Summary
من أجل دراسة التغيرات من الألياف العصبية داخل البشرة مسبب (IENFs) في اعتلال الأعصاب المؤلم (PN)، قمنا بتطوير البروتوكولات التي يمكن أن تفحص مباشرة التغيرات المورفولوجية ثلاثي الأبعاد لوحظ في IENFs مسبب. تحليل ثلاثي الأبعاد للIENFs لديه القدرة على تقييم التغيرات المورفولوجية للIENF في PN.
Abstract
A لكمة خزعة من الجلد يستخدم عادة لقياس كثافة الألياف العصبية داخل البشرة (IENFD) لتشخيص اعتلال الأعصاب الطرفية من 1،2. في الوقت الحاضر، بل هو ممارسة شائعة لجمع 3 خزعات الجلد مم من الساق البعيدة (DL) والفخذ الدانية (PT) لتقييم polyneuropathies التي تعتمد على طول 3. ومع ذلك، نظرا لطبيعة متعددة الاتجاهات من IENFs، فإنه يمثل تحديا لدراسة تداخل الهياكل العصبية من خلال تحليل ثنائي الأبعاد (2D) التصوير. بدلا من ذلك، يمكن ثلاثي الأبعاد (3D) التصوير توفر حلا أفضل لهذه المعضلة.
في التقرير الحالي، فإننا نقدم طرق لتطبيق التصوير 3D لدراسة الاعتلال العصبي المؤلم (PN). من أجل تحديد IENFs، تتم معالجة عينات الجلد لتحليل مناعي للبروتين منتج الجين 9.5 (PGP)، علامة العصبية عموم. في الوقت الحاضر، فمن الممارسة القياسية لتشخيص اعتلال الأعصاب الألياف الصغيرة باستخدام IENFD ردعتستخرجه PGP المناعية باستخدام المجهري brightfield 4. وفي الدراسة الحالية، طبقنا تحليل مناعي مزدوج لتحديد مجموع IENFD، وذلك باستخدام PGP، وIENF مسبب، من خلال استخدام الأجسام المضادة التي تعترف تروبوميوزين مستقبلات كيناز A (تورك A)، ومستقبلات تقارب السامي لعامل نمو العصب 5. مزايا IENF شارك في تلطيخ مع PGP وتورك A الأجسام المضادة تفيد دراسة PN بواسطة تلطيخ بوضوح إيجابية PGP، والألياف مسبب. يمكن قياس هذه الإشارات الفلورسنت لتحديد التغيرات المورفولوجية IENFD ومسبب من IENF المرتبطة PN. يتم الحصول على الصور الفلورسنت بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر وتجهيزها للتحليل 3D. يوفر 3D التصوير قدرات التناوب إلى مزيد من تحليل التغيرات المورفولوجية المرتبطة PN. أخذت معا، فلوري شارك في تلطيخ، والتصوير متحد البؤر، وتحليل 3D تستفيد بوضوح دراسة PN.
