Summary
עיצבנו bioreactor טעינה מכאני רומן שניתן להחיל מאמץ מכאני uniaxial או biaxial לbiocomposite סחוס לפני ההשתלה לתוך פגם סחוס במפרק.
Abstract
עיצבנו מכשיר טוען כי הוא מסוגל ליישם מתח מכאני uniaxial או biaxial לרקמה מהונדס biocomposites המפוברקת להשתלה. בעוד המכשיר בעיקר מתפקד כbioreactor המחקה את הזנים המקומיים מכאניים, הוא גם לבוש עם תא עומס על מתן משוב בכוח או בבדיקות מכאנית של המבנים. נושאי המכשיר מתוכננים מבני סחוס לטעינה מכאנית biaxial בדיוק רבים של מינון העמסה (משרעת ותדירות) והוא קומפקטי מספיק כדי להתאים בתוך תרבות תקן רקמות חממה. הוא טוען דגימות ישירות בצלחת תרבית רקמה, וגדלי צלחת מרובים בקנה אחד עם המערכת. המכשיר תוכנן תוך שימוש ברכיבים שיוצרו עבור יישומי לייזר מונחים מדויק. טעינה דו צירית מושגת על ידי שני שלבים מאונך. יש שלבי טווח נסיעה 50 מ"מ ומונעים באופן עצמאי על ידי מפעילים stepper מנוע, הנשלטים על ידינהג לולאה סגורה מנוע צעד שכולל יכולות מיקרו דריכה, מה שמאפשר גדלי צעד של פחות מ -50 ננומטר. Polysulfone טעינת Platen הוא מצמידים את הפלטפורמה נעה דו צירית. תנועות של השלבים נשלטות על ידי Thor-מעבדות טכנולוגיית מיקום מתקדמת (APT) תוכנה. נהג מנוע צעד נעשה שימוש בתוכנה כדי להתאים את הפרמטרים של עומס תדר לבין המשרעת של שניהם גזירה ודחיסה באופן עצמאי ובו זמנית. לפי מיקום משוב מסופק על ידי אנקודרים אופטיים ליניארי שיש להם הדירות דו כיוונית של 0.1 מיקרומטר ורזולוציה של 20 ננומטר, תרגום לדיוק מיקום של פחות מ -3 מיקרומטר מעל 50 מ"מ המלא של נסיעה. מקודדים אלה מספקים משוב העמדה ההכרחי לאלקטרוניקת הכונן כדי להבטיח את יכולות nanopositioning אמיתיות. על מנת לספק משוב כוח כדי לזהות ולהעריך את תגובות פנה טעינה, תא מטען זעיר דיוק ממוקם בין משטח הסריקה וטעינת Movinפלטפורמה גרם. יש תא עומס דיוקים גבוהים של 0.15% עד 0.25% בהיקף מלא.
Introduction
יש לנו תוכנן bioreactor טוען כי הוא מסוגל ליישם מתח מכאני uniaxial או biaxial לרקמה מהונדס biocomposites המפוברקת להשתלה. מכשיר זה נועד בעיקר כמחליפים לbioreactor מהונדסים לסחוס במפרק, זה יכול לשמש גם לרקמות עומס נושאות אחרות בגוף האדם. המוטיבציה שלנו בעיצוב bioreactor זה נובע מדרכמן ו1 סוקולוף, שעשה את התצפית המכוננת של היווצרות לא תקינה של סחוס במפרק בעובר חומוס משותק בשל היעדר התנועה. כמו כן, פעילות גופנית היא חיונית להתפתחותו של שריר ועצם נורמלי. בקנה אחד עם תפיסה זו, קבוצות מחקר רבות חקרו כיצד מצבים של גירויים פיסיים שונים במהלך בטיפוח מבחנת מודולציה את התכונות הביוכימיות ומכאניות של תאים ביולוגי biocomposites וexplants רקמות 2-7. הרעיון של הנדסת רקמות פונקציונליתכרוך בשימוש במבחנה של גירויים מכאניים כדי לשפר את התכונות הפונקציונליות של רקמות, כלומר את התכונות מכאניות המאפשרות הרקמה לעמוד בלחץ צפוי vivo ומתח 8,9. מחקרים רבים מדווחים על הטעינה מכאני שימוש במונחים של גזירה ודחיסה כדי לעורר מבני סחוס מהונדסים למפרקים במפרק. Mauck et al. 10 מצביע על כך שטעינה מכאנית לבדו יכולה לגרום לchondrogenesis של תאי גזע mesenchymal גם בהעדרם של גורמי גדילה שנחשבים חיונית. יישום של טעינה לסירוגין מכאנית כגון דחיסה או גזירה במהלך עיבוד רקמה הוכח לווסת את הסחוס והיווצרות עצם, לעומת זאת dosimetry האופטימלי של טעינה שונה עם תא ותכונות רקמות 11.
