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Immunology and Infection

अनुभवहीन सीडी 4 की adenoviral पारगमन Treg भेदभाव का अध्ययन करने के लिए कोशिकाओं टी

Published: August 13, 2013 doi: 10.3791/50455
Automatic Translation
1, 1
1Institute for Molecular Immunology, Helmholtz Zentrum München

Summary

अनुभवहीन सीडी 4 Coxsackie adenovirus रिसेप्टर की ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति के साथ टी कोशिकाओं में adenoviral जीन स्थानांतरण विनियामक टी सेल भेदभाव की आणविक विश्लेषण सक्षम बनाता है

Abstract

विनियामक टी कोशिकाओं (Tregs) स्वयं करने के साथ ही कुछ विदेशी प्रतिजनों के लिए प्रतिरक्षा सहिष्णुता प्रदान करने के लिए आवश्यक हैं. Tregs TGFβ और आईएल -2 की उपस्थिति में TCR और सह उत्तेजना के साथ इन विट्रो में अनुभवहीन सीडी 4 टी कोशिकाओं से उत्पन्न किया जा सकता है. यह भविष्य के उपचार के लिए अपार क्षमता भालू, तथापि, अणुओं और संकेत दे रास्ते नियंत्रण भेदभाव काफी हद तक अनजान हैं.

प्राथमिक टी कोशिकाओं अस्थानिक जीन अभिव्यक्ति के माध्यम से हेरफेर किया, लेकिन आम तरीकों प्राथमिक प्रतिजन मान्यता के लिए पहले टी सेल की सबसे महत्वपूर्ण भोली राज्य को लक्षित करने के लिए असफल हो सकता है. यहाँ, हम Treg भेदभाव उत्प्रेरण से पहले इन विट्रो में अनुभवहीन सीडी 4 टी कोशिकाओं में अस्थानिक जीन व्यक्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. यह प्रतिकृति की कमी adenovirus साथ पारगमन लागू होता है और अपनी पीढ़ी और उत्पादन बताते हैं. adenovirus बड़ी सम्मिलित करता है (अप करने के लिए 7 केबी) ले जा सकते हैं और उच्च और क्षणिक overexp प्राप्त करने के प्रमोटरों के साथ सुसज्जित किया जा सकता हैटी कोशिकाओं में ression. वे एक ट्रांसजेनिक Coxsackie adenovirus रिसेप्टर (सीएआर) व्यक्त अगर यह प्रभावी रूप से अनुभवहीन माउस टी कोशिकाओं पारगमन. महत्वपूर्ण बात है, संक्रमण के बाद टी कोशिकाओं अनुभवहीन रहना (CD44 कम, CD62L उच्च) और आराम (CD25 - CD69 -) और Tregs में गैर संक्रमित कोशिकाओं के समान सक्रिय और भेदभाव किया जा सकता है. इस प्रकार, इस विधि अपने बहुत शुरू से ही सीडी 4 टी सेल भेदभाव के हेरफेर के लिए सक्षम बनाता है. यह प्रारंभिक TCR उत्तेजना के प्रारंभिक संकेत घटनाओं अंततः भेदभाव Treg में नेतृत्व कि सेलुलर परिवर्तन लाती है कि जब अस्थानिक जीन अभिव्यक्ति जगह में पहले से ही है सुनिश्चित करता है.

Introduction

Tregs प्रतिरक्षा सहिष्णुता बनाए रखने के लिए और overshooting के प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को तर करने के लिए महत्वपूर्ण हैं. Tregs दर्शक टी सेल सक्रियण दबाने. नतीजतन, Tregs की पृथक सक्रिय टी कोशिकाओं 1 द्वारा संचालित घातक autoimmunity और आत्म - विनाश की ओर जाता है. Tregs सीडी 4 एकल सकारात्मक व्यापारियों की नकारात्मक चयन के दौरान थाइमस में विकसित, लेकिन वे भी उपअनुकूलित सह उत्तेजना 1,2 के साथ कम खुराक प्रतिजन उत्तेजना पर अनुभवहीन सीडी 4 टी कोशिकाओं से परिधि में अंतर कर सकते हैं. परिधीय Tregs के पेट या फेफड़ों में सहिष्णुता प्रदान करने में शामिल किया गया है जबकि thymic Tregs, आत्म - एंटीजन के खिलाफ ऊतक स्वक्षमता को दबाने के लिए लग रहे हैं. इन प्रेरित Tregs तेज़ी के साथ भोजन और हवा, खानेवाला बैक्टीरिया, और एलर्जी 3,4 से पर्यावरण एंटीजन सहित म्यूकोसा में विदेशी एंटीजन, की मान्यता के बाद टी सेल सक्रियण को रोकने के. इसके अलावा, Tregs भ्रूण पेप्टाइड्स के लिए मातृ सहिष्णुता 5 स्थापित करने के लिए और पूर्व के लिए महत्वपूर्ण हैंवेंट भ्रष्टाचार बनाम मेजबान रोग 6. इसी समय, Tregs भी 7,8 ट्यूमर कोशिकाओं की प्रतिरक्षा निगरानी attenuating द्वारा अवांछित प्रभाव मध्यस्थता. Tregs की बानगी सुविधा सबसेट-निर्दिष्ट करने प्रतिलेखन कारक Foxp3, आवश्यक और समारोह 9,10 Treg प्रदान करने के लिए पर्याप्त है कि एक कांटा सिर डोमेन युक्त प्रतिलेखन कारक की अभिव्यक्ति है. Foxp3 अभिव्यक्ति को प्रेरित कर सकते हैं कि कुछ संकेत दे रास्ते से जाना जाता है. हालांकि, नियंत्रण, विनियमन, या ट्रिगर टी सेल रिसेप्टर के जवाब में भेदभाव Treg मिलाना आणविक प्रक्रियाओं है कि कम अच्छी तरह से समझ रहे हैं.