Introduction
في الوقت الحاضر، بل هو ممارسة شائعة للأطباء لقياس كثافة الألياف العصبية داخل البشرة، (IENFD) من الجلد الخزعات لكمة، والتي يمكن استخدامها لتشخيص اعتلال الأعصاب الألياف الصغيرة 3، 6-8. يتم أخذ خزعات من الساق البعيدة (DL)، و 10 سم فوق الكعب الوحشي، والفخذ الدانية (PT)، و 20 سم تحت العمود الفقري الحرقفي الأمامي 9. وصفت جميع IENF باستخدام بروتين منتج الجين 9.5 (PGP)، علامة العصبية عموم 10-12. في الوقت الحاضر، فمن الممارسة القياسية لتشخيص اعتلال الأعصاب الألياف الصغيرة باستخدام IENFD يحدده تلطيخ PGP مع المجهري brightfield 6. بالإضافة إلى ذلك، قد استخدمت العديد من المجموعات البحثية بروتوكولات مناعي لPGP المناعية 7-9. ويرتبط الاعتلال العصبي الألياف الصغيرة عادة مع ألم الأعصاب. من أجل زيادة فهم دور IENF ضرورية لمعالجة الألم، قمنا بتطوير تقنية للمشاركة في تسمية مجموع IENF مع الألياف التي تولد الألم. NocicepTIVE IENF، Aδ على وجه التحديد والألياف C، يمكن دراستها من خلال المشاركة في وضع العلامات من IENF مع PGP وعلامة مسبب، تروبوميوزين مستقبلات كيناز A (تورك A) 5. TRK A هو مستقبلات تقارب السامي لعامل نمو الأعصاب التي لا غنى عنها لتنمية حس الألم. وتورك A-إيجابي الألياف العصبية مسبب هي ألياف ببتيدي المفعول التي تعبر عن جوهر P (SP) والكالسيتونين الجينات ذات الصلة الببتيد (CGRP). سابقا، لوريا وزملاؤه تطبيق تقنية مزدوجة وضع العلامات لدراسة PN، وشارك في وضع العلامات IENF إيجابية PGP مع علامة مسبب 10. في دراستنا السابقة، أثبتنا أن تورك IENF A-إيجابي، ولكن ليس تورك IENF A-السلبية، وupregulated في نموذج حيواني من الاعتلال العصبي السكري مؤلمة 5. توفر هذه التقنية شارك في وضع العلامات القدرة على مقارنة الكمي للIENFD مسبب إلى إجمالي IENFD والقدرة على دراسة التغيرات المورفولوجية المرتبطة PN. القدرة على تصور IENF مسبب والمقارنةالكمي إعادة IENFD الإجمالي إلى IENFD مسبب يمكن أن توفر دليل موضوعي على وجود الألم، وربما نظرة ثاقبة من شدة الألم الذي يصاحب PN. هذه التقنية قابلة للتطبيق على الجلد من النماذج الحيوانية أيضا. بالمقارنة مع الدراسات السابقة، ويصف البروتوكول الحالي طرق لتحليل الصور 3D، وخلق فرصة لتجنب الأخطاء التي يمكن أن تحدث في تحليل الصور 2D.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جزء A: المناعية
يتم جمع وإعداد لوحة 96 جيدا والوقاية من خلفية تلطيخ لكمة خزعات الجلد من البشر والمحتضنة لمدة 12-24 ساعة في حل تثبيتي (2٪ بارافورمالدهيد مع 0.75 M حل L-يسين (الرقم الهيدروجيني 7.4) و 0.05 ملي الصوديوم بريودات) في 4 درجات مئوية كما هو موضح سابقا 8. ثم يتم cryoprotected عينات في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) مع الجلسرين 20٪ في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 في الاسبوع، جزءا لا يتجزأ في وسائل الإعلام تصاعد درجة الحرارة المثلى القطع (أكتوبر)، ثم مقطوع إلى 50 ميكرون أبواب سميكة على ناظم البرد. تم تصميم البروتوكول هو موضح أدناه للحصول على 8 أقسام الجلد، والحد الأقصى لعدد أقسام الجلد ممكن للخضوع المناعية التعويم الحر في لوحة واحدة 96-جيدا.
DAY 1:
1. الوقاية من مناعية غير محددة في الطبقة القرنية
- التسمية وحة 96 جيدا كما هو مبين في الشكل 1. إضافة 150 ميكرولتر من صورة FX-IT الإشارات (صورة-IT)، وفعالة من أجل الحيلولة دون تلوين الخلفية 11،12، في كل بئر في الصف 1 من لوحة 96 جيدا.
- إضافة 150 ميكرولتر من 1X PBS في كل بئر في الصف 2 و 3 من لوحة 96 جيدا.
