Beter begrip van alvleesklierkanker biologie is kritisch nodig om de ontwikkeling van betere therapeutische opties om pancreaskanker te behandelen mogelijk te maken. Om aan deze behoefte te pakken, zien we een orthotopic model van pancreaskanker die niet-invasieve monitoring van de progressie van kanker maakt gebruik van In vivo Bioluminescentie beeldvorming.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Bioluminescent Orthotope Model van pancreaskanker Progression
In dit artikel
Samenvatting
Inleiding
Alvleesklierkanker is de vierde belangrijkste oorzaak van kanker-gerelateerde sterfte, met een 5-jaarsoverleving van 4-6%. 1,2 Slechts 15% van de patiënten wordt de diagnose vroeg genoeg in de ziekte in aanmerking te komen voor een operatie, en tumoren terugkeren in> 80% van die patiënten. 3,4 Gemcitabine wordt gebruikt voor de behandeling van pancreatische adenocarcinomen, echter chemoresistance is gebruikelijk en vaak de drug heeft weinig invloed op de totale overleving. 5 nieuwe farmacologische strategieën van alvleesklierkanker te behandelen zijn kritisch nodig. Hun ontwikkeling hangt af van aanzienlijk verbeterd begrip van de belangrijkste stappen van de progressie van de ziekte die gevoelig zijn voor therapeutische interventie kan zijn.
Orthotopische modellen van pancreaskanker emuleren belangrijke aspecten van de menselijke ziekte, waardoor ze ideaal tools om de biologie van alvleesklierkanker. 6-9 In tegenstelling tot in vitro cel-gebaseerde testen van pancreaskanker celgedrag eend subcutaan in vivo modellen van pancreaskanker, orthotopische modellen laten onderzoeken van tumorcel interacties met de alvleesklier micro-omgeving. De kinetiek van de progressie van de ziekte zijn zeer reproduceerbaar in orthotopic modellen en voordoen over een korte tijd (weken), waardoor ze zeer geschikt voor pre-klinische testen van nieuwe therapieën. Dit in tegenstelling tot transgene modellen waarbij ziektebegin optreedt over een langere en variabele tijd (maanden tot 1 jaar). 10 Bij gebruik met meer agressieve cellijnen orthotopische modellen van alvleesklierkanker patronen van spontane metastase gelijk aan die in patiënten. 8 Expressie van bioluminescentie reporter genen zoals vuurvliegluciferase vergemakkelijkt longitudinale controle van de tumorgroei, metastatische verspreiding, herhaling en de respons op therapie. 6,11
Hier beschrijven we een orthotopic model van pancreaskanker die Matr gebruikigel cellen voor gelokaliseerde aflevering en in vivo bioluminescentie voor niet-invasieve monitoring van tumorprogressie. Dit orthotopic model van pancreaskanker maakt niet-invasieve analyses van progressie van de ziekte en de reactie op therapeutische interventies in syngene of xenograftmodellen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Het protocol wordt gedemonstreerd wordt uitgevoerd onder de leiding en goedkeuring van de auteur instelling dierlijke zorg en gebruik commissie. Alle experimenten worden uitgevoerd in overeenstemming met alle relevante richtlijnen, verordeningen en regelgevende instanties.
1. Transducing pancreaskankercellijnen
- Transduceren pancreaskanker cellen luciferase expressie zoals eerder beschreven. 12,13 Panc-1 en Capan-1 pancreaskankercellijnen getransduceerd met vuurvlieg luciferase worden hier gebruikt.
Opmerking: Renilla luciferase of bacteriële luciferase kunnen ook worden gebruikt.
2. Pancreaskankercellijnen Voorbereiding
- Cultuur getransduceerde alvleesklierkankercellen tot 70% samenvloeiing.
- Til de alvleesklier cellen en zorgen voor levensvatbaarheid is groter dan 90%.
- Resuspendeer in 2 x 10 7 cellen / ml in een 3:2 mengsel van gekoeld Matrigel: Fosfaat gebufferde saline (PBS).
- Houd de Matrigel-celsuspensie op ijs voorafgaand aan injectie in de alvleesklier.
Opmerkingen: Om snelle stolling van Matrigel waarborgen, verminderen de volume PBS met het volume van de celpellet. Handvat Matrigel met ijskoude instrumenten en spuiten te allen tijde stollen vóór injectie te voorkomen. De voorgestelde aantal cellen is een leidraad en moet empirisch worden bepaald voor elke cellijn.
3. Muis Voorbereiding
- Verdoven van de muis met behulp van geïnhaleerd 2-3% isofluraan. Bepaal de diepte van de anesthesie door een gebrek aan pedaal reflex een zachte teen knijpen.
- Breng smeermiddel aan op de ogen om uitdroging te voorkomen.
