Summary
Stimolazione nervosa infrarossi è stato proposto come alternativa alla stimolazione elettrica in una gamma di tipi nervose, comprese quelle associate al sistema uditivo. Questo protocollo descrive un metodo patch clamp per studiare il meccanismo di stimolazione nervosa infrarossa in una cultura di neuroni uditivi primari.
Abstract
È stato dimostrato negli ultimi anni che pulsata, luce laser infrarosso può essere utilizzato per ottenere risposte elettrici nel tessuto neurale, indipendente da qualsiasi ulteriore modifica del tessuto bersaglio. Stimolazione neurale infrarossi è stato riportato in una varietà di tessuto neurale e sensoriali periferici in vivo, con particolare interesse mostrato nella stimolazione di neuroni nel nervo uditivo. Tuttavia, mentre INS ha dimostrato di funzionare in queste impostazioni, il meccanismo (o meccanismi) attraverso il quale la luce infrarossa causa l'eccitazione neurale è attualmente poco compreso. Il protocollo presentato qui descrive un metodo di patch clamp cellula intera progettato per facilitare le indagini di stimolazione neurale infrarossi in colture di neuroni uditivi primari. Dal fondo caratterizzare la risposta di queste cellule di illuminazione laser infrarosso in vitro in condizioni controllate, può essere possibile ottenere una migliore comprensione del physica fondamentalel ed i processi biochimici sottostanti stimolazione neurale infrarossi.
Introduction
I campi della neurofisiologia e della bionica medica si basano molto sulle tecniche che consentono la stimolazione controllabile di risposte elettriche nei tessuti nervosi. Mentre la stimolazione elettrica rimane il gold standard nella eccitazione neurale, soffre di una serie di inconvenienti, quali la presenza di artefatti di stimolazione quando si registra risposte neurali, e una mancanza di stimolazione specificità dovuta alla diffusione di corrente nel tessuto circostante 1.
Gli ultimi due decenni hanno visto lo sviluppo di tecniche di stimolazione otticamente mediate 2. Molte di queste tecniche richiede modificazione del tessuto bersaglio, tramite l'aggiunta di una particolare molecola (molecole es gabbia) 3 o qualche forma di manipolazione genetica (es. optogenetics) 4, nessuno dei quali è facilmente applicabile al di fuori di un ambiente di ricerca. Di particolare interesse è dunque stimolazione neurale infrarossi (INS), whereby tessuto neurale è eccitato dalla luce laser infrarossa pulsata. INS ha il potenziale per superare molte delle carenze della stimolazione elettrica, consentendo altamente specifico, senza contatto stimolazione del tessuto neurale 2. Tuttavia, mentre INS è stata dimostrata con successo in una varietà di impostazioni in vivo, il meccanismo preciso di eccitazione rimane incerta.
Alcune pubblicazioni recenti hanno dimostrato progressi verso scoprire il meccanismo che sta dietro INS 5-7. Rapido riscaldamento dovuto all'assorbimento della luce laser da acqua sembra giocare un ruolo chiave. Tuttavia, al di là di questo un consenso deve ancora essere raggiunto. Shapiro et al. 7 propongono un meccanismo molto generale che riscaldamento rapido provoca una perturbazione nella distribuzione di particelle cariche adiacenti alla membrana cellulare, portando ad una variazione della capacità della membrana cellulare e conseguente depolarizzazione. Inoltre, Albert et al. 5 affermare che Laser riscaldamento indotto attiva una specifica classe di temperatura canali ionici sensibili (recettore vanilloide potenziale transiente canali), permettendo agli ioni di passare attraverso la membrana cellulare. In questa fase non è chiaro come questi meccanismi combinano, o anche se vi sono ulteriori fattori che sono ancora da identificare.
Anche se un piccolo numero di pubblicazioni (riferimenti 5,7-9) hanno indagato INS in vitro, la stragrande maggioranza dei lavori pubblicati in questo campo è stata effettuata in vivo (ad es riferimenti 1,6,10-18). Stimolazione infrarossi dei neuroni uditivi è stata una zona di particolare interesse, a causa delle potenziali applicazioni in impianti cocleari 10,14-18. Mentre esperimenti in vivo sono importanti per verificare l'efficacia della tecnica in varie impostazioni, l'aumento del livello di controllo offerta da studi in vitro dovrebbe portare ad una comprensione più dettagliata del meccanismosmo responsabile INS. Questo rapporto descrive la preparazione di colture di neuroni del ganglio spirale per le indagini di patch clamp, in quanto questi possono essere utilizzati per studiare i meccanismi fondamentali, mentre anche il collegamento per la grande quantità di dati esistenti dal sistema uditivo.