- الحصول على اثنين من 50 ميكرومتر المقاطع لكل مريض: مقطع واحد من الخزعة التي اتخذت في DL، مقطع واحد من الخزعة التي اتخذت في PT. يستخدم حلقة بتلقيح (LeLoop) لنقل مقاطع من واحد شطف إلى التالي لتجنب الضرر المورفولوجية. نقل بلطف كل قسم ميكرومتر 50، وذلك باستخدام حلقة بتلقيح، إلى الفرد بشكل جيد من الصف 1، تحتوي على صورة-IT. احتضان المقاطع في صورة-IT لمدة 30 دقيقة في RT على الكرسي الهزاز مسطحة.
- شطف المقاطع مرتين مع 1X PBS (الصفوف 2 و 3) لمدة 10 دقيقة في RT. وضع لوحة جيدا على الكرسي الهزاز شقة بين يشطف.
2. إعداد 5٪ BSA عرقلة الحل و1٪ من محلول الشطف
- بينما تحتضن أقسام خزعة في صورة-IT، وإعداد 5٪ عرقلة المحاليلنشوئها (5٪ BSA، 0.3٪ TX-100، 0.1 M الحل PBS-دوامة حتى يذوب تماما BSA).
- إضافة 150 ميكرولتر من 5٪ BSA عرقلة الحل في كل بئر من الصف 4.
- باستخدام حلقة بتلقيح، ونقل المقاطع إلى الآبار الفردية من 5٪ BSA عرقلة الحل. احتضان المقاطع في 5٪ BSA عرقلة الحل لمدة 1-2 ساعة على RT على الكرسي الهزاز مسطحة.
3. إعداد 1٪ BSA الشطف الحل والتخفيف من الأجسام المضادة الأولية
- بينما تحتضن المقاطع في 5٪ BSA عرقلة الحل، وإعداد 1٪ محلول الشطف (1٪ BSA، 0.3٪ TX-100، 0.1 M الحل PBS-دوامة حتى يذوب تماما BSA).
- بينما تحتضن المقاطع في 5٪ BSA عرقلة الحل، وتمييع الأجسام المضادة الأولية في 1٪ الشطف حل.
- لمدة ثمانية أقسام (8 × 150 = 1،200 ميكرولتر ميكرولتر) هناك حاجة إلى ما مجموعه 1،200 ميكرولتر. مصنوعة من الأجسام المضادة الأولية تصل في 1،500 ميكرولتر (حوالي حجم إضافي 20٪).
- التخفيفات من الأجسام المضادة الأولية: PGP، 1:500؛ تورك A،1:500 في 1٪ BSA الشطف حل.
4. حضانة خزعات مقطوع في الأجسام المضادة الأولية
- إضافة 150 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية مخففة في الآبار المعينة من لوحة 96 جيدا (الصف 5).
- نقل أقسام من 5٪ عرقلة الحل (الصف 4) في الآبار الأجسام المضادة الأولية المعينة (الصف 5).
- ختم لوحة 96 جيدا مع parafilm ورقائق الألومنيوم لتجنب جفاف والتعرض للضوء.
- احتضان لوحة 96 جيدا O / N عند 4 درجات مئوية على الكرسي الهزاز مسطحة.
يوم 2:
5. شطف خزعات في 1٪ BSA الشطف الحل
- إضافة 150 ميكرولتر من 1٪ BSA حل الشطف في كل بئر في الصف 6، 7، و 8.
- شطف أقسام ثلاث مرات مع 1٪ BSA حل الشطف (الصفوف 6 و 7 و 8) لمدة 1 ساعة في كل مرة في RT. تغطية لوحة جيدا بورق الألمنيوم ومكان على الروك شقة بين يشطف.
6. التخفيف من الأجسام المضادة الثانوية
<OL>- لمدة ثمانية أقسام (8 × 150 = 1،200 ميكرولتر ميكرولتر) هناك حاجة إلى ما مجموعه 1،200 ميكرولتر. مصنوعة من الأجسام المضادة الثانوية في عام 1500 ميكرولتر (حوالي حجم إضافي 20٪).