Tregs बहुत प्रभावी ढंग से TGFβ और आईएल 2 11 की मौजूदगी में विरोधी CD3 और विरोधी CD28 एंटीबॉडी के साथ अनुभवहीन सीडी 4 टी कोशिकाओं की उत्तेजना के माध्यम से इन विट्रो में प्रेरित किया जा सकता है. उभरते Tregs विवो, Treg भेदभाव को बढ़ावा देने के अणुओं है कि जोड़ - तोड़ में कार्य कर रहे हैं जैसा कि भविष्य therapi के लिए अपार क्षमता भालूतों, उदाहरण के लिए, अस्थमा के उपचार, Crohns रोग, और प्रत्यारोपण 11,12. इसके विपरीत, Treg भेदभाव ब्लॉक करने के अणुओं की चिकित्सकीय मॉडुलन ट्यूमर के रोगियों के संयुक्त उपचार के भविष्य के दृष्टिकोण में लाभ प्रदान कर सकता है.

इन विट्रो भेदभाव assays में टी सेल सबसेट भेदभाव के साथ जुड़े रहे हैं कि आणविक परिवर्तन का वर्णन के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है. फिलहाल, खोज या नियंत्रण टी सेल भेदभाव अस्थानिक जीन अभिव्यक्ति का सबसे आम तरीकों भोले टी कोशिकाओं में विफल है कि इस तथ्य से प्रभावित कर रहे हैं कि जीन उत्पादों के लिए स्क्रीन के लिए प्रयोगात्मक प्रयास. उदाहरण के लिए, electroporation और रेट्रोवायरल पारगमन सक्रिय टी कोशिकाओं में ही प्रभावी हैं. प्रारंभिक उम्मीदों, विश्राम कक्षों में आम तौर पर प्रभावी है जो lentiviral पारगमन, के विपरीत साइटोकिन्स 13 से भोले टी कोशिकाओं की पूर्व सक्रियण की आवश्यकता है. इसके अलावा, electroporation के दौरान सीडीएनए या mRNA का स्थानांतरणखुद टी सेल सक्रियण की सुविधाओं को प्रदान करता है और यहां तक कि सीए 2 + संकेत जुटाने सकता है जो प्लाज्मा झिल्ली के विध्रुवण शामिल और NFAT प्रोटीन (अप्रकाशित अवलोकन और रेफरी. 14) को सक्रिय करें. 40 घंटा - इसी तरह, रेट्रोवायरल पारगमन के लिए, भोले टी कोशिकाओं 18 के लिए सक्रिय करना होता है. इस समय के दौरान, कोशिका विभाजन के पाठ्यक्रम में परमाणु झिल्ली का टूटना होता है और रेट्रोवायरल वेक्टर 15 के बाद जीनोमिक एकीकरण के लिए अनुमति देता है. इन विधियों इसलिए सहायक टी सेल भेदभाव के निर्णायक चरण में है जो प्रतिजन के साथ प्रारंभिक टी सेल मुठभेड़ के प्रारंभिक आणविक विनियमन पता करने में सक्षम नहीं हैं.