התפקיד החשוב ביותר של סחוס במפרק הוא היכולת לעמוד בכוחות דחיסה וגזירה בתוךמשותף, ולכן זה צריך להיות לחיצה גבוהה וmoduli גזירה. חוסר החוזק מכאני פונקציונלי והפיזיולוגי ultrastructure בסחוס מהונדס הביא פירוט על הניאו סחוס in vivo והכישלון של אסטרטגיות להחלפת סחוס במפרקים. למרות דחיסה והגזירה הוכחו כלל כדי לווסת ולשפר את החוזק מכאני של biocomposites סחוס במפרק, גישת שילוב היא 6,12-15 נדירים. Wartella וויין 16 נועדו bioreactor שהוחל מתח ודחיסה לייצר תחליפי סחוס meniscal. ולדמן ואח'. -15 תוכננו מכשיר להחיל דחיסה וגזירה לכונדרוציטים בתרבית במצע polyphosphate סיד נקבובי. ביאן ואח'. -17 הפגין תכונות מכאניות מתאימות לסחוס מקורי עם הגידול במבחנה של כונדרוציטים כלבי בוגרים בהג'לי וביישום של biaxial mechטעינת anical (טעינת טעינה וזזת deformational דחיסה קשר).
Bioreactor הטעינה מכאני biaxial תוכנן במקור על ידי דניאל צ ב המעבדה שלנו עם המטרה הכללית כדי לגרום הסתגלויות מורפולוגיות סחוס הנדסה רקמות בונה כתוצאה מmoduli דחיסה והגזירה גבוהה יותר מאשר 18 זמינים כרגע. אנו מאמינים כי מחקר זה יגדיל באופן משמעותי את ההבנה הרחבה יותר שלנו לאופן שmechanotransduction יכול להיות מווסת להנדס קליני רקמות רלוונטיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. עיצוב Bioreactor טוען biaxial
- Bioreactor מעסיק שני שלבים שיוצרו על ידי Thor-Labs (ניוטון, MA) ליישומי לייזר מונחים מדויק ליישום מתח מכאני uniaxial או biaxial לרקמות מהונדסות, בדיוק רבים של מינון העמסה (משרעת ותדירות) ויישום למגוון רחב של תנאי תרבית רקמה מאחת עד 24 צלחות היטב (איור 1).
- טעינה דו צירית מושגת על ידי שני שלבי TravelMax (LNR50SE). שלבים אלה רכובים orthogonally בתצורת XZ. השלב האופקי מספק תנועות גז דינמיות על ידי נדנוד לאורך ציר ה-X. שלב העמסה האנכי מספק דחיסה דינמית על ידי נדנוד לאורך ציר ה-Z. יש שלבים אלה טווח נסיעה 50 מ"מ ומונעים עצמאי על ידי מפעילים מנוע צעד (DRV014), הנשלטים על ידי נהג רכב לולאה סגורה צעד (BSC102) שמציע יכולות מיקרו דריכה, המאפשרים גדלי צעד של פחות מ50 ננומטר.
- המכשיר הוא רכוב על 25 ס"מ x 30 ס"מ נוקשים x 12.5 מ"מ צלחת בסיס אלומיניום המשמשת כפלטפורמה להרכבה של רכיבים המכונה ולהרכבה של צלחות תרבית רקמה. תחנות kinematic מתכוונן המשמשות לנעילת צלחות תרבית רקמה במקום על צלחת בסיס האלומיניום. יש תחנות kinematic אלה ברגי התאמה עדינות, כדי לאפשר תיאום מדויק שהוא לא אחרת השגה על ידי יד. העיצוב המודולרי של פלטת הבסיס מאפשר מיקום גמיש של תחנות kinematic אלה כדי להתאים צלחות בגדלים וצורות (לעומת צלחות פטרי צלחות רב גם) שונים.
- אישית מכונת polysulfone טעינת Platen הוא מצמידים את הפלטפורמה נעה דו צירית באמצעות סוגר זווית נכון דיוק במכונה. חומר Polysulfone נבחר בשל biocompatibility, קלות עיבוד שבבי, וקלות העיקור.
- תנועות של השלבים נשלטות על ידי "Thor-מעבדות טכנולוגיה מיקום מתקדמת (APT) תוכנה. נהג מנוע צעד הואאד בשילוב עם התוכנה המאפשרת התאמה של פרמטרים עומס של תדירות והמשרעת של שניהם גזירה ודחיסה באופן עצמאי ובו זמנית.
- משוב positional מסופק על ידי אנקודרים אופטיים ליניאריים המחוברים זה לזה פלטפורמה מרגשת ומשולבים עם התוכנה. מערכת המקודד יש הדירות דו כיוונית של 0.1 מיקרומטר ורזולוציה של 20 ננומטר, תרגום לדיוק מיקום של פחות מ -3 מיקרומטר במהלך 50 מ"מ המלא של נסיעה. מקודדים אלה מספקים משוב העמדה ההכרחי לאלקטרוניקת הכונן כדי להבטיח את היכולות אמיתיות וnanopositioning readout ישיר של המיקום המוחלט.