- التخفيفات من الأجسام المضادة الثانوية: لPGP (فلور اليكسا 488 حمار المضادة للأرنب، 1:250)، لتورك A (فلور اليكسا 647 حمار المضادة للماعز، 1:250) في 1٪ BSA حل الشطف.
7. حضانة خزعات مقطوع في الضد الثانوية
- إضافة 150 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المخفف في الآبار المخصصة لهم من لوحة 96 جيدا (الصف 9).
- نقل أقسام من 1٪ BSA عرقلة الحل (الصف 8) إلى الأجسام المضادة الثانوية جيدا (الصف 9).
- ختم لوحة 96 جيدا مع parafilm ورقائق الألومنيوم لتجنب جفاف والتعرض للضوء.
- احتضان المقاطع في المعينة الثانوية الأجسام المضادة O/ N عند 4 درجات مئوية على الكرسي الهزاز مسطحة.
8. شطف خزعات في 1٪ BSA الشطف الحل
- إضافة 150 ميكرولتر من 1٪ BSA الشطف الحل في كل بئر في صف 10، 11، و 12.
- شطف أقسام ثلاث مرات مع 1٪ BSA حل الشطف (الصفوف 10، 11، و 12) لمدة 1 ساعة في كل مرة في RT. تغطية لوحة جيدا بورق الألمنيوم ومكان على الكرسي الهزاز شقة بين يشطف.
9. إعداد الشرائح المجهر وتركيب مقسم خزعات
- بينما تحتضن أقسام خزعة في شطف الماضي من 1٪ BSA حل الشطف (الصف 12)، وإعداد الشرائح المجهر.
- ضع 50 ميكرولتر من 1٪ BSA حل الشطف على شريحة واحدة في وقت واحد.
- إزالة أجزاء من 1٪ BSA حل الشطف (الصف 12)، ووضعه في انخفاض 50 ميكرولتر من 1٪ BSA الشطف حل على شريحة المجهر المعينة. بعد تحقيق الاستفادة المثلى من موقف من هذا الباب، إزالة الزائدة 1٪ BSA حل الشطف مع ماصة الزجاج bulbed، اتخاذ الاحتياطاتلتجنب لمس العينة.
ملاحظة: تأكد من عدم مطوية القسم أكثر، وينبغي أن تكون العينة شقة ضد سطح شريحة المجهر.
- المكان 1 قطرة من إطالة الذهب antifade تصاعد كاشف مع دابي بالقرب من الخزعة على شريحة المجهر. نلقي المجهر 22x22 ملم ساترة الزجاج ووضعه برفق فوق خزعة وقطرة من الذهب إطالة كاشف antifade مع دابي قطرة. كرر لكل قسم.
- اسمحوا الشرائح المجهر الجافة O / N في RT في الظلام.
ملاحظة: إزالة أي فقاعات الهواء باستخدام طرف ماصة. امسحي الزائد إطالة الذهب antifade كاشف.
الجزء باء: التصوير متحد البؤر
10. التصوير متحد البؤر
- إشارات مضان صورة باستخدام أوليمبوس FluoView 500 ليزر متحد البؤر المسح المجهر مع النفط الغمر (1.3 NA) هدف 40X والتكبير مرتين مع FluoView إصدار البرنامج 5.0. استخدام اليكسا فلور 488 واليكسا فلور 647 لإثارة 543 نانومتر هيليوم نيون ذو اللون الأخضر ليزر و633 نانومتر ليزر هيليوم نيون ذو الأحمر، على التوالي. يتم تمثيل اليكسا فلور 488 إشارة من نظرة الخضراء متابعة الجدول (طرفية) واليكسا فلور 647 من طرفية الأحمر.
- تعيين فتحات متحد البؤر لكل كاشف في 400 ميكرون لتعزيز الإشارات. ينبغي أن تؤخذ بالاشعة متتابعة في قرار من 1،024 X 1،024 إلى تحقيق أقصى قدر من الانفصال إشارة.