La tecnica patch clamp è un eccellente strumento per ricerche di fenomeni elettrofisiologici, fornendo un mezzo di registrazione dell'attività elettrica in cellule singole e studiando il contributo delle singole correnti sottostanti 19. Quando questa tecnica viene applicata a una stalla in preparazione in vitro di neuroni primari come coltura spirale neuroni gangliari, che offre l'opportunità di studiare in modo approfondito i meccanismi con cui l'attività neurale è controllato e manipolato.
I protocolli specificati in questo lavoro metodi di contorno per investigare l'effetto della stimolazione laser sulle proprietà elettriche dei neuroni del ganglio spirale attraverso Patch Clampregistrazioni. L'approccio è basato su un laser accoppiato in fibra piuttosto che un laser a spazio libero, consentendo un funzionamento più sicuro e più facile e più ripetibile allineamento senza la necessità di modificare la configurazione microscopio standard. Sulla base di questi protocolli, dovrebbe essere possibile effettuare una vasta gamma di esperimenti per determinare con maggiore precisione il meccanismo o meccanismi dietro INS.
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Protocol
1. Cultura di spirale neuroni dei gangli
- Sterilizzare piccolo rotondo (ad esempio diametro 10 mm) vetrini e pinze curve in autoclave. Trasferire i coprioggetti sterilizzati in singoli pozzetti di una 4-ring 35 millimetri capsula di Petri sterile o piastra 4-bene, usando le pinze sterilizzate. Applicare 150 ml di poli-L-ornitina (500 mcg / ml) e mouse laminina (0,01 mg / ml) alla superficie superiore del coprioggetto e posto in un incubatore (37 ° C) fino a 48 ore. Assicurarsi che i vetrini non galleggiano lontano dal fondo del pozzo.
- Preparare 50 ml supporti Neurobasal sterili (NBM) per ogni cultura neurale: 47.5 ml Neurobasal A, 0,5 ml di N 2 supplemento, 1 ml Integratore B27, 0,5 ml di L-glutammina, e 0,5 ml di penicillina-streptomicina. Nota: Gli integratori possono essere congelati, conservati a -20 ° C e aggiunto ai media il giorno richiesto.
- Dissociare i neuroni gangliari a spirale dal post-natale giorno 4-7 cuccioli di ratto, come descritto in precedenza 20,21, cizione sia enzimatica (0,025% tripsina e 0,001% DNasi I) e tecniche meccaniche. Consultare Whitlon et al. 22 e Vieira et al. 23 per le procedure dettagliate di ganglio spirale cultura neurone, o Parker et al. 24 per una dimostrazione di isolamento modiolus.
- Aspirare qualsiasi soluzione poly-L-ornithine/laminin restante dalle coprioggetto e lavare brevemente con NBM.
- Aggiungere 150-200 ml di dissociato ganglio spirale sospensione neurone i coprioggetti e posto in un incubatore (37 ° C, 10% di CO 2). Nota: fino a 20 vetrini possono essere preparati da una cucciolata media di 8 cuccioli di ratto.
- Quattro ore dopo neuroni placcatura, aspirare la soluzione per rimuovere i detriti cellulari e sostituirlo con 150-200 ml riscaldata NBM fresca. Nota: i media possono richiedere rifornimento giornaliero per evitare la disidratazione.
- Coprioggetto tornare alla incubatore fino al momento di registrazioni elettrofisiologiche. Nota: spirale dissociatoculture dei neuroni gangliari possono essere utilizzati per esperimenti di elettrofisiologia quattro ore dopo la dissociazione e per un massimo di due giorni successivi. Tempo in vitro deve essere preso in considerazione durante l'analisi dei risultati. Rifornire NBM ogni 24-48.
2. Preparazione per la pinza registrazioni patch
- Preparare le soluzioni di
- Intracellulare (micropipetta) soluzione: 115 mm K-gluconato, 7 mM KCl, 10 mM HEPES, 0.05 mM EGTA, 2 mM Na 2 ATP, 2 mM MgATP, 0.5 mM Na 2 GTP (regolare a pH 7,3 con KOH, regolare a 295 mosmol / kg con saccarosio). Filtrare la soluzione attraverso un filtro sterile (0,2 micron) e dividere in 200 microlitri aliquote essere conservati a -20 ° C fino al giorno della registrazione.
- Extracellulare (vasca) Soluzione: 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 10 mM glucosio (regolare a pH 7,4 con NaOH, regolare a 300-310 mOsmol / kg con saccarosio) . Questa soluzione viene effettuato il giorno di registrazione.
- Preparare la registrazione micropipette con una resistenza di 2-6 MW. Noi usiamo un laser CO 2 estrattore (P-2000; Sutter Instruments) e vetro borosilicato (diametro esterno 1,0 millimetri, 0,58 millimetri di diametro interno, 75 mm di lunghezza).