Adenoviral पारगमन मानव Coxsackie adenovirus रिसेप्टर (सीएआर) व्यक्त कि मानव कोशिका प्रकार के एक नंबर में क्षणिक अस्थानिक जीन अभिव्यक्ति प्रदान करने के लिए जाना जाता है. यह सेल सक्रियण या सेल चक्र प्रगति के लिए आवश्यकता के बिना आय. सी की सतह अभिव्यक्तिएआर कुशल वायरस लगाव और internalization के लिए आवश्यक है, और एक टी सेल विशिष्ट प्रमोटर के तहत छोटा संस्करण CARΔ1 की ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति adenoviral संक्रमण 16 को अतिसंवेदनशील माउस thymocytes और टी कोशिकाओं को प्रस्तुत करना पाया गया. महत्वपूर्ण बात है, transgene thymocyte विकास को बदल नहीं करता है या अनुभवहीन सीडी 4 की इन विट्रो भेदभाव में विभिन्न सबसेट में कोशिकाओं (नहीं दिखाया डेटा, रेफरी 17.) टी. टी कोशिकाओं की adenovirus की मध्यस्थता पारगमन पहले दृष्टिकोण 19,20 overexpression 17,18 के लिए इस्तेमाल किया और तोड़े नीचे था. ट्रांसजेनिक टी कोशिकाओं को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध DO11.10 टीजी से शुद्ध किया जा सकता है, CARΔ1 टीजी (Taconic, इंक और रेफरी 17.). महत्वपूर्ण बात है, adenoviral पारगमन सक्रियण के स्पष्ट संकेत उत्प्रेरण बिना भोले टी कोशिकाओं में ब्याज की एक जीन की उच्च अभिव्यक्ति की अनुमति देता है. टी कोशिकाओं अनुभवहीन रहना (CD44 कम, CD62L उच्च) और आराम (CD25 - CD69 -) के बाद infectiपर और गैर संक्रमित कोशिकाओं के समान Treg में सक्रिय और भेदभाव किया जा सकता है.

पुनः संयोजक adenoviruses की उत्पादन adenoviral प्लास्मिड (चित्रा 1) के साथ HEK293A कोशिकाओं के अभिकर्मक के बाद प्राप्त किया जा सकता है. ये प्लास्मिड आम तौर पर प्रतिकृति अक्षम पुनः संयोजक एडिनोवायरस 21 रेंडर करने के लिए नष्ट कर दिया E1 और E3 के जीन के साथ मानव प्रकार 5 adenovirus जीनोम होते हैं. वे sheared adenovirus 22 के स्थिर एकीकरण के माध्यम से अमर कर दिया गया है के रूप में HEK293A कोशिकाओं प्रतिकृति कमी के पूरक हैं. Adenoviral वैक्टर बड़े (~ 40 केबी) और फलस्वरूप अच्छी तरह से पारंपरिक प्रतिबंध एंजाइम की मध्यस्थता क्लोनिंग के लिए उपयुक्त नहीं हैं, हम गेटवे सिस्टम कार्यरत हैं. ब्याज की जीन शुरू में यह आसानी से लैम्ब्डा पुनर्संयोजन प्रतिक्रिया (एलआर) 23 के माध्यम से adenoviral गंतव्य वेक्टर में स्थानांतरित किया जा सकता है, जिसमें से एक छोटे प्रविष्टि वेक्टर, में क्लोन है. हम pCAGAdDu वेक्टर निर्माणprocaryotic ccdB चयन मार्कर 24 flanking एलआर साइटों युक्त एक अभिव्यक्ति कैसेट के साथ सीएजी प्रमोटर (चिकन actin के प्रमोटर और सीएमवी बढ़ाने) के संयोजन के द्वारा. यह अभिव्यक्ति कैसेट गोजातीय वृद्धि हार्मोन पाली (ए) के संकेत से युक्त एक दृश्य के लिए जुड़े हुए है जो यूकेरियोटिक संक्रमण मार्कर बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP), के Coexpression की अनुमति देता है कि एक आंतरिक ribosome प्रविष्टि साइट (IRES) तत्व से जुड़े हुए है. Prototypic सीएमवी प्रमोटर अत्यधिक सक्रियण पर निर्भर है और अनुभवहीन टी कोशिकाओं में जीन की अभिव्यक्ति के लिए इसलिए प्रतिकूल हो पाया था, क्योंकि हम कैग सीआईएस नियामक दृश्यों चुना है.

यहाँ, हम इन विट्रो Treg भेदभाव में कुशल के लिए एक प्रोटोकॉल और सक्रियण (चित्रा 2) के बिना अनुभवहीन सीडी 4 टी कोशिकाओं transduce करने के लिए एक तरीका प्रदान करते हैं. विधि अस्थानिक जीन अभिव्यक्ति में सक्षम बनाता है या अनुभवहीन राज्य में पूर्ववर्ती सीडी 4 टी सेल भेदभाव नीचे दस्तक. यह एक overexpresse के प्रभाव का परीक्षण करने की अनुमति देता हैटी सेल सबसेट प्रतिबद्धता तक प्रारंभिक TCR उत्तेजना पर जल्दी संकेत घटनाओं के दौरान ब्याज की घ जीन. हमारी मान्यता प्रयोगों भी Th2 ऐसे Th1 के रूप में अन्य टी सेल सबसेट, Th9, Th17, Th22, या TFH कोशिकाओं के भेदभाव के समान adenovirus आवेदन की स्थापना के लिए आधार प्रदान करते हैं.

