i bedøvet mus. Fem år senere Qi et al. 15. bestemmes hel nyre GFR hos våkne mus ved hjelp av FITC-inulin. Alternative protokoller nå bruker FITC-inulin som en eksogen markør for å måle GFR hos våkne og bedøvet mus. Disse protokollene beholde følsomheten av radioaktivt inulin ved hjelp av fluorescens detectipå og omgå ulempene med å jobbe med et radioaktivt merket markør. FITC-inulin analysen ble modifisert av andre syv, åtte og oss 22, 23 for å dra nytte av microvolume evne til NanoDrop 3300 fluorospectrometer. Dette gjør redusere det totale prøvevolum for å <100 mL blod per GFR måling.
Med fremgangsmåten og høy gjennomstrømning protokollen gitt i denne publikasjonen demonstrerer vi muligheten for måling GFR i opptil 24 bevisste mus pr dag. Denne teknikken kan være nyttig for andre etterforskere som studerer murine GFR og vi håper det vil erstatte mindre nøyaktige metoder som indekser for nyrefunksjon, for eksempel kreatinin og blodureanitrogen.
Protocol
En. Løsninger
- 0,85% NaCl: 8,5 g NaCl / 1 l DDH 2 O (8,5 g / l).
- 0,5 mol / l HEPES pH 7,4 (oppløse 59,6 g av HEPES i 0,5 DDH 2 0 og juster pH til 7,4 ved anvendelse av 10 N NaOH).
2. Utarbeidelse av FITC-inulin Injection Solution
- Vei FITC-inulin å forberede en 5% oppløsning og oppløses i 0,85% NaCl (vanligvis 100 mg / 2 ml 0,85% NaCl) ved oppvarming til 90 ° C inntil det er helt oppløst.
- Vei oppløst FITC-inulin løsning og merk vekt.
- Skjær en 20 cm stykke dialysemembran (molekylvekt cut-off: 1000) og satt i DDH 2 O i 30 min for å fjerne rester av NaN 3 fra membranen og skylle et par ganger etterpå.
- Fyll oppløst FITC-inulin inn dialysemembran og forsegle ordentlig med nedleggelser.
- Veie hele dialysemembran.
- Sett dialysemembran i 1 l 0,85% NaCl-oppløsning og røres langsomt lys-beskyttet i 24 timer ved roOM temperatur.
- Veie hele dialysemembran igjen og beregne ny konsentrasjon (vann vil osmotisk bevege seg inn i membranen og ubundet FITC, eller bundet FITC-inulin <1,000 molekylvekt vil bevege seg ut av membranen, og derfor vil konsentrasjonen av FITC-inulin avta vesentlig) .
- Den nye FITC-inulin konsentrasjon (c) beregnes ved hjelp av følgende formel: C = N / V, der n = innledende FITC-inulin mengde, V = nytt volum (forskjell i vekten av dialyse-ledning før og etter dialyse pluss volumet av innledende FITC-Inulin løsning).
- Før bruk sterilisere dialyserte FITC-inulin oppløsning ved filtrering gjennom et 0,22 um sprøytefilter.
- Hold FITC-inulin beskyttet mot lys (aluminiumfolie) ved 4 ° C. Dialysert og steriliseres FITC-inulin kan anvendes i opp til 2 uker. Deltok FITC-inulin kan oppløses ved å re-oppvarming ved 90 ° C i noen minutter.
Merk: Hvis du bruker16-18 FITC-sinistrin, som ikke krever dialyse, kan alle trinnene som kreves for dialyse hoppes over.
3. Injeksjon og Blood Collection
- Ta kroppsvekt (kv) av musene før forsøket.
- Anesthetize mus kort med isofluran.
- For høy gjennomstrømming av seks mus følger protokoll gitt i figur 3..
- Injisere 2 ul / g kroppsvekt av dialyserte FITC-inulin i retroorbital plexus 24 ved hjelp av en G30 ½ i nål (fjerne luftbobler fra 100 pl Hamilton sprøyte ved først å bruke en G26 ½ i nål og deretter bytte til en G30 ½ i nål for injeksjon).