- Preparare il laser. Questo protocollo è destinato all'uso con un laser accoppiato in fibra, come la 1.870 nm Nerve infrarossi stimolatore da OptoTech P / L. La fibra ottica utilizzata per la consegna della luce nei nostri esperimenti è un 200/220 micron core / cladding diametro di fibra di silice con una apertura numerica di 0.22 e di connettori FC-PC ad entrambe le estremità (AFW Technologies MM1-FC2-200/220-5-C -0.22). I cavi di connessione sono stati tagliati a metà per produrre due trecce di fibre (cioè con connettori a un'estremità e spaccati all'altra). Gli effetti di diametro del nucleo della fibra e apertura numerica sul indotte laser variazioni di temperatura sono stati discussi in dettaglio da Thompson et al. 25
- Fendere la punta della fibra consegna luce utilizzando tecniche standarde garantire che la punta risulta è di alta qualità mediante osservazione al microscopio ottico (cioè la punta dovrebbe essere perpendicolare all'asse della fibra e apparire piatta su controllo visivo). Collegare la fibra di consegna luce all'uscita accoppiato in fibra del laser stimolazione mediante un appropriato tramite connettore (ad es Thorlabs ADAFC2).
- Misurare la potenza del laser di uscita dalla punta spaccati della fibra di fornitura luce utilizzando uno strumento adeguato (ad es FieldMate Coerente con LM-3 testa del rivelatore). Si raccomanda di controllare la potenza del laser ogni volta che la fibra di consegna luce viene scissa o un aggiustamento significativo è fatto per il laser (ad esempio, trasporto da un laboratorio ad un altro).
- Inserto in fibra di consegna luce in una morsa di fibra o un dispositivo equivalente e apporre il mandrino al micropositioner appropriata. È importante essere in grado di determinare con precisione l'angolo θ che la fibra ottica rende con il coprioggetto. Questo angle può essere misurata prendendo una fotografia della disposizione sperimentale e utilizzando un software di elaborazione di immagini (ad es ImageJ) per ottenere l'angolo. L'angolo θ (o intervallo di possibili angoli) è vincolato principalmente da limitazioni spaziali del dispositivo sperimentale - in particolare il microscopio. Tipici valori di θ nei nostri esperimenti (basato su un microscopio in posizione verticale) sono circa 36 °, tuttavia l'angolo ottimale può variare in modo significativo per configurazioni alternative (ad esempio quelli che utilizzano un microscopio invertito).
- Effettuare le connessioni tra il laser e il sistema di acquisizione di patch clamp dati (ad es Digidata 1440A, Molecular Devices) come mostrato in Figura 2. L'uscita digitale dal sistema di acquisizione dati del patch clamp deve essere collegato al laser tramite un generatore di funzione esterna, rendendo possibile specificare parametri dell'impulso laser indipendente dal sistema di acquisizione dati. Alternativamente questa uscita può essere collegata direttamente alil driver laser (richiedendo la lunghezza degli impulsi e frequenza di ripetizione da impostare dal software di acquisizione dati). In entrambi i casi, il segnale utilizzato per attivare il laser deve essere collegato ad un ingresso posteriore del sistema di acquisizione dati per garantire che il calendario e lunghezza degli impulsi laser possono essere registrati in concomitanza con il segnale elettrofisiologico.
3. Pinza registrazioni patch per la Sorveglianza dei INS
- Riempire il contenitore appropriato del sistema di perfusione con soluzione extracellulare e regolare la portata di fornire perfusione del bagno a una velocità di 1-2 ml / min. Usiamo un sistema per gravità (bottiglia aspiratore, valvola a manicotto e tubo PE) con un riscaldatore in linea per consentire un rapido riscaldamento della soluzione, ed una pompa peristaltica per rimuovere soluzione esausta mediante aspirazione.
- Posizionare un vetrino con cellule in coltura nella camera di registrazione (bagno) di un microscopio in posizione verticale. Utilizzando un obiettivo di acqua-immersion alto ingrandimento (e. G. 40X) e contrasto di fase (ad esempio il contrasto di interferenza differenziale o gradiente di contrasto Dodt), individuare visivamente le spirali neuroni gangliari all'interno della cultura. Un tipico neurone ganglio spirale è di fase luminosa, rotonda e circa 15 micron di diametro, con un nucleo di primo piano, come mostrato in Figura 1a.
- Una volta che un neurone è stato localizzato, passare ad un ingrandimento obiettivo inferiore (ad esempio 10 volte) e individuare il neurone bersaglio all'interno del campo visivo.