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Protocol

1. एक प्रविष्टि वेक्टर में ब्याज की एक जीन की क्लोनिंग

  1. एक प्रवेश वेक्टर में ब्याज की जीन क्लोन. एक topoisomerase युग्मित वेक्टर (जैसे pENTR / डी TOPO) या प्रतिबंध एंजाइम की मध्यस्थता क्लोनिंग इस प्रक्रिया के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है में कुंद अंत बंधाव द्वारा पीछा जीन का पीसीआर प्रवर्धन.

2. PCAGAdDu गंतव्य वेक्टर में ब्याज की जीन स्थानांतरण

  1. एलआर पुनर्संयोजन (जैसे गेटवे एलआर Clonase द्वितीय एनजाइम मिक्स) द्वारा गंतव्य वेक्टर में प्रवेश वेक्टर से ब्याज की जीन स्थानांतरण. इस adenoviral अभिव्यक्ति वेक्टर (चित्रा 1) का निर्माण करेगा.
  2. , एक Paci प्रतिबंध पचाने में adenoviral अभिव्यक्ति वेक्टर की 10 ग्राम Linearize डीएनए वेग और 100 μl प्रति 3 ग्राम की एकाग्रता में पानी में resuspend. Linearization वी की प्रतिकृति और encapsidation के लिए आवश्यक हैं जो वायरल उल्टे दोहराता (आईटीआर), मुक्तवायरस कणों में iral डीएनए.

3. प्राथमिक वायरस lysate के जनरेशन

  1. बीज 1 एक्स 6 अच्छी तरह से थाली की अच्छी तरह से एक में 2 मिलीलीटर सेल संस्कृति मीडिया में 10 5 HEK293A कोशिकाओं (DMEM, 10% FBS, 5% PenStrep) और 6 के लिए कोशिकाओं को सेते - 37 पर 14 घंटे एक 10% में डिग्री सेल्सियस सीओ 2 इनक्यूबेटर उन्हें पालन करने के लिए अनुमति देने के लिए. कोशिकाओं तो confluency लगभग 50% से कम होना चाहिए.
  2. Lipofection: स्थानांतरण NaCl 50 माइक्रोन, भंवर संक्षिप्त के 94 μl में jetPEI अभिकर्मक के 6 μl. Vortexing जबकि 100 μl linearized adenovirus वेक्टर के लिए मिश्रित समाधान जोड़ें और 15 के लिए इस अभिकर्मक मिश्रण सेते - कमरे के तापमान पर 30 मिनट.

Adenovirus संक्रमण के लिए उपयुक्त जैव सुरक्षा शर्तों के तहत सभी निम्न चरणों को पूरा करें!

  1. HEK293A सेल युक्त अच्छी तरह पर dropwise समाधान बांटना और 37 में कोशिकाओं सेते डिग्री सेल्सियस और 10% सीओ 2. एक प्रतिदीप्ति मार्कर का उपयोग करते समय, transfe का मूल्यांकननेत्रहीन 12 के बाद ction दक्षता - एक औंधा प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर 36 घंटा. ताजा माध्यम से 0.5 मिलीग्राम हर 3 दिन में जोड़ें.
  2. अलग करने के लिए शुरू कि बढ़े और गोल कोशिकाओं के साथ क्षेत्र हैं जो कोशिकाविकृति संबंधी प्रभाव (सीपीई), के लिए एक प्रकाश या प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के साथ 3 दिन - हर 2 की जाँच करें. यह कुशल वायरस पीढ़ी का संकेत है. सीपीई के व्यापक क्षेत्रों (चित्रा 3) की घटना होने पर, यह 24 ले जाएगा - 72 घंटे सभी कोशिकाओं को संक्रमित कर रहे हैं पहले.
  3. सभी कोशिकाओं सीपीई के लक्षण दिखा, लेकिन कोशिकाओं की एक समग्र टुकड़ी से पहले होता है, सतह पर तैरनेवाला के साथ कोमल pipetting और हस्तांतरण कोशिकाओं (एस एन, 3 - 5 मिलीलीटर) द्वारा कोशिकाओं को अलग जब एक 15 मिलीलीटर polystyrene ट्यूब के लिए.
  4. 15 के लिए सूखी बर्फ पर एसएन में कोशिकाओं रुक - 20 मिनट और टूटना कोशिकाओं डिग्री सेल्सियस बाद में 37 में उन्हें जल्दी से पिघलना. इस फ्रीज और पिघलना चक्र (एफ / टीसी) और दो बार दोहराएँ. एक दिन के भीतर उपयोग के लिए बर्फ पर प्राथमिक वायरस lysate रखें या -80 डिग्री सेल्सियस लंबी अवधि के भंडारण के लिए यह फ्रीज. कोई अतिरिक्त एफ/ टीसी 30 से वायरस टिटर कम हो जाएगा - 50%.