- Skjær 1 mm av mus hale med saks gang og samle opp blod ved 3, 5, 7, 10, 15, 35, 56 og 75 min etter injeksjon i Na-Heparin minicapillaries. Seal minicapillaries etter blodprøvetaking med cha-forsegling.
- Hold prøver beskyttet mot lys.
- Sett forseglet minicapillaries inne hematocrit kapillærer og sentrifuger i 5 min.
- Bryt minicapillaries ved hjelp av en diamant kutter og overføre hele plasma ved å pipettere inn i et 0,2 ml rør.
- Gjør en 1:10 fortynning ved anvendelse av 2 pl av plasma og 18 ul 0,5 mol / l HEPES (pH 7,4) i 0,2 ml ny-røret (prøvene kunne lagres over natten ved 4 ° C i fluorescens målinger).
- Mål 2 mL fortynnet prøve med NanoDrop 3300 i duplikater. Beskrivelsen og bruken av apparatet er beskrevet her 5.
4. Utarbeidelse av standarder
- Samle blod fra mus av samme bakgrunn belastning i heparin belagt hematokrit kapillærene, spinner ned og fortynne 01:10 med 0,5 mol / L HEPES (pH 7,4), vanligvis 80 mL plasma + 720 mL HEPES.
- Fortynne FITC-inulin injeksjon løsning med fortynnet mus plasma for å få følgende standard fortynninger:
01:10: 10 mL ufortynnet FITC-inulin løsning + 90 mL fortynnet mus plasma
1:100: 10 & mu; L (01:10) oppløsning + 90 mL fortynnet mus plasma
1:1.000: 10 pl (1:100) løsning + 90 mL fortynnet mus plasma
1:2,000: 30 ul (1:1)-løsning + 30 pl fortynnet plasma mus
1:10.000: 10 pl (01:05) oppløsning + 40 mL fortynnet mus plasma
1:20,000: 20 pl (1:1)-løsning + 20 pl fortynnet plasma mus
1:100.000: 10 pl (01:05) oppløsning + 40 mL fortynnet mus plasma
Konsentrasjonen av standardene vil avhenge av dialyse, og alltid vil være forskjellig for hvert preparat av FITC-inulin. Det er nødvendig å gå inn i konsentrasjonen for standard kurve nytt hver gang. - Analysere data for å beregne GFR med passende programvare (f.eks GraphPad Prism) ved hjelp av en to-eksponentiell fase, som beskrevet her i 15, 20 og vist i seksjon Representative resultater.
Representative Results
GFR vil bli beregnet ved hjelp av følgende formel:
GFR = n / (A/K1 + B/K2), hvor
n = injisert mengde (n = c • V, hvor c = FITC-inulin konsentrasjon, V = injisert volum)
A = Span1, y-skjæringspunktet for eliminering
K1 = forfall konstant for eliminering
B = Span2, y-skjæringspunktet for distribusjon
K2 = forfall konstant for distribusjon
Merk: A, K1, B og K2 er forkortelser gitt av GraphPad Prism, alle programvare stand til å analysere to-fase eksponentiell kan brukes, men kanskje andre vitenskapelige programvare bruker forskjellige forkortelser.
Ved å anvende en to-fase eksponentiell kurve, som er basert på plasma FITC-inulin konsentrasjoner, bør en kurve tilsvarende den vist i figur 1 oppnås. Beregning GFR ved den ovenfor angitte formel vist (og som beskrevet her i <sup> 20) gjør det mulig å detektere svekkelse av nyre-funksjonen 15 eller glomerulær hyperfiltration 8, 23 som finnes i mus med type 1 diabetes mellitus (figur 2).
Figur 1. For å måle GFR hos våkne mus, er plasma kinetikk av FITC-inulin etter en enkelt dose intravenøs injeksjon brukes. For beregning av GFR, er en to-kupé modell ansatt. I de to-kammer-modellen, representerer initiell rask nedbrytning fase omfordeling av FITC-inulin fra den intravaskulære kammer i ekstracellulær væske. Den senere fase, med langsommere forfall i FITC-inulin konsentrasjon, reflekterer hovedsakelig systemisk clearance fra plasma.