- Plaats de muis op zijn rug op een 37 ° C verwarming pad en zet de muis voorzichtig naar de linkerkant van de buik te verhogen.
- Bereid de buik met een 10% povidonjood-oplossing.
Opmerkingen: Injectable anesthesie worden gebruikt in plaats van geïnhaleerde anesthesie. Pre-operatieve vasten niet noodzakelijk.
4. Laparotomie
- Met behulp van steriele chirurgische instrumenten maken een 1,5 cm incisie in de huid ongeveer 1 cm links lateraal van de middellijn.
- Voeg een 1,5 cm incisie in de onderliggende buikspier.
- Zoek de milt met behulp van de tang en verwijder voorzichtig de milt uit de buikholte. Beveilig de milt langs een steriel wattenstaafje om de onderliggende alvleesklier bloot.
- Zoek de staart van de pancreas naast de milt.
- Met behulp van een 29 G 0,3 ml insulinespuit Injecteer 20 ul van het Matrigel-celsuspensie in de pancreas.
- Na injectie, houd de injectiespuit in de alvleesklier voor 30-60 seconden totdat de Matrigel is gestold. Deze belangrijke stap minimaliseert cel lekkage.
- Inspecteer de injectieplaats te verzekeren geen lekkage optrad.
- Stuur de milt en pancreas de buikholte.
Opmerking: Let er op dat aanprikken van de dorsale zijde van de alvleesklier, die dun kan zijn.
5. Buikwand Sluiting
- Sluit de buikspieren van de muis met een absorbeerbare gevlochten 4-0 hechtdraad met een ronde naald met behulp van een continue steek.
- Sluit de externe huid met een niet-absorbeerbare monofilament 6-0 hechtdraad met een cutting naald met behulp van een continue steek.
- Verwijder de muis uit de ingeademde verdoving ingespoten 0.05-0.1 mg / kg subcutaan buprenorfine.
- Laat de muis om te herstellen in zijn kooi geplaatst op een 37 ° C verwarmen pad met vrije toegang tot voedsel en water. Als muizen tonen tekenen van pijn, zoals hunching of beperkte mobiliteit, kan buprenorfine worden gegeven om de 12 uur over een 36 uurs periode.
- Na wondgenezing (7-10 dagen), verdoven de muis en verwijder de externe hechtingen.
6. Bioluminescent Tracking van Pancreatic CancER Progression
- Verdoven van de muis met behulp van geïnhaleerd isofluraan.
- Injecteren 150 mg / kg D-luciferine via staartader.
- Plaats de muis in de bioluminescentie imaging systeem en vastleggen wit-licht-en bioluminescentie beelden zoals eerder beschreven. 14,15
- Verwijder de muis uit de geïnhaleerde verdoving en laten herstellen in zijn kooi.
Opmerking: Bioluminescent beeldvorming is niet-invasief en kan periodiek worden uitgevoerd om tumorgroei kinetiek onderzoeken. Om afbeelding tumor in de pancreas staart is het belangrijk om de muis te zetten aan de linkerkant, zodat de tumor wijst naar de camera. We afgebeeld eenmaal per week met de frequentie verhoogd tot drie keer per week voor de experimentele eindpunt met een Lumina II beeldvormingssysteem (Perkin-Elmer, voorheen Caliper Life Sciences) actief Living Imaging 4.3.1 software met binning 4, FOV 12,5, F-stop 1, blootstelling 1-60 sec (bepaald door de hoogste expComposure zonder pixel verzadiging).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Deze methode beschrijft een orthotopic model van pancreaskanker behulp van chirurgische procedures, inclusief inductie van anesthesie, laparotomie, injectie van kankercellen in Matrigel en abdominale sluiting (Figuur 1A). De geïnjecteerde cellen vormen een luchtbel in het oppervlak van de alvleesklier (Figuur 1B). Alvleesklier kanker progressie kan niet-invasief bewaakt met in vivo bioluminescentie van kankercel proliferatie en verspreiding (Figuur 2) te vinden...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier beschrijven we een orthotopic model voor longitudinale beoordeling van pancreastumor ontwikkeling en progressie. Primaire tumorgroei kinetiek reproduceerbaar zijn (figuur 3) en kan niet-invasief bewaakt worden gebruikt bioluminescentie van luciferase-gemerkte cellen, bijvoorbeeld voor de analyse van tumorrespons om nieuwe anti-alvleesklierkanker therapeutica. In overeenstemming met de menselijke ziekte, het model toont lokale alvleesklier invasie (figuur 4A), die onderzoek...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de National Health en Medical Research Council, Australië (1008865), de Australische Research Council (LE110100125), het National Cancer Institute (CA138687-01), Erica Sloan wordt ondersteund door een Early Career Fellowship van de National Breast Cancer stichting, Australië. Corina Kim-Fuchs wordt ondersteund door een beurs van de Zwitserse Liga tegen Kanker en een HDR-beurs van Monash Instituut voor Farmaceutische Wetenschappen. Eliane Angst wordt ondersteund door een subsidie van de Bern Liga tegen Kanker.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Clean Bench coat | |||
| Verwarmingskussen | Instellen op 37 °C | ||
| Ivis Lumina ll Bioluminescent imager | Caliper | Alternatieve bioluminescente beeldvormingssystemen omvatten In vivo F PRO (Carestream) en Photon Imager (Biospace Lab) | |
| Dissectie schaar | |||
| Iris forceps (gekarteld) | |||
| Naaldhouder | |||
| 27 G 0,3 ml insulinesyringe | Terumo | T35525M2913 |
Referenties
- American Cancer Society. Facts and Figures. , American Cancer Society. Atlanta. (2013).