4. वायरस प्रवर्धन

  1. बीज और एक 14 सेमी टिशू कल्चर पकवान पर 90% संगम HEK293A कोशिकाओं को विकसित.
  2. प्राथमिक वायरस lysate (1.5 - 2.5 मिलीलीटर) के आधे के साथ कोशिकाओं को संक्रमित और कम से कम 36 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते हैं. लगभग सभी कोशिकाओं प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा निर्धारित किया जा सकता है, तो संक्रमित किया जाना चाहिए. एक पहले से ही (अधिक केंद्रित अर्थात्) प्रवर्धित वायरस शेयर की फिर से प्रवर्धन के लिए, 50 के संक्रमण की बहुलता (MOI) (6.3 देखें) पर HEK293A संक्रमित.
  3. उन सभी को सीपीई दिखा लेकिन टुकड़ी से पहले जब कोशिकाओं को काटा जाना चाहिए. कुशल वायरस उत्पादन के साथ इस राज्य के संक्रमण के बाद 48 घंटे के भीतर पहुँच जाता है. (यह एक सप्ताह तक लग जाते हैं, 4.2 में वर्णित संक्रमण के लिए इस्तेमाल किया adenovirus स्टॉक की मात्रा में वृद्धि से प्रवर्धन के दूसरे दौर पर विचार करें.)
  4. एक 50 मिलीलीटर polystyrene ट्यूब को कोमल pipetting और हस्तांतरण कोशिकाओं और एस.एन. द्वारा कोशिकाओं को अलग. 4 में 10 मिनट डिग्री सेल्सियस के लिए 300 XG पर कोशिकाओं स्पिन
  5. एस.एन. निकालें और मध्यम या एस.एन. (सी ए 1 मिलीलीटर) की एक उपयुक्त मात्रा में गोली resuspend.
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 800 XG पर कोशिकाओं और अपकेंद्रित्र को बाधित करने के लिए 3 एफ / टीसी प्रदर्शन करना (केंद्रित वायरस lysate अर्थात्) वायरस कणों जिसमें एस.एन. उतारो, और विभाज्य वायरस lysate -80 में यह स्टोर करने के लिए डिग्री सेल्सियस

5. वायरस टिटर निर्धारण

  1. बीज 10 5 A549 कोशिकाओं प्रति कुएं में 1 मिलीलीटर मध्यम और कोशिकाओं को 6 घंटे के लिए पालन जाने में एक 12 अच्छी तरह से थाली के 5 कुओं.
  2. मध्यम में एक धारावाहिक कमजोर पड़ने (1:5,000, 1:10,000, 1:50,000, 1:100,000) प्रदर्शन और अच्छी तरह से प्रति 10 μl जोड़ने के लिए केंद्रित adenovirus (बर्फ पर thawed) की 1 μl का प्रयोग करें. प्रवाह cytometry में gating को समायोजित करने के लिए एक अच्छी तरह असंक्रमित छोड़ दें.
  3. 36 घंटे के बाद, पीबीएस और खुली कोशिकाओं (जैसे trypsinization द्वारा) के साथ धोने, एस.एन. दूर ले. Biohazard सावधानियों के लिए, यह ग तय करने के लिए सिफारिश की है10 कमरे के तापमान पर मिनट और पीबीएस एक समय के साथ धोने के लिए पीबीएस में 100 μl 4% paraformaldehyde में Ells.
  4. संक्रमण मार्कर अभिव्यक्ति का एक FACS विश्लेषण करते हैं. प्लॉट संक्रमित कोशिकाओं की निरपेक्ष संख्या (चित्रा 4) के खिलाफ 'μl वायरल lysate लागू'. संक्रमण के रैखिक सीमा निर्धारित करें और एक्स = 1000 μl का उपयोग कर रैखिक सीमा पर मानक वक्र से undiluted वायरस के मिलीलीटर प्रति अनुमापांक गणना.