Figur 2. Deteksjon av diabetisk hyperfiltration i villtype-mus. Type I diabetes mellitus ble indusert ved intraperitoneal anvendelse av streptozotocin (STZ, 50 mg / kg i 5 påfølgende dager). GFR ble bestemt før (basal) og 5 uker etter induksjon av diabetes. På grunn av tubuloglomerular tilbakemeldinger, fører til en primær økning i proksimale reabsorption tidlig diabetisk hyperfiltration 21 et funn som er reproduserbar i vill-type mus (n = 10, p <0.01 vs basal samme mus).
Figur 3. Flyt-diagram for måling av GFR i et sett av seks mus. For å måle hele nyren GFR ved enkelt bolusinjeksjon metoden, må 8 blodprøver samles ved 3, 5, 7, 10, 15, 35, 56 og 75 min etter FITC-inulin injeksjon. Tallene angir tidspunkter. Tall i parentes angir prøvenummer. Tidspunkter igjen av den vertikale røde linjen indikerer injeksjontidspunkter (ved 0, 11, 22, 33, 44 og 55 min). Hver mus er merket med en annen farge. For å få sekvensielle blod samlinger følg pilene. Grå bokser indikerer når neste mus må være forberedt på isoflurananestesi før injeksjon. Ved hjelp av denne protokollen minimumstiden mellom to blod samlinger fra forskjellige mus er 1 min.
Discussion
Foreliggende studie beskriver en teknikk for bestemmelse av GFR i bevisste mus ved enkelt-bolus injeksjon og analyse av fluorescensen i 8 blodprøver ved to-fase eksponensiell desintegrasjon. En GFR måling i en mus tar 75 min. Ved å bruke en spesiell flow-diagram, er det mulig å måle GFR av 6 mus i 130 min. Det er mulig å gjenta dette flytskjema protokollen opp til fire ganger per dag og måle GFR i 24 mus. Vi modifiserte denne metode, slik at det er mulig å samle blod fra en liten hale snip snarere enn halevenen punktering, som er raskere og enklere for undersøkere å utføre i forhold til halevenen punktering. Ved å bruke 10 ul hematokrit kapillærer og en fortynning på 1:10, er det mulig å redusere den totale mengden av blod som er nødvendig for å <100 ul. Til slutt blir fluorescens målt ved hjelp av en NanoDrop 3300 fluorospectrometer, som tillater bestemmelse av fluorescens i 1-2 pl av fortynnede prøven. Denne metoden vil gi den interesserte investigatora sant GFR verdi. I kontrast, kreatinin målinger i mus har flere svakheter, inkludert "kreatinin blind range" og problemer relatert til spesifikke og sensitive besluttsomhet. Den "kreatinin blind range" begrenser dens funksjon som en markør for GFR fordi serum kreatinin forblir i normalområdet inntil 50% av nyrefunksjonen er tapt 19. Siden flere etterforskere utnytte genmodifiserte mus i sin forskning for å studere renal fysiologi og patofysiologi, bærer dette følgende problem: forutsatt en knockout mus av genet X ville ha en betydelig lavere GFR (med 40%) sammenlignet med en vill-type mus, en enkel screening ved å sammenligne plasma kreatinin ville ikke oppdage denne forskjellen. Behovet for en god nøyaktig metode for bestemmelse GFR blir mer kritisk jo mindre forskjellene i GFR bli.
Mus har høye konsentrasjoner av ikke-kreatinin chromagens i sin plasma og urin som forstyrrer kommersielttilgjengelige kreatinin analyser. Som en konsekvens av dette assay som er basert på alkalisk pikrat Jaffe reaksjon overestimate kreatinin-konsentrasjonen i plasma sammenlignet med væskekromatografi med høy ytelse (HPLC) 6 bestemmelse, 13.. En annen begrensning er at serumkreatinin er under påvisningsgrensene for flere kommersielt tilgjengelige analyser i forhold til HPLC-bestemmelse. Men ved hjelp av enzymatiske reaksjoner undersøkere var i stand til å bestemme plasma-kreatinin hos 10 mus, 22..