- על מנת לספק משוב כוח הדרוש לגילוי קשר בין Platen ודגימות ולהעריך את תגובות, העמסת תא מטען זעיר דיוק (Honeywell דגם 31) ממוקם בין הטעינה Platen והפלטפורמה נעה (איור 2). יש תא עומס דיוקים גבוהים של0.15% עד 0.25% בהיקף מלא. יחידת התצוגה (SC500) לתא המטען גם יכולה לספק מדידות עומס של עד 5 ספרות אחרי נקודה עשרוניות. בנוסף, יש לו יציאת RS-232 כדי לאפשר לאיסוף נתונים במחשב.
2. בונה agarose תא זורעים
- הכן 4% agarose: הוסף 0.8 גרם agarose עד 20 מ"ל DMEM (ללא תוספים) בבקבוק 50 מ"ל, רתיחה, ולאחר מכן לשמור על 70 מעלות צלזיוס עד לשימוש בתנור.
- להתאים את עוצמת קול של השעיה תא לכמות כפולה של הצפיפות הרצויה זריעת התאים. השעיה זה מעורבב עם נפח שווה של 4% w / v agarose ליצור 2% ג'ל agarose בצפיפות הזריעה הרצויה.
- מקם את שתי ההשעיה תא ואחד פיפטה 10 מ"ל בחממה.
- להגדיר את מערכת ליהוק ג'ל. צריכה לשים אחד 1.5 מ"מ ואחד 0.75 מ"מ צלחת spacer יחד כדי ליצור ג'ל סמיך 2.25 מ"מ. צלחות spacer גודל אחרות עשויות לשמש ליצירת ג'ל בעוביים שונה. מערכת ליהוק ג'ל היא לא גדולה מספיק כדי להכיל אלה toget הצלחותשלה, ולכן הם חייבים להיות מודבקים היטב כדי למנוע דליפה.
- השלב הבא הוא לערבב במהירות את ההשעיה התא עם agarose הכינה בעבר וטפטף לתוך תבנית ג'ל לפני agarose מתמצק. הסר את agarose הנוזלי מהתנור ומניח את מדחום סטרילי בו. Agarose חייבת להתקרר ל42-43 מעלות צלזיוס לפני הערבוב עם תאים. לחמם את ההשעיה התא עד 37 ° C. לאחר agarose להיטי 43 מעלות צלזיוס, פיפטה במהירות את הכמות הרצויה ולאחר מכן פיפטה מייד ההשעיה התא למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לערבב. אז פיפטה את התערובת כולה באופן מיידי לתוך תבנית ג'ל.
- לאפשר ג'ל לחזק למשך 10-15 דקות ולאחר מכן להטות אותו בזהירות למצב אופקי.
- הסר את צלחת הזכוכית העליונה ודיסקי אגרוף עם אגרוף הביופסיה. ניתן לאסוף דיסקים עם מרית סטרילי קטנה. מניסיוננו, ג'ל מ"ל 9 היה גדול מספיק כדי לגרום ליותר ממאה דיסקים 5 מ"מ בקוטר.
3. התרבות של דיסקים
4. חוסר תנועה של דוגמאות לטעינה מכאנית
- הכן 4% agarose (הוסיפה שום השעיה תא) וג'ל צריך להיות רזה יותר הדגימות עצמם (כדי למנוע הפרעות במהלך טעינה). העובי המומלץ הוא 1.5-1.9 מ"מ (2.25 לדגימות עבות מ"מ).
- ברגע שgelled, דיסקים בקוטר 16 מ"מ לאגרוף 24 צלחות היטב. בכל דיסק, חור מ"מ אגרוף אחד 5 למדגם כדי להיות ממוקם בו אם ירצה, אגרוף עוד חור 5 מ"מ בקצה הדיסק לפיפטה כדי להיות ממוקמים בשינויים בתקשורת.
- ברגע שagarose בארות נעשו, מקום בצלחת 24 היטב, כפי שמוצגות באיור 3.
- ברגע W agaroseאמות נמצאות בצלחת גם 24, לחץ להתאים דגימות בכל טוב. המדגם צריך לבלוט מהחלק העליון של באר agarose.
5. טעינה מכאנית
- לעקר Platen (איור 2).
- לאבטח את צלחת אלומיניום כדי לטעון תא. Secure טעינת Platen / הרכבה צלחת תא / אלומיניום עומס לבמה.
- הפעל מנוע צעד הבקר (מתג בגב).
- הפעל מחשב ותכנית פתוחה "APT משתמש" (איור 4).
- מסך אופקי שמאלי שולט מנוע צעד. מסך ימני שולט אנכי מנוע צעד. בכל מסך, כרטיסיית "גרפית בקרה" מאפשרת מיקום ידני וכרטיסייה "העברה ברצף" מאפשרת לאוטומציה. כל יחידות מ"מ.
- עבור לכרטיסיית "גרפית שליטה" על שני המסכים ולחץ על כפתור "בית / זירו". לשניהם מנועי צעד טווח של 50 מ"מ. לחיצה על "דף הבית / זירו" תשלח את שניהם מנועי צעד למצב אפס (העליונות ימניים ורוב המשרות).