6. टी सेल संक्रमण

  1. से आराम / भोले CD4 टी कोशिकाओं को अलग DO11.10 टीजी, एमएसीएस (अनुभवहीन सीडी 4 + टी सेल अलगाव किट द्वितीय) या FACS छँटाई का उपयोग कर CARΔ1 टीजी चूहों (सीडी 4 + CD25-CD62L + CD44-).
  2. छोटे पैमाने पर प्रयोगों के लिए, एक 96 अच्छी तरह गोल नीचे की थाली की अच्छी तरह से एक में एक MOI के 50 के लक्ष्य को हासिल करने के लिए वायरल lysate के एक उचित मात्रा विंदुक.
  3. टी सेल के माध्यम में 50 μl के अंतिम संक्रमण मात्रा (RPMI1640, 10% FBS, 5% PenStrep, 5% NaPyruvate, 1x NEAA, 1x सदस्य आवश्यक में 4 एक्स 5 10 टी कोशिकाओं के लिए ऊपर जोड़ेंविटामिन, 1x एल Glutamine, 1:250,000 mercaptoethanol, 10 मिमी HEPES).
    उदाहरण:
    एक MOI के 50 में से 3 एक्स 5 10 टी कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा; वायरल अनुमापांक 3 एक्स 9 10 मिलीलीटर -1 है
    वायरस मात्रा = MOI के एक्स टी / सेल नंबर / वायरल अनुमापांक = 50 एक्स (3 एक्स 10 5) (3 एक्स 10 9 मिलीलीटर -1) = 0.005 मिलीग्राम

नोट: ढीला कप (ट्यूब प्रति टी.पी. 3 मिलीलीटर) के साथ एक polystyrene ट्यूब में 10 6 भोले टी कोशिकाओं प्रति 165 μl के संक्रमण की मात्रा में एक MOI के 50 का उपयोग करने को बड़ा सेल नंबर, पैमाने के संक्रमण के लिए.

  1. एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 90 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते हैं.
  2. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर कोशिकाओं स्पिन, 200 μl पीबीएस में resuspend एस.एन., दूर ले. फिर अपकेंद्रित्र और एस.एन. दूर ले.

(वैकल्पिक: कोशिकाओं को और अधिक कुशलता से वायरस को दूर करने के लिए फिर से धोया जा सकता है)

  1. Resuspend कोशिकाओं200 μl टी सेल उत्तेजक एंटीबॉडी के बिना और आईएल -2 या अन्य साइटोकिन्स बिना मध्यम और 37 पर 40 घंटे के लिए उन्हें आराम में एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में डिग्री सेल्सियस सक्रियण से पहले ब्याज की जीन की अभिव्यक्ति के लिए.

7. टी सेल सक्रियण और ध्रुवीकरण

  1. एक की मात्रा विरोधी CD3 और एक छोटे अभिकर्मक कप में सेल नंबर (उदाहरण के लिए 4 एक्स 10 5) के बराबर होती है कि विरोधी CD28 युग्मित मोती पिपेट, पीबीएस के 10 गुना मात्रा जोड़ने और 2 मिनट के लिए एक चुंबक पर डाल . तैरनेवाला उतारो और 200 μl ध्रुवीकरण मध्यम में मोती (Tregs के लिए: टी सेल के माध्यम 1 एनजी / एमएल TGFβ, 100 यू / एमएल आईएल -2) resuspend.

नोट: कोशिकाओं को भी विरोधी CD28 और विरोधी CD3 एंटीबॉडी के साथ लेपित टिशू कल्चर व्यंजन का उपयोग कर सक्रिय किया जा सकता है, या ovalbumin 323-339 पेप्टाइड प्रतिजन के साथ स्पंदित विकिरणित BALB / ग splenocytes का उपयोग कर एक DO11.10 टी सेल रिसेप्टर विशिष्ट ढंग से.

  1. Centrifugई से पहले के रूप में कोशिकाओं विश्राम किया, 200 युक्त μl ध्रुवीकरण मध्यम विरोधी CD3 और विरोधी CD28 एंटीबॉडी युग्मित मोतियों में एस.एन. और resuspend कोशिकाओं से दूर ले. मध्यम बदलने के बिना एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस से कम 72 घंटे के लिए सेते हैं.

8. टी सेल फिक्सेशन और फ्लो के लिए धुंधला

  1. कोशिकाओं को धो लें: कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर कोशिकाओं स्पिन, 200 μl पीबीएस में resuspend एस.एन., दूर ले. फिर अपकेंद्रित्र और एस.एन. दूर ले. तदनुसार सभी निम्न धोने चरणों को पूरा करें.
  2. 100 μl फिक्स मृत सेल धुंधला समाधान में कोशिकाओं Resuspend और 4 बजे 30 मिनट के लिए सेते डिग्री सेल्सियस
  3. कोशिकाओं को धो लें, 100 μl पीबीएस में resuspend, पीबीएस, आरटी पर सेते 15 मिनट में 100 μl 4% paraformaldehyde जोड़ें.
  4. कोशिकाओं को धो लें, पीबीएस में 200 μl बर्फ ठंड 70% मेथनॉल में उन्हें resuspend और बर्फ पर 30 मिनट के लिए सेते हैं.