- التقاط ثلاثي الأبعاد Z-سلسلة باستخدام 1.2 ميكرومتر فترات Z-خطوة (على أساس وحدة المسح الضوئي الأمثل وتحسب على أساس البرامج FluoView) مع كالمان في المتوسط (إطارين).
جزء C: التصور ثلاثي الأبعاد والرسوم المتحركة
11. ثلاثي الأبعاد (3D) وتصور الرسوم المتحركة
- ملفات مفتوحة Fluoview في Imaris البرنامج إلى x64 (الإصدار 7.3، Bitplane AG) لتصور مجموعات صورة 3D.
- ضبط عرض حسب الحاجة لتعزيز النقيض من إشارة محددة العصب.
- إنشاء سوrface لتصور الحدود الجلدي-البشرة. استخدام أداة كونتور في وضع التعادل لرسم الحدود.
- تعيين سطح شبه شفافة على الحدود من أجل أن نرى إشارات الفلورسنت الكامنة.
- التقاط الصور الثابتة من الإشارات الفلورسنت 3D لخلق صور لقطة من فيلم 3D.
- استخدام ميزة الرسوم المتحركة لإنشاء فيلم 3D. الصور يمكن أن تكون استدارة 360 درجة عدة مرات لاظهار كل إشارة على حدة والمدمجة (أرقام 2 و 3 و 4). ضبط الرسوم المتحركة لخلق أفلام تتكون من 200 إطارات الرسوم المتحركة في 15 لقطة في الثانية الواحدة. حفظ كل فيلم كملف AVI الخام.
- ضغط الفيلم AVI النهائي مع برنامج فيرتوالدوب (الإصدار 1.9.4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
طبقنا البروتوكول الحالي لدراسة مورفولوجية IENF في PT وDL خزعات الجلد من المرضى الذين يعانون من PN. الجلد، من ثلاث مواد، تم جمعها في جامعة ولاية يوتا لإثبات المورفولوجيا المرضية المرتبطة PN. الموضوعات ما يلي: حالة 1: الذكور 51 عاما مع تاريخ من PN من مرض السكري من النوع 2 (المدة: 14 شهرا؛ درجة الألم: 51)؛ الحالة 2: رجل يبلغ من العمر 56 سنة ولها تاريخ من PN مرض السكري من النوع 2 (المدة: 108 شهرا؛ درجة الألم: 47)، والحالة 3: رجل 66 عاما مع تاريخ من PN من مرض السكري من النوع 2 (المدة: 42 شهرا؛ درجة الألم: 46). أجريت التاريخ العصبية والفحص، بما في ذلك الاختبار الحسي الكمي ودراسات التوصيل العصبي، لتقييم اعتلال الأعصاب المحيطية. تم تحديد درجات الألم على أساس البصرية مقياس الألم التناظرية 0-100.
باستخدام هذا البروتوكول، ونحن قادرون على دراسة هيكل 3D من IENFs في الجلد البشري (الشكل 2). في الشكل 2 (الشكل 3). التصوير 3D من تورمات محور عصبي، المعروضة في الشكل (3)، يدل على أن هذه هي هياكل تورمات كروية موزعة على طول IENFs. وبالإضافة إلى ذلك، وهذه الأساليب يمكن استخدامها لدراسة المتفرعة في IENFs (الشكل 4). شرح صور 3D المتفرعة المعروضة في الشكل (4) أن التغيرات المورفولوجية تجري مع وجود PN. كما هو موضح سابقا، تم تحديد الحدود عن طريق الجلد، البشرة يعتمد على التشكل وتوجيه الأعصاب والفرق كثافة بكسل بين الأدمة والبشرة 8. البحث عن المفقودين الأزرق، هو مبين في الشكلين 2 و 3 و 4، يشير إلى تقاطع طريق الجلد-البشرة.
الشكل 1. الرسم التخطيطي يمثل الإعداد لوحة 96 جيدا للبشرة خزعة المناعية.