- Preparדואר הדגימות בצלחת גם 24 לטעינה על ידי הסרת חלק מאמצעי תקשורת מכל טוב. לא יותר מ 1 מ"ל של תקשורת יש להשאיר בכל טוב על מנת למנוע הצפה בזמן הטעינה. להיות בטוח שתקשורת מספיק שנשאר בבאר כדי לשמור על המדגם מכוסה.
- שימו לב שהחממה נשמרת בתנאי לחות נמוכה כדי למנוע כישלון מכשיר.
- צלחת מקום 24 גם בbioreactor ושורת זהירות עם המסגרת.
- הצלחת מאובטחת לbioreactor באמצעות ארבעה איתור kinematic מתכווננות. כדי לעשות את זה יותר קל להסתדר בשורה Platen, שני איתור השמאל כבר מראש את מיקומו. הדקו את שני איתור הנכון, כך שהצלחת היא מאובטחת. ודא בשורה צלחת הסומק עם החלק הקדמי של בסיס bioreactor.
- ב כרטיסייה "גרפית שליטה", עמדת מנוע צעד מסוימת יכולה להיות מוזן באופן ידני על ידי לחיצה על תיבת המיקום. להשתמש ביכולת זו כדי להוריד לאט Platen ולהעביר אותו בצורה אופקית כדי ליישר קו עם צלחת. </ Ol>
- ברגע שהוא קרוב לפלטון, שבאו במגע עם דגימות, להתחיל להביא את גליל דיו במרווחים איטיים מאוד (0.1 מ"מ) עד שתגיעו למצב ההתחלתי שנקבע מראש (ראה חלק 6).
- ברגע שהוא הגיע למצב ההתחלתי, ללכת "זוז ברצף" כרטיסייה ולטעון את רצף המהלך הרצוי על ידי לחיצה על "טען." לאחר מכן לחץ על "הפעל" כדי להתחיל. (איור 5) ראה חלק 7. כתיבת פרוטוקול מינון.
- בסיום טעינה, באופן ידני להעלות את המסגרת. אם כל דגימות תקועות לPlaten, בזהירות החזיר אותם למתאים היטב בעזרת מרית סטרילי.
- הסר את הצלחת גם 24 מbioreactor ולהחליף את התקשורת.
- מוציא בזהירות את גליל הדיו מתא המטען ולאחר מכן לכבות את המכשירים.
6. כיול Platen טוען
כדי להבטיח שהזנים המתאימים מוחלים לדגימות, כל Platen חייב להיות מכויל היטב לפני תחילת ניסוי.
- באופן ידני לשים אופקי מנוע צעד בעמדת 25 מ"מ.
- Platen נמוך יותר בזהירות, עד שבקושי בא במגע עם הבסיס של bioreactor. תא עומס יציג עומסים מוגברים בשלב זה. שימו לב למיקומו של מנוע צעד האנכי (לדייק ככל האפשר, כפי שכל מידות זן הדחיסה תחושב משווי זה) המדויק.
- להקליט את המיקום. ערך זה ישמש לכתיבת פרוטוקול מינון המבוסס על ממדי מדגם והלחצים רצויים.
7. כתיבת פרוטוקול מינון
- Bioreactor הוא מסוגל ליישם מתח גם לחיצה וגזירה, או בו זמנית או בנפרד. שלושה פרמטרים עיקריים צריכים להיות מוכרעים: מתח, משרעת מתח דינמי דחיסה טרה, וטעינה של תדר.
- זן טרה מיושם על מנת למנוע שיגור של Platen מן המדגם.
- משרעת מתח דינמית מדגם וטעינת freתדירות שנבחרו.
במחקר זה אנו מגדירים את לחץ דחיסה וגזירה כדלקמן: 
פרוטוקול מינון Biaxial דוגמה
עובי מדגם: 2.25 מ"מ
טרה זנים (דחיסה): 10% מעובי המדגם (0.225 מ"מ)
משרעת מתח דינמי (דחיסה): 10% (+ / - 5% מעובי המדגם)
תדר (דחיסה): 1 הרץ
משרעת דינמי זנים (גזירה): 25% מעובי המדגם (0.5625 מ"מ): מאמץ גזירה היא
פנה למדגם על ידי Platen נע בצורה אופקית.
תדר (גזירה): 0.5 הרץ
פרוטוקול מינון אופייני הוא 3 שעות של טעינה ליום.
בדוגמה זו, טעינה דינמית וגזירה מיושמת בו זמנית ולא ברצף. אנו מאמינים MIM דפוס זה טוב יותרICS סביבת הטעינה המורכבת בברך האנושית.
- ברגע שפרוטוקול מינון כבר נבחר, חייבת להיות כתובה בתכנית רצף מהלך דחיסה.
- רצף המהלך הוא בדיוק מה שזה נשמע, רשימה של תפקידים שמנוע צעד יעבור בתאוצה ומהירות המרבית שצוינה.