GFR i et lignende område ble funnet hos bevisste mus ved anvendelse av en tilsvarende enkelt-bolus injeksjon metode samt urin-FITC-inulin klaring 14.. I motsetning til deres fremgangsmåte, ikke vår protokollen med hale klipp krever ikke spesielle forholdsregler for å bevare fartøyet integritet i forhold til halen blodåre eller saphenavene punktering. For urin / plasma basert FITC-inulin clearance er det nødvendig å kirurgisk implantat to osmotisk minipumps. To pumper er nødvendig for å oppnå høy nok steady-state plasma FITC-inulin konsentrasjoner som er klart kan skilles fra bakgrunnen. Dette krever også bruk av metabolske bur for en fullstendig og tidsbestemt urinprøvetakning. Merdene må skylles på kontoen for et tap på 25-37% av FITC-inulin, som ellers skjer uten skylling.
Fallgrubene bruke denne FITC-inulin metoden er begrenset. Etterforskerne skal være oppmerksom på følgende: (i) sikre at det ikke er luftbobler i sprøyten brukes til injeksjon av FITC-løsning, må (ii) komplett retrobulbar injeksjon oppnås fordi mengden injisert bestemmer beregnet GFR, og ( iii) mus vil mest sannsynlig urinere i løpet av 75 min GFR eksperiment, så unngå forurensing av blodprøver med urin, noe som vil ha en meget høy konsentrasjon FITC-inulin som en konsekvens av nyrer konsentrasjon evne.
Generelle fordeler of dette FITC-inulin metode inkluderer følgende: (i) det er en ikke-radioaktiv teknikk, (ii) er det mulig å gjenta målinger flere ganger i den samme mus, (iii) analysen kan utføres i bevisste mus, ( iv) ingen urinprøvetakning er nødvendig, og (v) en high-throughput alternativ kan utnyttes. Ulemper for enkelt bolusinjeksjon omfatter behovet for dialyse av FITC-inulin, som kan overvinnes ved å bruke en bedre FITC-markør, FITC-sinistrin, som er tilgjengelig nå, og kan måles transkutant ved hjelp av en spesiell miniatyrisert ningen 18. Selv om GFR er målt, er det ikke mulig å måle fraksjonelle ekskreter på væske-eller ioner med denne metoden.
Til sammen gir denne metoden gjennomførbarheten av et high-throughput metode for måling av GFR hos våkne mus. Dermed kan denne teknikken være av interesse for andre forskere som er interessert i å bestemme nyrefunksjon hos mus.
Disclosures
Forfatteren fått støtte til å dekke kostnadene ved denne publikasjonen av Thermo Fisher Scientific.
Acknowledgments
Jeg takker Dr. Jessica Dominguez rieG for kritisk lesning av dette manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av American Heart Association (Forsker Development Grant 10SDG2610034), Carl W. Gottschalk Forskning Grant av American Society of Nefrologi, National Institute of Diabetes og Digestive og nyre sykdommer O'Brien Center for akutt nyreskade Forskning ( P30DK079337), og Department of Veterans Affairs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| FITC-inulin | Sigma-Aldrich | F3272 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7706 | |
| Isoflurane | Webster Veterinary | 78366551 | |
| Dialysis membrane (MWCO 1000) | Spectrum Laboratories | 132636 | |
| Membrane closure | Spectrum Laboratories | 132736 | |
| 80 μl Hematocrit capillaries | Drummond Scientific | 22362566 | |
| Hematocrit centrifuge | IEC | Micro-MB | |
| 10 μl Na+-Heparin minicaps | Hirschmann | 9000210 | |
| Syringe (100 μl) | Hamilton | 80601 | |
| Fluorospectrometer | Thermo-Fisher Scientific | NanoDrop 3300 | |
| Filter (0.22 μm) | Spectrum Laboratories | 880-26464-UE | |
| Sealant | Châ-seal | 510 | |
| Needles (G26 ½ and G30 ½) | Becton Dickinson | 305111 & 305106 |
References
- Bauer, J. H., Brooks, C. S., Burch, R. N. Clinical appraisal of creatinine clearance as a measurement of glomerular filtration rate. Am. J. Kidney Dis. 2 (3), 337-346 (1982).
- Carrie, B. J., Golbetz, H. V., Michaels, A. S., Myers, B. D. Creatinine: an inadequate filtration marker in glomerular diseases. Am. J. Med. 69 (2), 177-182 (1980).