الشكل 2. ثلاثي الأبعاد الصور (3D) من IENF. صورة 3D ممثل (A) IENF PGP إيجابية، وصفت الخضراء، تمثل مجموع IENF (الأول 360 درجة دوران) و (B) تورك IENF A إيجابية، وصفت الأحمر، التي تمثل IENF مسبب (360 درجة دوران الثانية)، و (C ) صورة المدمجة يتظاهرون إيجابية PGP، IENF مسبب (360 درجة دوران الثالث) في عينة من الجلد من حالة 1. بار = 20 ميكرومتر. اضغط هنا لمشاهدة الفيلم.
الشكل3. ثلاثي الأبعاد (3D) صورة تورمات محور عصبي في IENF من PN. صورة 3D ممثل تورمات محور عصبي (النصال) جنبا إلى جنب IENFs، وصفت من قبل PGP مع إشارة خضراء، وضمن الضفيرة تحت الجلد في عينة الجلد من حالة 2. بار = 10 ميكرومتر. اضغط هنا لمشاهدة الفيلم.
الشكل 4. ثلاثي الأبعاد (3D) صورة من محور عصبي المتفرعة في IENF من PN. صورة الممثل 3D المتفرعة محور عصبي (النصال) جنبا إلى جنب IENFs، وصفت من قبل PGP مع إشارة خضراء، في عينة من الجلد من حالة 3. بار = 20 ميكرومتر. اضغط هنا لمشاهدة الفيلم.
| مكونات من 5٪ BSA عرقلة الحل: | المبلغ اللازم ل12.5 مل |
| 1X PBS | 8.125 مل |
| 0.1٪ تريتون X-100 (TX-100) [تركيز النهائي: 0.03٪] | 3.75 مل |
| ألبومين المصل البقري (BSA) | 0.625 ز |
| المجموع | 12.5 مل |
الجدول 1. 5٪ BSA عرقلة الحل.
| مكونات من 1٪ الشطف الحل: | المبلغ اللازم ل12 مل |
| 1X PBS | 8.625 مل |
| 0.1٪ TX-100 [تركيز النهائي: 0.03٪] | 3.25 مل |
| ألبومين المصل البقري (BSA) | 0.125 ز |
| المجموع | 12 مل |
الجدول 2. 1٪ BSA عرقلة الحل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
قياس IENFD وقد استخدم على نطاق واسع لتحديد درجة من اعتلال الأعصاب المحيطية 13،14. في الوقت الحاضر، والبروتوكول الأكثر استخداما يقيس فقط كثافة من الألياف العصبية التي تخترق الغشاء القاعدي في البشرة، وهي لا تأخذ بعين الاعتبار المحاور المتفرعة و / أو التغيرات المورفولوجية للأعصاب. وبالإضافة إلى ذلك، لم يظهر تحليل IENFD الحالية لربط IENFD مع وجود ألم في PN 15.
نحن ذكرت سابقا أن زيادة أعداد IENFD مسبب ترتبط مع السلوكيات الألم في DB / DB الفئران، نموذج الفأر من مرض السكري من النوع 2 5. في ذلك التقرير، ونحن أول تطبيق بروتوكول مناعي مزدوج لدراسة IENF مسبب. وفي الدراسة الحالية، ونحن توسيع بروتوكول لدينا لجلد الإنسان من المرضى الذين يعانون من PN. يوفر تحليل مناعي مزدوج قياسات كلا IENF المشاركات وIENF مسبب، مجموعة فرعية من IENFs التي تتوسطألم. هذه IENF مسبب هي في معظمها إيجابية للتورك ألف ونيوروببتيد مسبب الأخرى 5. وقد وصفت مماثلة تحليل مناعي مزدوجة لاعتلال الأعصاب المؤلم من قبل لوريا وزملاؤه 10. وذكرت أنها خفضت IENFD لمستقبلات عابرة المحتملة الموجبة قناة فصيلة عضو V 1 (TRPV1) في المرضى الذين يعانون من اعتلال الأعصاب المؤلم. بروتوكول الحالية يمكن أن توفر نهجا بديلا لقياس IENFD مسبب بناءا على بيانات حيوانية لدينا 5.