- לחשב עמדות רצויות אנכיות המבוססות על מינון הפרוטוקול וערך כיול Platen (מחלק 6).
- חישובי דוגמה ל1 Platen מובאים בהמשך:
| הבדל בין ערך כיול | מיקום אנכי | |
| ערך כיול Platen (תחתון נגיעות של bioreactor) | 0 מ"מ | 29.7700 מ"מ |
| פלטון, יוצר קשר עם מדגם (מדגם מ"מ 2.25) | 4.4140 מ"מ | 25.3560 מ"מ |
| סנטגשם (5% עובי) | 4.3015 מ"מ | 25.4705 מ"מ |
| זן (10% עובי) | 4.1890 מ"מ | 25.5810 מ"מ |
| זן (15% עובי) | 4.0765 מ"מ | 25.6955 מ"מ |
- ברגע שעמדות מחושבות, ניסוי עם ההאצה וערכי מהירות מרביות כדי לקבל את התדר הנכון. מספר המחזורים יש לבחור, בהתאם (10,800 מחזורים למשל עבור 3 שעות ב 1 הרץ).
- תכנית לדוגמה דינמית דחיסת העבר רצף (10% טרה דחיסה, 10% משרעת מתח דינמי, 1 הרץ) (איור 5)
- תכנית רצף מהלך גזירה דינמית: מספר המחזורים יש לבחור בהתאם לתדירות ומשך הרצויים (לדוגמה: 5400 מחזורים עבור 3 שעות ב 0.5 הרץ).
- תכנית לדוגמא דינמית שאר העבר רצף (טרה 10% דחיסה, 0.5625 מ"מ (25% מהעובי) משרעת מתח גזירה דינמית, 0.5הרץ) (איור 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
המכשיר נבדק על ידי שימוש agarose ג'לי זורע עם 20 מיליון תאים / מ"ל chondrocytes וטיפח בנוכחות uniaxial (דחיסה) או biaxial (דחיסה וגזירה) טעינה מכאנית. כונדרוציטים חזיריים עיקריים היו מבודדים מהסחוס במפרק של 2-4 חזירי בן חודש. קוטר 5 מ"מ ו1.5 דגימות עבות מ"מ היו בתרבית ב2 מ"ל של מדיום תרבות chondrogenic מוגדר (גבוהה גלוקוז DMEM, + Premix 1%, 100 U / ml פניצילין, סטרפטומיצין מיקרוגרם / מ"ל 100, 2 מ"מ L-גלוטמין, 2.5 מיקרוגרם / מ"ל amphotericin B, 50 מיקרוגרם / מיליליטר חומצה אסקורבית, 0.1 חומצות אמינו חיוניות מ"מ (NEAA), 0.4 מ"מ פרולין,) ב24 גם צלחות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. 10 דקסמטזון ז -7 ו10 ng / ml TGF-β1 סופקו במשך 10 הימים הראשונים של התרבות. הדגימות הועמסו על 3 שעות / יום בין 10-30 ימים. טעינת uniaxial כללה 10% המשרעת שיא לשיא דחיסה, 1 הרץ וטעינת biaxial כללו 0.15 מ"מ (10% עובי) דחיסה ו0.075המשרעת מ"מ גזירת שיא לשיא, הרץ 1. משרעת המתח הדינמית ותדירות טעינה נבחרת מבוססים על מחקרים שפורסמו 17,19. בסוף 30 ימים תכונות ביוכימיות ומכניות של סחוס מהונדס הוערכו.
מחקר זה העסיק שלוש קבוצות: 1 - בקרה אין טעינה, 2 - טוען uniaxial (דחיסה), 3 - טוען Biaxial (דחיסה וגזירה). את תוכן ה-DNA ואת המשקולות הרטובות של מבנים נשארו דומה בשלוש הקבוצות, לאחר 30 ימים של טיפוח (P> 0.05). תוכן GAG היה הגבוה ביותר בקבוצה, שהיה נתון לטעינת biaxial (3 קבוצה, P <0.001 לעומת קבוצת הביקורת), ואחריו את הקבוצה טוען uniaxial (2 קבוצה, p <0.05) (איור 6). את תוכן GAG של קבוצות 2 ו -3 מתאים ל48% ו -50% מסחוס מקורי, בהתאמה. קבוצת 3 הסתיימו בסכום גבוה באופן משמעותי של קולגן מקבוצות 1 ו -2 (p <0.01). קבוצת 2 גם היו עבה יותר מבני thaקבוצת n 1 (p <0.01). למרבה ההפתעה, מודולוס שיווי משקל הדחיסה של הצעירים היה הגבוה ביותר בקבוצה 2 (טעינת uniaxial, p <0.01) ולא היו הבדלים משמעותיים בין קבוצת 3 ו1. מודולוס של יאנג בקבוצה 2 תואם 60.1% מסחוס חזירי ילידים.
הניתוחים היסטולוגית הצביעו צביעה חיובית והומוגנית לglycosaminoglycans (alcian הכחול, safranin O) והסוג II קולגן (איור 7). כל הקבוצות מוכתמות שליליות לסוג שאני קולגן (לא מוצג).