- Spostare la luce in fibra ottica consegna in posizione utilizzando la procedura seguente (o equivalente):
- Utilizzare il micropositioner per spostare la fibra di uscita finché la punta è vicino al neurone bersaglio in entrambi i piani orizzontale e verticale. La posizione verticale della punta della fibra può essere verificata spostando l'obiettivo su e giù (scansione del fuoco).
- Tornare all'obiettivo alto ingrandimento e posizionare la punta della fibra ottica nella posizione prevista, viciegli neurone (vedi Figura 2 riquadro). Quando si regola la posizione verticale della fibra, è importante che il bordo inferiore della fibra è appoggiato sul (cioè semplicemente toccando) coprioggetti, per minimizzare l'incertezza nella posizione della fibra. Allineamento ottimale nel piano orizzontale dipende dall'angolo θ che rende la fibra con il coprioggetto e il raggio r della fibra. Per posizionare la fibra in modo che il centro del neurone bersaglio giace lungo l'asse della fibra, la distanza orizzontale tra il bordo superiore della fibra e la cellula bersaglio dovrebbe essere
Δ target = r (cosec θ - 2 sin θ),
dove i valori negativi indicano che le sovrasta in fibra ottica della cella. Nel posizionamento della fibra, una distanza di bersaglio Δ tra il bordo superiore della fibra e il centro del neurone può essere raggiunto approssimativamente mediante ispezione visiva. Tuttavia bersaglio Δ è progettato perservire come una guida di riferimento soltanto. Posizionamento della fibra tale che la distanza effettiva Δ tra il bordo superiore della fibra e il centro del neurone differisce notevolmente tra Δ bersaglio (come in Figura 1) può fornire indicazioni in effetto sia spostamento radiale (cioè dal centro del beam) e spostamento assiale (ossia lungo l'asse della fibra) del fascio rispetto al neurone bersaglio. Ad esempio, impostando Δ ≈ 0 ci si aspetterebbe per aumentare la temperatura locale in prossimità della cellula - ossia quanto il profilo del fascio di fibre multimodali tipici è ben approssimata da una distribuzione cappello superiore 26, la diminuzione dell'energia assorbita localmente (temperatura) causa di spostamento dal centro del fascio è minimo rispetto a l'aumento di energia assorbita dal muoversi faccia di estremità della fibra più vicino alla cella.
Mentre si dovrebbe aver cura di posizionare la fibra più accurata e ripetibile come Possible utilizzando segnali visivi, misurazione precisa della posizione di fibra rispetto al target neurone (per esempio Δ) è di maggiore importanza rispetto posizionandolo ad una prefissata distanza. Δ può essere determinato (con una incertezza massimo stimato di ± 3 micron) mediante analisi di immagine come descritto al punto 3.8.2 del protocollo. In alcuni esperimenti 5,8, fonti di luce bianca sono state accoppiate attraverso la fibra al fine di indirizzare la cella desiderata. Questo approccio è risultato inefficace nel setup microscopio verticale, come l'intensità della luce diffusa dalla regione bersaglio era relativamente bassa, questi angoli poco profondi (θ). - Una volta che la fibra è in posizione, spostarlo da una quantità nota di consentire il posizionamento diretto della micropipetta. La fibra può essere riportato nella posizione originale quando una registrazione neurale è raggiunto.
- Riempire la micropipetta con soluzione intracellulare e montare saldamente in posizione sulla testatage dell'amplificatore (ad esempio Multiclamp 700B, Molecular Devices). Utilizzando tubi attaccato al lato del supporto microelettrodo, applicare una piccola quantità di pressione positiva per evitare l'ostruzione della micropipetta.
- Utilizzando un micromanipolatore, spostare la micropipetta in posizione appena sopra il neurone bersaglio.
- Protocollo per le registrazioni integrali delle cellule:
- Applicare a 10 msec, 10 mV impulso a onda quadra (ad esempio prova di tenuta) in modalità voltage-clamp dell'amplificatore e regolare il potenziale micropipetta (pipetta compensato) del segnale di riferimento a 0 nA. La prova di tenuta deve essere usato per determinare se la resistenza del microelettrodo è all'interno dell'intervallo desiderato (ad esempio 2-6 MW).
- Se il controllo della resistenza, utilizzare la regolazione fine del micromanipolatore per posizionare delicatamente la micropipetta sulla superficie del neurone bersaglio. Quando la micropipetta è in contatto con il neurone, la resistenza aumenta (da ~ 0,5 a 1 MW). Imediatamente seguito dell'aumento di resistenza, rimuovere la pressione del fluido positiva e applicare una piccola pressione negativa. Una volta che la resistenza ha superato 10-20 MW, fissare il potenziale di membrana ad un livello di tenuta (ad esempio intorno a -60 mV).