ويقدم البروتوكول الحالي نهجا 3D لدراسة بنية IENF. في تركيبة مع تحليل immunofluorecent مزدوجة، والبروتوكول الحالي توفر أساليب لدراسة مورفولوجية IENFs مسبب. لم تبلغ دراسات سابقة وجود علاقة بين كثافة أو المتفرعة من IENF مسبب مع PN. هنا، علينا أن نبرهن على بروتوكول لدراسة المحاور المتفرعة وتورم في IENFs من جلد الإنسان. يشير تحليلنا 3D أن هذا مethod يمكن استخدامها لدراسة التغيرات المورفولوجية للIENF في PN. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن 3D التصوير تحسين البروتوكولات الحالية من قياس IENFD عن طريق تجنب الأخطاء التي ترتبط مع انخفاض التصور من الهياكل المتداخلة المرتبطة 2D التصوير.
يتم تعريف تورم محور عصبي وتوسيعا لجزء المحاور التي يبلغ قطرها أكبر من مرتين أن من عيار محور عصبي الأصلي 16. هذه البنية يحتوي على أجزاء من الهيكل الخلوي محور عصبي ومكونات النقل محور عصبي. يعتبر تورم محور عصبي ميزة في وقت مبكر من الاعتلال العصبي محور عصبي 6،16،17. ومع ذلك، لم يتم الإبلاغ تحليل 3D هياكل تورم محور عصبي في الأدب. كما هو مبين في الشكل (3)، يمكن التصوير 3D تقديم رؤية هامة لتورم محور عصبي يرتبط مع PN.
ويتميز جيدا أن المتفرعة محور عصبي يرافق التعافي من إصابة العصب 18. ومع ذلك، فإنلا يزال محدودا يعتمد المنهجية المتاحة لقياس المتفرعة محور عصبي في التصوير 2D. كما هو موضح في الشكل (4)، المتفرعة محور عصبي يمكن أن تكون معقدة بسبب طبيعة ملتوية للأعصاب تجديد. ونتيجة لذلك، يمكن أن تحجب النقاط المتفرعة بواسطة الألياف العصبية القريبة يؤثر على دقة القياس الكمي. تحليل التصوير 3D من بروتوكول لدينا يوفر تحسين التصور للحصول على تفاصيل من الأعصاب المتفرعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
أي تضارب في المصالح لتعلن.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح K08-01A2 NS061039، وبرنامج الأمراض العصبية بحوث واكتشاف، وألف توبمان معهد ألفريد بحوث الطبية في جامعة ميشيغان. يستخدم هذا العمل مورفولوجية وصورة التحليل الأساسي للميشيغان أبحاث السكري ومركز التدريب، بتمويل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح 5P90 DK-20572 من المعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى. فإن الكتاب أود أن أشكر روبنسون سينغلتون وغوردون سميث (جامعة يوتا) للتبرع السخي من عينات الجلد البشري لدعم التطوير الأولي للمسبب العلامات البيولوجية تقنية المناعية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | To make up 1X PBS |
| Image-IT FX Signal | Invitrogen | I36933 | Image-IT |
| Protein Gene Product 9.5 (Polyclonal rabbit) | AbD Serotec | 7863-0504 | PGP |
| Tropomyosin Related-Kinase A (Polyclonal goat) | R&D Systems | AF1056 | Trk A |
| Alexa Fluor 488 donkey α-rabbit | Invitrogen | A21206 | AF488 donkey α-goat |
| Alexa Fluor 647 donkey α-goat | Invitrogen | A21447 | AF647 donkey α-goat |
| Albumin, from Bovine Serum | Sigma-Aldrich | A7906-100 | BSA |
| Triton X- 100 | Sigma-Aldrich | T9284 | TX-100 |
| Non-calibrated Loop | LeLoop | MP 199025 | inoculating Loop |
| 96-well assay plate | Corning Incorporated | 3603 | Well plate |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | DAPI |
| Microscope Cover Glass 22x22 mm | Fisher Scientific | 12-541-B | Coverslips |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | Microscope Slides |
| Olympus Fluoview Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | FV500 | Confocal Microscope |
| Optimum Cutting Temperature | Sakura | 4583 | OCT |
| Leica cryostat | Leica | CM1850 | Cryostat |
References
- Lauria, G., Holland, N., et al. Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy. J. Neurol. Sci. 164 (2), 172-178 (1999).