לסיכום, התוצאות ראשוניות אלה מראות כי bioreactor זו מיושמת דחיסה וbiaxial (דחיסה וגזירה) טעינה מכאנית במהלך טיפוח לטווח ארוך של רקמות מהונדסות בהצלחה. במחקר זה טוען biaxial הוצג proteoglycan וקולגן בתצהיר והעובי של דגימות רקמת הסחוס מהונדסות. דחיסת uniaxial עלתה גם בתצהיר וproteoglycan מודולוס של יאנג.
איור 1. טעינת biaxial מושגת על ידי X-השלב (גז) וה-Z הבמה (דחיסה). האיור מציג Platen טעינת מחוייט מצורף לשלבים כדי לטעון דגימות בצלחת 24 גם. פרמטרי הטעינה נשלטים עם מחשב המחובר למנועי צעד 18.
איור 2. משמאל: הטעינה מיועדת ל24 גם צלחות Platen polysulfone. מימין: הקובץ המצורף Platen הטעינה לטעינת bioreactor biaxial.
איור 3. הכנת agarose הבארות למשתק דגימות במהלך טעינת גזירה. המבנה המשותק להציב agarose גם לטעינה מכאנית. נתון זה מראה 1.5 מ"מ עובי agarose היטב ומדגם עבה 2.25 מ"מ.
איור 4. ממשק המשתמש הגרפי כדי לשלוט על מכשיר טעינת biaxial. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
hres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50387/50387fig5.jpg "/>
איור 5. ממשק דוגמא Biaxial טוען העבר רצף תכנית משתמש גרפי: תכנית דינמית דחיסת העבר רצף (10% טרה דחיסה, 10% משרעת מתח דינמי, 1 הרץ) ותכנית רצף דינמית שאר העבר (10% טרה דחיסה, 25% משרעת מתח גזירה דינמית, 0.5 הרץ). לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 6. תוצאות בדיקות ביוכימיות ומכאניות (n = 6) *** p <0.001, ** p <0.01, * p <0.05 בהשוואה לקבוצה 1 (שליטה פרקה קבוצה 2:.. טעינת לחיצה uniaxial, קבוצה 3: דחיסה וגזירת Biaxial טעינה.
together.within עמודים = "תמיד"> 
איור 7. היסטולוגיה: Alcian הכחולה / אדום מכתים מהיר גרעיני, Safranin O / מהיר ירוק, immunochemistry לקולגן מסוג II.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
יש לנו תוכנן מכשיר טוען כי הוא מסוגל ליישם מתח מכאני uniaxial או biaxial למבנים מהונדסים רקמות מפוברקות להשתלה. מכשיר יכול לשמש גם כbioreactor בטיפוח מבחנה של biocomposites מהונדס או כמכשיר בדיקה כדי לתאר את המאפיינים מכאניים של רקמת היליד או לאחר טיפולים אחרים לפני. נושאי המכשיר מהונדסים בונה רקמות לטעינה מכאנית biaxial בדייקנות רבה של מינון העמסה (משרעת ותדירות) ויישום למגוון רחב של תנאי תרבית רקמה מאחת עד 24 צלחות היטב.
היישום של טעינת גזירה הציג סדרה של אתגרים ייחודיים לעיצוב של מערכת זו. על מנת למקסם את העברת חומר מזין, בונה היו מוגבלת בשטח במקור בבארות בודדות של צלחת גם 24. זה לא מהווה בעיה עבור דחיסה דינמית, כזן הלחיצה הטרה מבוטח כיקשר מדגם Platen לא הלך לאיבוד. כאשר מתח גזירה נוסף לפרוטוקול, לעומת זאת, לא מוגבלות בשטח דגימות החליקו לאורך תחתית הצלחת וכמה איבד קשר עם משטח הסריקה. בנוסף, במהלך דגימות פרוטוקולי טעינת biaxial הייתה הנטייה להתהפך, וגרם טעינה עולה בקנה אחד. אנחנו פתרנו בעיה זו על ידי יצירת בארות agarose כדי לשתק דגימות כמתואר בהליך. agarose בארות אלה מאפשרות טעינת biaxial עקבית של דגימות ללא הגבלת זמינות חומרי הזנה לדגימות.
בניגוד לדחיסת bioreactors שנחקרו באופן נרחב מאוד 20,21, המכשיר שלנו הוא מסוגל ליישם זנים מדויקים על צירים מרובים. צירים אלה יכולים להיות מבוקרים באופן עצמאי. טעינת Multiaxial יכולה להיות מיושמת ברצף או בו זמנית. אפשר ליישם את ציר Y שלישי לספק טעינה מכאנית בשלושה ממדים טובים יותר לחקות בתנאי vivo.