- La resistenza dell'elettrodo dovrebbe continuare ad aumentare fino a superare 1 GΩ, a significare che una tenuta efficace (denominato 'gigaseal') è formato tra la membrana cellulare e micropipetta. A questo punto, rimuovere tutta la pressione del fluido dalla micropipetta.
- Una volta che il gigaseal è stato formato, utilizzare brevi impulsi di corrente (25 a 100 msec; +1 V) o brevi impulsi di pressione di fluido negativa alla rottura della membrana cellulare e conseguire configurazione whole cell.
- Registrare la capacità di membrana, resistenza serie e la resistenza di ingresso come determinato dalla curva esponenziale montato alla corrente durante l'impulso di prova di tenuta. Ridurre al minimo i transitori di capacità regolando i controlli CpFast e CpSlow l'amplificatore, quindi switch l'amplificatore in modalità cella insieme, e compensare la capacità e la resistenza fino a una corrente piatta è osservato durante la prova di tenuta. Applicare compensazione resistenza serie (~ 70% di correzione; 70% la previsione), regolando i controlli capacità e della resistenza per mantenere una prova di risposta guarnizione piatta.
- Passare alla modalità corrente-clamp in dell'amplificatore. Prendere atto del potenziale di membrana a riposo (in assenza di iniezione di corrente). Impostare una corrente di mantenimento per stabilizzare il potenziale di membrana al livello desiderato (ad esempio -60 mV). Neutralizzare la capacità pipetta e regolare il bilanciamento ponte per bilanciare la caduta di tensione.
- Controllare le proprietà di cottura del neurone stimolando con corrente depolarizzante (10-200 pA a 10 pA passi; 300 msec di durata).
- Spostare la parte posteriore in fibra ottica in posizione vicino al neurone. Mediante software di imaging accoppiato ad una camera CCD, catturare immagini della posizione della fibra rispetto alla neuro bersaglion, concentrandosi sul piano del neurone inizialmente, e poi sul bordo superiore della fibra ottica (vedi Figura 1).
- Per successiva analisi delle immagini risultanti (ad esempio figure 1b e 1c) è possibile determinare con esattezza Δ (la posizione del bordo superiore della relativa fibra ottica al centro del neurone bersaglio). Una volta Δ è noto, parametri quali la distanza dalla faccia di estremità della fibra al neurone bersaglio (lungo l'asse della fibra) z e lo spostamento radiale del neurone dal centro del raggio r δ possono essere calcolate utilizzando semplici relazioni trigonometriche:
z = r sin 2θ + Δ cos θ
δ r = ((r cos 2θ - Δ sin θ) 2 + dy 2) 1/2,
dove dy è la distanza tra l'asse della fibra e il centro del neurone come visto da sopra (ad esempio see Figure 1).
L'analisi deve tener conto delle variazioni di posizione da cellula a cellula, come la conoscenza accurata di questi parametri di posizione può essere richiesto di risolvere eventuali differenze tra i processi di stimolazione 25.
4. Esperimenti INS
- Durante la registrazione di dati elettrofisiologici in entrambi morsetto corrente o configurazioni clamp di tensione, eseguire la stimolazione laser presso i parametri desiderati (ad esempio potenza, lunghezza dell'impulso, frequenza di ripetizione, ecc.) Con la nostra laser, la potenza ottica è controllato tramite un ingresso diretto al driver laser ed è specificato manualmente prima di ogni registrazione. Lunghezza di impulso e la frequenza di ripetizione può essere controllato sia da un generatore di segnale o il software di acquisizione dati (come descritto nella fase 2.3.4). Assicurarsi che i dati vengono registrati sia dal canale di patch clamp e il canale di trigger laser.
Impulsi laser con lunghezze che vannoda circa 500 msec a 15 msec e di energie di ~ 0,25-5 mJ per impulso tipicamente produrre risposte elettriche misurabili. Impostare la frequenza di ripetizione degli impulsi laser a 1 Hz o meno può essere utile per esperimenti iniziali, poiché sarà minimizzare gli effetti di questo parametro. Risultati tipici mostrano la variazione del segnale registrato sono presentati nella seguente sezione.