- Sullivan, K. A., Hayes, J. M., et al.
- McArthur, J. C., Stocks, E. A., Hauer, P., Cornblath, D. R., Griffin, J. W. Epidermal nerve fiber density: normative reference range and diagnostic efficiency. Arch. Neurol. 55 (12), 1513-1520 (1998).
- Griffin, J. W., McArthur, J. C., Polydefkis, M. Assessment of cutaneous innervation by skin biopsies. Curr. Opin. Neurol. 14 (5), 655-659 (2001).
- Cheng, H. T., Dauch, J. R., Hayes, J. M., Yanik, B. M., Feldman, E. L. Nerve growth factor/p38 signaling increases intraepidermal nerve fiber densities in painful neuropathy of type 2 diabetes. Neurobiol. Dis. 45 (1), 280-287 (2012).
- Lauria, G., Lombardi, R., Camozzi, F., Devigili, G. Skin biopsy for the diagnosis of peripheral neuropathy. Histopathology. 54 (3), 273-285 (2009).
- Vlckova-Moravcova, E., Bednarik, J., Dusek, L., Toyka, K. V., Sommer, C. Diagnostic validity of epidermal nerve fiber densities in painful sensory neuropathies. Muscle Nerve. 37 (1), 50-60 (2008).
- Casanova-Molla, J., Morales, M., et al. Axonal fluorescence quantitation provides a new approach to assess cutaneous innervation. J. Neurosci. Methods. 200 (2), 190-198 (2011).
- Wang, L., Hilliges, M., Jernberg, T., Wiegleb-Edstrom, D., Johansson, O. Protein gene product 9.5-immunoreactive nerve fibres and cells in human skin. Cell Tissue Res. 261 (1), 25-33 (1990).
- Lauria, G., Morbin, M., et al. Expression of capsaicin receptor immunoreactivity in human peripheral nervous system and in painful neuropathies. J. Peripher. Nerv. Syst. 11 (3), 262-271 (2006).
- Penna, G., Fibbi, B., et al. Human benign prostatic hyperplasia stromal cells as inducers and targets of chronic immuno-mediated inflammation. J. Immunol. 182 (7), 4056-4064 (2009).
- Lentz, S. I., Edwards, J. L., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro. J. Histochem. Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).
- Polydefkis, M., Hauer, P., Griffin, J. W., McArthur, J. C. Skin biopsy as a tool to assess distal small fiber innervation in diabetic neuropathy. Diabetes Technol. Ther. 3 (1), 23-28 (2001).
- Lauria, G.
- Sorensen, L., Molyneaux, L., Yue, D. K. The relationship among pain, sensory loss, and small nerve fibers in diabetes. Diabetes Care. 29 (4), 883-887 (2006).
- Lauria, G., Morbin, M., et al. Axonal swellings predict the degeneration of epidermal nerve fibers in painful neuropathies. Neurology. 61 (5), 631-636 (2003).
- Herrmann, D. N., McDermott, M. P., et al. Epidermal nerve fiber density, axonal swellings and QST as predictors of HIV distal sensory neuropathy. Muscle Nerve. 29 (3), 420-427 (2004).
- Navarro, X. Chapter 27: Neural plasticity after nerve injury and regeneration. Int. Rev. Neurobiol. 87, 483-505 (2009).