בעודbioreactors multiaxial אחר פותחו כדי לחקות את הסביבה מכאנית של המפרק, יש להם מגבלות גדולות בהשוואה למערכת שלנו. מנגנון גזירה ודחיסה שתוכנן על ידי פרנק, et al. מאפשר עד 12 דגימות שנטענו בו זמנית עם משוב עומס, אולם מבנים אינם מוגבלים או מאובטח 6. במהלך הניסויים מעורבים מאמץ גזירה, זה חיוני כי מבנים להיות מאובטחים, כך שהם לא להחליק מתחת Platen הטעינה. הזזה תגרום לטעינת גזירה לא אחידה ולא עקבית של הדגימה. bioreactors חדש יותר, כגון מערכת הייחודית "כדור המתגלגלת" 22,23 ומכשיר גירוי biaxial 16, ליצור סביבת טעינה הרבה יותר מציאותית ועקבית, עם זאת, הם מאפשרים רק מדגם אחד להיות טעונים בכל פעם. גודל מדגם גדול חיוני לביצוע הניתוחים ביוכימי, מכאניים, והיסטולוגית ההכרחיים במבנים עם רמה גבוהה של ביטחון. Additionally, המערכת "הכדור המתגלגלת" חסר משוב כוח, אמצעי חיוני להתפתחות מבנה בטווח ארוך בטיפוח מבחנה. זה גם מאפשר מניעת Platen-דגימה ללא מגע ועומס יתר דגימה, אשר יפגע באופן בלתי הפיך ברקמות מהונדסות מבנים. Bioreactor קשר הזזה שפותח על ידי ביאן, et al. מאפשר עד ארבעה מבנים שטעונים בו זמנית, אבל עדיין חסר מנגנון משוב כוח הזה ערך 17.
ההתקנה הנוכחית באמצעות 24 גם צלחות מאפשרת טעינה בו זמנית של 24 דגימות; עוד דוגמאות אפשריות עם שינויים של הגיאומטריה של Platen הטעינה. Platen הטעינה מציע גמישות רבה לעיצוב החדשני. החומר שנבחר polysulfone הוא נקבובי, ניתן לעקר וטיפח בסביבה הלחה וחמה של חממה. זה בקלות machinable, המאפשר מגוון רחב של גיאומטריות ומספרים של דגימות כדי לטעון בו זמניתly.
לסיכום, טוען bioreactor biaxial החדש להנדסת רקמות מאפשר לטווח ארוך בטיפוח מבחנה של מבנים מהונדסים רקמות. טעינת biaxial גדלה proteoglycan וקולגן בתצהיר ועובי של דגימות רקמת הסחוס מהונדסות אבל לא נראית שכדי להשפיע באופן משמעותי את התכונות מכאניות של סחוס מהונדס כפי ששערנו. דחיסת uniaxial עלתה גם בתצהיר proteoglycan ומודולוס של יאנג. אנו מאמינים שהמינון האופטימלי של טעינה מכאנית שונים עם תא ותכונות רקמות. מחקרים עתידיים של אדריכלות קולגן וdosimetry של טעינה יאפשר לנו להעריך באופן מלא את ההשפעות של העמסת biaxial על פיתוח רקמות מהונדסות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי משרד מחקר ופיתוח, RR ופיתוח השירות, המחלקה לענייני יוצאי צבא של ארה"ב, NIH COBRE 1P20RR024484, NIH K24 AR02128 ומשרד ההגנה W81XWH-10-1-0643.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DMEM, High glucose, pyruvate | Invitrogen | 11995 | |
| Agarose Type II | Sigma | CAS 39346-81-1 | |
| Penicillin Streptomycin Glutamine 100X | Invitrogen | 10378-016 | |
| ITS+ Premix | BD Biosciences | 354352 | |
| Pen Strep Glutamine | Invitrogen | 10378-016 | |
| Amphotericin B | Invitrogen | 041-95780 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A-2218 | |
| Nonessential Amino Acid Solution 100x | Sigma | M-7145 | |
| L-proline | Sigma | P-5607 | |
| Dexamethasone | Sigma | D-2915 | |
| Recombinant Human Transforming Growth Factor β1 | R&D Systems | 240-B-010 | |
| EQUIPMENT | |||
| Model 31 Load Cell (1000 g) | Honeywell | AL311 | |
| Model 31 Load Cell (1000 g) | Honeywell | AL311 | |
| Single Channel Display | Honeywell | SC500 | |
| 50 mm Linear Encoded Travelmax Stage with Stepper Actuator | Thorlabs | LNR50SE/M | |
| Two Channel Stepper Motor Controller | Thorlabs | BSC102 | |
| 50 mm Trapezoidal Stepper Motor Drive (2) | Thorlabs | DRV014 | |
| Adjustable Kinematic Locator (4) | Thorlabs | KL02 | |
| Precision Right Angle Plate | Thorlabs | AP90/M | |
| Vertical Mounting Bracket | Thorlabs | LNR50P2/M | |
| Solid Aluminum Breadboard | Thorlabs | MB3030/M | |
| Gel Casting System with 1.5 mm and 0.75 mm spacer plates | BioRad | #1653312 and #1653310 | |
| Disposable Biopsy Punch, 5 mm | Miltex, Inc. | 33-35 | |
| 16 mm hollow punch | Neiko Tools | ||
| Non-Tissue Culture Treated Plates, 24 Well, Flat Bottom | BD Biosciences | 351147 | |
| Ultra-Moisture-Resistant Polysulfone sheet for loading platens | McMaster-Carr | 86735k19 | Custom-machined |
References
- Drachman, D. B., Sokoloff, L. The role of movement in embryonic joint development. Devl. Biol. 14, 401-420 (1966).