- Chasis, H., Ranges, H. A., Goldring, W., Smith, H. W. The Control of Renal Blood Flow and Glomerular Filtration in Normal Man. J. Clin. Invest. 17 (5), 683-697 (1938).
- Darling, I. M., Morris, M. E. Evaluation of "true" creatinine clearance in rats reveals extensive renal secretion. Pharm. Res. 8 (10), 1318-1322 (1991).
- NanoDrop 3300 Fluorospectrometer - www.nanodrop.com [Internet]. , Thermo Scientific. Available from: http://www.nanodrop.com/Productnd3300overview.aspx (2013).
- Dunn, S. R., Qi, Z., Bottinger, E. P., Breyer, M. D., Sharma, K. Utility of endogenous creatinine clearance as a measure of renal function in mice. Kidney Int. 65 (5), 1959-1967 (2004).
- Eisner, C., Faulhaber-Walter, R., et al. Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice. Kidney Int. 77 (6), 519-526 (2010).
- Faulhaber-Walter, R., Chen, L., et al. Lack of A1 adenosine receptors augments diabetic hyperfiltration and glomerular injury. J. Am. Soc. Nephrol. 19 (4), 722-730 (2008).
- FINGL, E. Tubular excretion of creatinine in the rat. Am. J. Physiol. 169 (2), 357-362 (1952).
- Keppler, A., Gretz, N., et al. Plasma creatinine determination in mice and rats: an enzymatic method compares favorably with a high-performance liquid chromatography assay. Kidney Int. 71 (1), 74-78 (2007).
- Levey, A. S., Perrone, R. D., Madias, N. E. Serum creatinine and renal function. Annu. Rev. Med. 39, 465-490 (1988).
- Lorenz, J. N., Gruenstein, E. A simple, nonradioactive method for evaluating single-nephron filtration rate using FITC-inulin. Am. J. Physiol. 276, 172-177 (1999).
- Meyer, M. H., Meyer, R. A., Gray, R. W., Irwin, R. L. Picric acid methods greatly overestimate serum creatinine in mice: more accurate results with high-performance liquid chromatography. Anal. Biochem. 144 (1), 285-290 (1985).
- Qi, Z., Breyer, M. D. Measurement of glomerular filtration rate in conscious mice. Methods Mol. Biol. 466, 61-72 (2009).
- Qi, Z., Whitt, I., et al. Serial determination of glomerular filtration rate in conscious mice using FITC-inulin clearance. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 286 (3), F590-F596 (2004).
- Schock-Kusch, D., Sadick, M., et al. Transcutaneous measurement of glomerular filtration rate using FITC-sinistrin in rats. Nephrol. Dial Transplant. 24 (10), 2997-3001 (2009).
- Schock-Kusch, D., Xie, Q., et al. Transcutaneous assessment of renal function in conscious rats with a device for measuring FITC-sinistrin disappearance curves. Kidney Int. 79 (11), 1254-1258 (2011).
- Schreiber, A., Shulhevich, Y., et al. Transcutaneous measurement of renal function in conscious mice. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 303 (5), F783-F788 (2012).
- Shemesh, O., Golbetz, H., Kriss, J. P., Myers, B. D. Limitations of creatinine as a filtration marker in glomerulopathic patients. Kidney Int. 28 (5), 830-838 (1985).
- Sturgeon, C., Sam, A. D., Law, W. R. Rapid determination of glomerular filtration rate by single-bolus inulin: a comparison of estimation analyses. J. Appl. Physiol. 84 (6), 2154-2162 (1998).
- Vallon, V., Blantz, R. C., Thomson, S. Glomerular hyperfiltration and the salt paradox in early [corrected] type 1 diabetes mellitus: a tubulo-centric view. J. Am. Soc. Nephrol. 14 (2), 530-537 (2003).
- Vallon, V., Eraly, S. A., et al. A role for the organic anion transporter OAT3 in renal creatinine secretion in mice. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 302 (10), F1293-F1299 (2012).
- Vallon, V., Schroth, J., et al. Adenosine A(1) receptors determine glomerular hyperfiltration and the salt paradox in early streptozotocin diabetes mellitus. Nephron. Physiol. 111 (1), 30-38 (2009).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Anim. (NY. 40 (5), 155-160 (2011).