नोट: प्रकोष्ठों biohazard एहतियात के बिना अब से इलाज किया जा सकता!

  1. 60 μl के मास्टर मिश्रण 60 μl पीबीएस + 10 माइक्रोग्राम / एमएल एफसी ब्लॉक (unspecific बाध्यकारी ब्लॉक करने के लिए विरोधी FCR3). तैयार कोशिकाओं को धो लें, पीबीएस + विरोधी FCR3 के 40 μl में उन्हें resuspend और आरटी पर 15 मिनट सेते हैं.
  2. के 20 μl जोड़ें पीबीएस + विरोधी FCR3 1 ग्राम पीई युग्मित विरोधी Foxp3 एंटीबॉडी युक्त, डिग्री सेल्सियस रात में 4 में अच्छी तरह से मिलाएं और सेते हैं.
  3. पीबीएस में दो बार कोशिकाओं को धो लें और एक प्रवाह cytometer पर कोशिकाओं का विश्लेषण.

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Representative Results

वायरस उत्पादन

उच्च वायरस titers की पीढ़ी के लिए, प्राथमिक वायरस उत्पादन या वायरस प्रवर्धन में HEK293A सेल फसल का समय महत्वपूर्ण है. वायरस उत्पादन के दृश्य संकेत के साथ प्रतिनिधि फ्लोरोसेंट और चरण विपरीत छवियों 3 चित्र में दिखाया जाता है. सीपीई 10 दिनों डालने के बिना एक नियंत्रण pCAGAdDu वेक्टर साथ HEK293A कोशिकाओं के अभिकर्मक के बाद मनाया गया. सीपीई संक्रमण मार्कर GFP की उच्च अभिव्यक्ति अलग और प्रदर्शन करने के लिए शुरू कि बढ़े और दौर की कोशिकाओं के साथ क्षेत्रों की उपस्थिति की विशेषता है. सीपीई की हद तक कुशल वायरस पीढ़ी का संकेत है. सेल संस्कृति समान सीपीई 24 भीतर काटा जा सकता है दिखा प्लेटें - 72 घंटे, और एक कच्चे वायरस lysate फ्रीज और पिघलना चक्र द्वारा उत्पन्न किया जा सकता है. वायरस टिटर तो (चित्रा 4) MOI के एक बराबर के साथ संक्रमण की तुलना करने के लिए वायरस lysate के धारावाहिक कमजोर पड़ने से निर्धारित किया जा सकता है. रेखीय श्रृंखला, टी के भीतरवह प्रतिगमन विश्लेषण समीकरण मिलीलीटर undiluted वायरस lysate प्रति संक्रामक कणों की संख्या की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण में, एक्स के लिए अनुमापांक = 1 μl 30016535 μl -1 ≈ 3 एक्स 10 10 मिलीलीटर -1 है.