- Buschmann, M. D., Gluzband, Y. A., Grodzinsky, A. J., Hunziker, E. B. Mechanical compression modulates matrix biosynthesis in chondrocyte/agarose culture. J. Cell Sci. 108, 1497-1508 (1995).
- Vunjak-Novakovic, G., et al. Bioreactor Cultivation Conditions Modulate the Composition and Mechanical Properties of Tissue-Engineered Cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 17, 130-138 (1999).
- Gooch, K. J., et al. Effects of Mixing Intensity on Tissue-Engineered Cartilage. Biotechnology and Bioengineering. 72, 402-407 (2001).
- Carver, S. E., Heath, C. A. Increasing extracellular matrix production in regenerating cartilage with intermittent physiological pressure. Biotechnology and Bioengineering. 62, 166-174 (1999).
- Frank, E. H., Jin, M., Loening, A. M., Levenston, M. E., Grodzinsky, A. J. A versatile shear and compression apparatus for mechanical stimulation of tissue culture explants. J. Biomech. 33, 1523-1527 (2000).
- Wagner, D. R., et al. Hydrostatic pressure enhances chondrogenic differentiation of human bone marrow stromal cells in osteochondrogenic medium. Ann. Biomed. Eng. 36, 813-820 (2008).
- Butler, D. L., Goldstein, S. A., Guilak, F. Functional Tissue Engineering: The Role of Biomechanics. J. Biomech. Eng. 122, 570-575 (2000).
- Guilak, F., Butler, D. L., Goldstein, S. A. Functional Tissue Engineering. The role of biomechanics in articular cartilage repair. Clin. Orthop. 391S, S295-S305 (2001).
- Mauck, R. L., Byers, B. A., Yuan, X., Tuan, R. S. Regulation of cartilaginous ECM gene transcription by chondrocytes and MSCs in 3D culture in response to dynamic loading. Biomech. Model Mechanobiol. 6, 113-125 (2007).
- Rubin, C., Xu, G., Judex, S. The anabolic activity of bone tissue, suppressed by disuse, is normalized by brief exposure to extremely low-magnitude mechanical stimuli. FASEB J. 15, 2225-2229 (2001).
- Wimmer, M. A., et al. Tribology approach to the engineering and study of articular cartilage. Tissue Eng. 10, 1436-1445 (2004).
- Miyata, S., Tateishi, T., Ushida, T. Influence of cartilaginous matrix accumulation on viscoelastic response of chondrocyte/agarose constructs under dynamic compressive and shear loading. J. Biomech. Eng. 130, 051016 (2008).
- Heiner, A. D., Martin, J. A. Cartilage responses to a novel triaxial mechanostimulatory culture system. J. Biomech. 37, 689-695 (2004).
- Waldman, S. D., Couto, D. C., Grynpas, M. D., Pilliar, R. M., Kandel, R. A. Multi-axial mechanical stimulation of tissue engineered cartilage: review. Eur. Cell Mater. 13, 66-73 (2007).
- Wartella, K. A., Wayne, J. S. Bioreactor for biaxial mechanical stimulation to tissue engineered constructs. J. Biomech. Eng. 131, 044501 (2009).
- Bian, L., et al. Dynamic mechanical loading enhances functional properties of tissue-engineered cartilage using mature canine chondrocytes. Tissue Eng. Part A. 16, 1781-1790 (2010).
- Design of a Biaxial Loading Device for Cartilage Tissue Engineering. Bilgen, B., et al. 57th Annual Meeting of the Orthopaedic Research Society (ORS), , 1815 (2011).
- Mauck, R. L., Wang, C. C., Oswald, E. S., Ateshian, G. A., Hung, C. T. The role of cell seeding density and nutrient supply for articular cartilage tissue engineering with deformational loading. Osteoarthritis Cartilage. 11, 879-890 (2003).
- Mauck, R. L., et al. Functional tissue engineering of articular cartilage through dynamic loading of chondrocyte-seeded agarose gels. J. Biomech. Eng. 122, 252-260 (2000).
- Demarteau, O., Jakob, M., Schafer, D., Heberer, M., Martin, I. Development and validation of a bioreactor for physical stimulation of engineered cartilage. Biorheology. 40, 331-336 (2003).
- Grad, S., et al. Surface motion upregulates superficial zone protein and hyaluronan production in chondrocyte-seeded three-dimensional scaffolds. Tissue Eng. 11, 249-256 (2005).
- Schatti, O., et al. A combination of shear and dynamic compression leads to mechanically induced chondrogenesis of human mesenchymal stem cells. Eur. Cell Mater. 22, 214-225 (2011).