- Hariharan, D., Saied, A., Kocher, H. M. Analysis of mortality rates for pancreatic cancer across the world. HPB (Oxford). 10, 58-62 (2008).
- Li, D., Xie, K., Wolff, R., Abbruzzese, J. L. Pancreatic cancer. Lancet. 363, 1049-1057 (2004).
- Oettle, H., et al. Adjuvant chemotherapy with gemcitabine vs observation in patients undergoing curative-intent resection of pancreatic cancer: a randomized controlled trial. JAMA. 297, 267-277 (2007).
- Andersson, R., et al. Gemcitabine chemoresistance in pancreatic cancer: molecular mechanisms and potential solutions. Scand. J. Gastroenterol. 44, 782-786 (2009).
- Angst, E., et al. Bioluminescence imaging of angiogenesis in a murine orthotopic pancreatic cancer model. Mol. Imaging Biol. 12, 570-575 (2010).
- Angst, E., et al. N-myc downstream regulated gene-1 expression correlates with reduced pancreatic cancer growth and increased apoptosis in vitro and in vivo. Surgery. 149, 614-624 (2011).
- Hotz, H. G., et al. An orthotopic nude mouse model for evaluating pathophysiology and therapy of pancreatic cancer. Pancreas. 26, 89-98 (2003).
- Partecke, L. I., et al. A syngeneic orthotopic murine model of pancreatic adenocarcinoma in the C57/BL6 mouse using the Panc02 and 6606PDA cell lines. Eur. Surg. Res. 47, 98-107 (2011).
- Hingorani, S. R., et al. Preinvasive and invasive ductal pancreatic cancer and its early detection in the mouse. Cancer Cell. 4, 437-450 (2003).
- Sloan, E. K., et al. The sympathetic nervous system induces a metastatic switch in primary breast cancer. Cancer Res. 70, 7042-7052 (2010).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J. Vis. Exp. (32), e1499(2009).
- Morizono, K., et al. Lentiviral vector retargeting to P-glycoprotein on metastatic melanoma through intravenous injection. Nat. Med. 11, 346-352 (2005).
- Saha, D., et al. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics of breast cancer brain metastasis in a mouse model. J. Vis. Exp. (56), e3175(2011).
- Lim, E., et al. Monitoring tumor metastases and osteolytic lesions with bioluminescence and micro CT imaging. J. Vis. Exp. (52), e2775(2011).
- Burton, J. B., et al. Adenovirus-mediated gene expression imaging to directly detect sentinel lymph node metastasis of prostate cancer. Nat Med. 14, 882-888 (2008).
- Vezeridis, M. P., Doremus, C. M., Tibbetts, L. M., Tzanakakis, G., Jackson, B. T. Invasion and metastasis following orthotopic transplantation of human pancreatic cancer in the nude mouse. J. Surg. Oncol. 40, 261-265 (1989).
- Fu, X., Guadagni, F., Hoffman, R. M. A metastatic nude-mouse model of human pancreatic cancer constructed orthotopically with histologically intact patient specimens. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5645-5649 (1992).
- Reyes, G., et al. Orthotopic xenografts of human pancreatic carcinomas acquire genetic aberrations during dissemination in nude mice. Cancer Res. 56, 5713-5719 (1996).
- Kim, M. P., et al. Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice. Nat Protoc. 4, 1670-1680 (2009).
- Furukawa, T., Kubota, T., Watanabe, M., Kitajima, M., Hoffman, R. M. A novel "patient-like" treatment model of human pancreatic cancer constructed using orthotopic transplantation of histologically intact human tumor tissue in nude mice. Cancer Res. 53, 3070-3072 (1993).
- Lewis, C. E., Pollard, J. W. Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments. Cancer Res. 66, 605-612 (2006).
- Brembeck, F. H., et al. The mutant K-ras oncogene causes pancreatic periductal lymphocytic infiltration and gastric mucous neck cell hyperplasia in transgenic mice. Cancer Res. 63, 2005-2009 (2003).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