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Representative Results
Neuroni gangliari spirale rispondono al laser con illuminazione ripetibile in entrambe le forme d'onda di tensione-clamp e configurazioni di registrazione corrente-clamp. Figura 3a mostra tipici cambiamenti nel flusso di corrente attraverso una membrana cellulare in risposta a un 2,5 msec, 0,8 mJ impulsi laser (risposta media da 6 impulsi laser, ripetuti ad intervalli di 1 sec) con il potenziale di membrana tenutosi a -70 mV, -60 mV e -50 mV. Le correnti in entrata netti sono costantemente evocati in risposta a impulsi laser, ritornando ai valori iniziali dopo l'illuminazione è cessata. La forma delle correnti indotte laser può essere visto a variare il potenziale di membrana viene modificata, indicando che può essere importante per condurre esperimenti ad una gamma di potenziali di possesso al fine di ottenere una comprensione completa dei processi sottostanti INS. Questi esperimenti possono essere eseguiti con la piccola modifica del protocollo corrente e analizzati utilizzando tecniche consolidate come carica-tensione (QV) analisi (seRiferimento e 7 per esempi di curve QV ottenuti da INS in vitro).
I dati presentati in Figura 3b sono indicativi della variazione del potenziale di membrana tipicamente evocato da una 2,5 msec, 0,8 mJ impulsi laser (potenziale di membrana iniziale-73mV, mediata su 16 impulsi laser emesse a una frequenza di ripetizione di 4 Hz). Registrazioni corrente-clamp mostrano un costante depolarizzazione della membrana nel corso dell'impulso laser seguito da una diminuzione di circa esponenziale verso il potenziale di membrana a riposo dopo l'impulso. L'esempio della Figura 3b mostra anche una piccola depolarizzazione della membrana supplementare dopo l'impulso laser. Shapiro et al. 7 hanno dimostrato che i cambiamenti indotti laser del potenziale di membrana sono strettamente correlati alle variazioni locali di temperatura (cioè la temperatura nelle immediate vicinanze della cellula). Inoltre, il modello descritto da Thompson et al. 27ha stabilito che in determinate condizioni di allineamento, diffusione risultante da gradienti di temperatura assiale e radiale della regione illuminata può portare a variazioni locali di temperatura molto somiglianti le variazioni del potenziale di membrana mostrati in Figura 3b. Come risultato di questi risultati, si ritiene che la posizione della cellula bersaglio rispetto alla superficie terminale della fibra consegna luce gioca un ruolo significativo nel determinare sia l'andamento nel tempo delle variazioni laser evocati del potenziale di membrana e la temperatura massima nella regione della cellula.
Illuminando con l'energia o l'esposizione a forti aumenti di temperatura eccessiva può causare danni al neurone bersaglio. Questo spesso può essere osservata attraverso deterioramento delle proprietà elettriche delle cellule (ad esempio un aumento brusco corrente necessaria per mantenere il potenziale di membrana ad un livello costante, e / o un grande aumento del rumore e instabilità all'interno del segnale). Nel caso estremomorte cellulare s verifica quasi istantaneamente per esposizione laser. Figura 4 mostra una registrazione voltage-clamp della morte di un neurone ganglio spirale risultante dall'esposizione ad 25 msec, 8 mJ impulso laser.
Figura 1. Immagini a contrasto di fase che mostrano un tipico neurone ganglio spirale e le posizioni relative della fibra ottica e micropipetta (visto da sopra) durante esperimenti di stimolazione ottica a.) Tipica spirale ganglio neurone. B) La fibra ottica in posizione (l'immagine è focalizzata sulla parte superiore bordo della fibra ottica) ec) immagini sovrapposte che mostrano la posizione fibra relativa alla cella (nota:. il bordo superiore della fibra è leggermente strapiombante la cella cioè Δ è negativo). Come visto dall'alto, y δ e & Delta; sono lo spostamento radiale del centro neurone dall'asse fibra e la distanza dal bordo superiore della fibra per rispettivamente il centro del neurone. Le frecce indicano la posizione del ganglio spirale neurone. Barre di scala 20 micron.
Figura 2. Schema del setup sperimentale per esperimenti di stimolazione ottica (non in scala) Nel riquadro:. Posizione della fibra ottica e microelettrodo relativa alla cella di destinazione. θ, Δ e z sono definite nel protocollo passi 3.4.2 e 3.8.2.
Figura 3. A) tensione-clamp (risposta media da 6 impulsi laser consrosso a una velocità di 1 Hz) e b) corrente-clamp (risposta media da 16 impulsi laser ripetuta ad una velocità di 4 Hz) registrazioni da neuroni del ganglio spirale mostrano laser cambiamenti indotti nella membrana potenziale attuale e la membrana su illuminazione da 2,5 msec , 0,8 mJ impulso laser. Regioni ombreggiate indicano i tempi di esposizione del laser. Riquadri mostrano le risposte durante illuminazione laser in modo più dettagliato. Nota: l'inserto in a) si concentra sulla traccia ottenuta con un potenziale di membrana di -60 mV. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 4. Registrazione di tensione-clamp che mostra la morte cellulare derivante da esposizione ad una eccessivamente energico (25 msec, 8 MJ) impulso laser. Notare che l'ampiezza diil segnale è mostrato in nA ed è significativamente più grande di quella delle correnti pA mostrati nella Figura 3.
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Discussion
Utilizzando i protocolli descritti in questo documento è possibile estrarre e cultura spirale neuroni gangliari e di indagare laser evocata attività elettrica eseguendo interi esperimenti di patch clamp cellulari. Quando utilizzato in vitro, la tecnica patch clamp fornisce un livello di controllo sui parametri sperimentali che non è realizzabile in vivo. Parametri di stimolazione laser come lunghezza d'onda, di impulsi di energia, lunghezza di impulso, forma d'impulso, e sequenze di ripetizione di impulsi possono essere studiati in un ambiente riproducibile. Inoltre, l'ambiente in cui vengono mantenuti i neuroni (ad esempio temperatura soluzione, fattori chimici) può essere variata sistematicamente, rendendo possibile lo studio delle proprietà di membrana e quindi i meccanismi alla base stimolazione neurale infrarossi. L'interazione tra le modalità di stimolazione elettrica e ottica può anche essere studiata in modo controllato. Questi studi fondamentali possono essere ulteriormente avanzato, introducendo fluorescenti sonde per monitorare parametri aggiuntivi come concentrazioni ioniche o l'espressione di proteine da shock termico. Una chiara comprensione di questi vari parametri non è solo critica per ottenere una comprensione completa del fenomeno, ma anche per ottenere una stimolazione più efficiente attraverso l'ottimizzazione dei processi.
A causa del ruolo importante svolto dalla temperatura nel meccanismo di INS 5-7, una misurazione precisa del riscaldamento localizzato a causa di illuminazione laser è di fondamentale importanza nel definire questo meccanismo 27. Un metodo dettagliato di ottenere misure di temperatura calibrate registrando la corrente che fluisce attraverso una pipetta di patch open è stata descritta da Yao et al. 28 e impiegato da numerosi autori, per determinare l'entità e la durata d'indotti laser variazioni di temperatura in ambienti rappresentativi di quelli Nei test in vitro (ad esempio vedi Bibliografia 7, 8). Fornired la posizione della fibra consegna luce può essere determinato con precisione (ad esempio utilizzando il protocollo di corrente), questo metodo di misurazione di temperatura è tale da permettere la mappatura accurata della variazione locale della temperatura dovuto tipici stimoli INS.
La lunghezza d'onda del laser stimolante è un parametro che dovrebbe essere considerato in esperimenti INS, poiché le variazioni di temperatura indotte laser (e quindi i meccanismi alla base INS) sono mediati dalla lunghezza d'onda caratteristiche di assorbimento di acqua 7 dipendenti (cfr. Thompson et al. 25 per una discussione dettagliata di effetti attesi di lunghezza d'onda). A parte il laser a diodi 1870 nm utilizzata in questo protocollo (Infrared Nerve Stimulator, Optotech P / L), una gamma di lunghezze d'onda e pacchetti laser sono stati utilizzati da altri autori. Alcuni esempi comuni dei laser utilizzati nelle pubblicazioni in esistenti sono: diodi laser da Aculight con lunghezze d'onda che vanno da 1,840-1,940 nm 6,7,10,13,16-18; Holmium: YAG (2.12 micron) da Laser 1-2-3 6,11,12,14,15, e laser a diodi che operano a 1875 nm 5,8, 1.470 nm 8 e 1535 nm 8 da Sheaumann laser.
Un potenziale svantaggio di applicazione di questa tecnica di coltura spirale neuroni gangliari è che, a causa delle dimensioni relativamente ridotte dei neuroni (~ 10-15 micron di diametro), l'elettrodo di registrazione viene illuminato direttamente dal laser. È stato suggerito che illuminazione laser oltre una certa soglia può modificare le proprietà del circuito di registrazione 7 (cioè tenuta e resistenza pipetta). Shapiro et al. 7 misurato questa soglia attraverso il monitoraggio della variazione di potenziale inversione delle curve QV come è stata aumentata la potenza del laser, trovare una energia di impulso soglia del 3 mJ. Come approccio alternativo, può essere possibile determinare l'entità di questo effetto misurando la resistenza combinata del sigillo e la pipetta in wModalità cella foro (ad esempio registrando la risposta ad una corrente 10 msec, +10 mV impulso di tensione) mentre variando la temperatura della soluzione extracellulare. Per comprendere appieno i meccanismi di INS, è di vitale importanza che il laser di resistenza indotti cambiamenti essere valutate e prese in considerazione.
Ad oggi la maggior parte del lavoro sperimentale riguardante la stimolazione neurale infrarossi è stato intrapreso in vivo. Mentre soglie di esposizione radiante segnalati per la stimolazione a infrarossi in vivo variano un po '(ad esempio 0,32 Jcm -2 a 2.12 micron per il nervo sciatico di ratto 1, <0.1 Jcm -2 a 1,855 micron per gerbillo nervi uditivi 18), sono significativamente inferiori a determinate soglie attraverso studi in vitro (ad esempio, circa il 20 Jcm -2 a 1,875 micron di topo cellule gangliari della retina di ratto e cellule gangliari vestibolari 5,8, 8,3 J cm-2 per il ratto cardiomiopatia neonataleciti 9). In questa fase i dettagli del processo INS non sono sufficientemente ben compresi a speculare sulla causa di questa differenza, tuttavia, utilizzando modelli in vitro come i neuroni uditivi molto simili al bersaglio di lavoro precedenti in vitro può essere vantaggiosa nel trovare una spiegazione .
Alcuni altri modelli in vitro coinvolgono le cellule più grandi, come ovociti di Xenopus (~ 1 mm) utilizzate da Shapiro et al. 7 Questi possono essere utili per sondare le variazioni spaziali nella efficacia di INS tra le singole cellule, al fine di verificare se i componenti cellulari sono influenzati dalla stimolazione. Modelli più semplici, come lipidi vescicole a doppio strato possono permettere un controllo ancora più preciso i parametri sperimentali di esperimenti in vitro, tuttavia tali modelli sono un po 'limitato nella portata e non possono rivelare la complessità della INS.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal Consiglio di Ricerca Australiano sotto Linkage Progetto concessione LP120100264.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture materials and equipment | |||
| Glass coverslips | Lomb Scientific | CSC 10 1 GP | |
| 4-ring cell culture dish | VWR International | 82050-542 | |
| Poly-L-ornithine solution | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Curved forceps | WPI | 14101 | Dumont #5 tweezers (45° angle tip) |
| CO2 Incubator | ThermoScientific | Heracell 150i | |
| Table 1. Cell culture materials and equipment. | |||
| Neurobasal media | |||
| Neurobasal A | Gibco | 10888-022 | |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | |
| B27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-148 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-149 | |
| Intracellular solution | |||
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Potassium D-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| NaGTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
| Potassium hydroxide | LabServ | BSPPL738.500 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Extracellular solution | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 310166 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 383147 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Sodium hydroxide | LabServ | BSPSL740.500 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Table 2. Solutions for cell culture and patch clamp. a) Neurobasal media. b) Intracellular solution. c) Extracellular solution. | |||
| Upright microscope | Zeiss | AxioExaminerD1 | Equipped with Dodt contrast |
| Water-immersion objective | Zeiss | W Plan-APOCHROMAT 40x/0.75 | |
| Platform and X-Y stage | ThorLabs | Burleigh Gibraltar | |
| Recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | |
| Vibration isolation table | TMC | Micro-g 63-532 | |
| CCD Camera | Diagnostic Instruments | RT1200 | |
| Camera software | Diagnostic Instruments | SPOT Basic | |
| In-line solution heater | Warner | SH-27B | |
| Temperature controller | Warner | TC-324B | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Patch clamp data acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Micropipette glass | Sutter Instruments | GBF100-58-15 | Borosilicate glass with filament |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P2000 | |
| Recording Software | AxoGraph | Lab pack and electrophysiology tools | |
| Aspirator bottle | Sigma-Aldrich | CLS12201L | 1 L Pyrex aspirator bottle, with outlet for tubing |
| PE Tubing | Harvard | PolyE #340 | |
| Masterflex peristaltic pump | Cole-Parmer | HV-07554-85 | |
| Table 3.Patch clamp equipment. | |||
| 1,870 nm laser diode | Optotech | ||
| 200/220 μm diameter multimode optical fiber patch cord (FC/PC) | AFW Technologies | MM1-FC2-200/220-5-C-0.22 | Light delivery optical fiber, silica core and cladding, 0.22 NA |
| Optical fiber through connector (FC/PC) | Thorlabs | ADAFC2 | |
| Optical fiber cleaver | EREM | FO1 | |
| Optical fiber stripping tool (0.25 - 0.6 mm) | Siemens | For removing optical fiber jacket | |
| Optical fiber stripping tool (0.6 - 1.0 mm) | Siemens | For removing outer coating of patch cord | |
| Signal generator | Any signal generator that can output the necessary pulse shapes and is capable of being externally triggered | ||
| Optical fiber positioner | Custom made positioner. Could substitute with standard micropositioner used for patch clamp experiments | ||
| Optical fiber chuck | Newport | FPH-DJ | |
| Laser power meter and detector head | Coherent | FieldMate (power meter) with LM-3 (detector head) | |
| Table 4. Laser equipment. | |||
References
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