टी सेल सक्रियण और भेदभाव पर adenovirus संक्रमण के प्रभाव का मूल्यांकन

लक्ष्य कोशिकाओं पर adenovirus पारगमन का प्रभाव केवल IRES-GFP (चित्रा 5a) व्यक्त किया कि एक adenoviral नियंत्रण सदिश का उपयोग बढ़ रही Mois साथ अनुभवहीन सीडी 4 टी कोशिकाओं को संक्रमित द्वारा मूल्यांकन किया गया है. संक्रमण दक्षता भेदभाव Treg के शामिल होने के बाद तय की टी सेल के नमूनों में 72 घंटा GFP सकारात्मक कोशिकाओं का निर्धारण FACS विश्लेषण द्वारा मापा गया था. GFP सकारात्मक कोशिकाओं की दर MOI के संक्रमण के लिए इस्तेमाल के साथ वृद्धि हुई है और एक MOI के 50 में से कम 84% संक्रमण पर पहुंच गया. MOI का उपयोग करते समय हम संक्रमित टी कोशिकाओं की बहुत उच्च प्रतिशत प्राप्त नहीं है 50 (नहीं दिखाया डेटा) से अधिक. हालांकि infection दक्षता हित के जीन पर निर्भर करता है, एक आम तौर पर एक MOI 50 की कोशिकाओं के 50% से अधिक संक्रमित कर सकता है भिन्न हो सकते हैं. Mois में 1 और 50 के बीच सेल व्यवहार्यता (चित्रा 5 ब) प्रभावित नहीं था. महत्वपूर्ण बात है, Tregs में भोले टी कोशिकाओं की उत्तेजना और भेदभाव गैर संक्रमित कोशिकाओं (चित्रा 5c) की तुलना में संक्रमित में समान था. Adenovirus पारगमन का एक महत्वपूर्ण संपत्ति टी सेल सक्रियण प्रदान करने या आवश्यकता के बिना अनुभवहीन और आराम टी कोशिकाओं को संक्रमित करने की क्षमता है. यह टी सेल सक्रियण (CD25, CD69, CD44) और के साथ या adenovirus संक्रमण के बिना और एक 5% सीओ में 37 डिग्री सेल्सियस से कम 40 घंटे के लिए आराम कर नमूने में अनुभवहीन (CD62L) टी कोशिकाओं के मार्कर के मार्कर के विश्लेषण से स्पष्ट है 2 इनक्यूबेटर (चित्रा 6). इन विट्रो टी सेल के साथ सक्रियण विरोधी CD3 और विरोधी CD28 युग्मित मोतियों में इससे पहले, संक्रमित और असंक्रमित टी कोशिकाओं इसी तरह CD25 कम, CD69 कम और CD44 एल थेओउ लेकिन उनके अनुभवहीन और आराम की स्थिति का प्रदर्शन CD62L उच्च, (चित्रा 6, ऊपरी पैनल). टी सेल सक्रियण पर, संक्रमित कोशिकाओं सक्रियण मार्कर CD25, CD69 और असंक्रमित कोशिकाओं (चित्रा 6, कम पैनल) से लगभग पृथक CD62L के डाउनरेगुलेशन की upregulation दिखाया. इस प्रकार, टी कोशिकाओं की सक्रियता स्थिति adenovirus संक्रमण से बदल नहीं है. 20% मृत कोशिकाओं को 40 घंटे आराम के बिना सक्रियण के बाद - आराम चरण 10 की तुलना में वृद्धि कारक या साइटोकिन्स के अभाव की वजह से कोशिकाओं के 60 से 70% के नुकसान के साथ जुड़ा हुआ है. 3 x 10 5 कोशिकाओं की प्रारंभिक सेल नंबर का चयन करते समय यह ध्यान में रखा गया था.

ब्याज की एक जीन की Overexpression स्तर का मूल्यांकन

Adenoviral जीन स्थानांतरण द्वारा हासिल की overexpression की राशि का मूल्यांकन करने के लिए, हम microRNA-155 (मीर 155) भोले टी कोशिकाओं में अभिव्यक्ति के स्तर को निर्धारित करने की मांग की है कि हममीर 155 व्यक्त या नियंत्रण adenovirus या असंक्रमित छोड़ दिया गया है से संक्रमित हो. इस परिपक्व miRNA भोले टी कोशिकाओं में मध्यम स्तर पर व्यक्त की है और दृढ़ता से टी सेल सक्रियण पर प्रेरित हो जाता है के बाद से हम मीर 155 चुना है. इसके अलावा, यह टी सेल पर निर्भर त्रिदोषन प्रतिक्रियाओं 25,26 में एक महत्वपूर्ण भूमिका है.

microRNA overexpression के स्तर qPCR के द्वारा मूल्यांकन किया गया था. संक्रमण के बाद, कोशिकाओं, 40 घंटे के लिए विश्राम किया गया 40 घंटे के लिए सक्रिय है, या सक्रियण के 40 घंटे के द्वारा पीछा किया 40 घंटा विश्राम किया. आराम 40 घंटा, मीर 155 एन्कोडिंग वायरस से संक्रमित भोले टी कोशिकाओं नियंत्रण वायरस या गैर संक्रमित कोशिकाओं (चित्रा 7) से संक्रमित कोशिकाओं की तुलना में मीर 155 के एक लगभग 17 गुना overexpression के प्रदर्शित होने के बाद. यह लगभग हद मिलान अंतर्जात मीर 155 टी सेल सक्रियण (7 चित्रा और रेफरी. 25,27) के बाद प्रेरित है, जो करने के लिए. बावजूद कोशिकाओं, मीर 155 के स्तर अंतर्जात के इस मजबूत प्रेरण के मील से संक्रमितआर 155 adenovirus अभी भी वायरस से संक्रमित या गैर संक्रमित कोशिकाओं पर नियंत्रण की तुलना सक्रियण पर मीर 155 की अभिव्यक्ति में चार गुना वृद्धि के बारे में पता चला. अस्थानिक overexpression की मनाया स्तर अन्य microRNAs (नहीं दिखाया डेटा) के लिए तुलनीय था. बड़े आवेषण के लिए, overexpression कम प्रभावी हो सकता है कि कृपया ध्यान दें.

टी सेल भेदभाव का विश्लेषण

डेटा विश्लेषण कई तरीकों से किया जा सकता है. नियंत्रण कक्ष (ब्याज की जीन के बिना एक सदिश का उपयोग संक्रमित कोशिकाओं) का एक ही GFP सकारात्मक गेट में भेदभाव की तुलना में ब्याज की एक जीन (संक्रमित कोशिकाओं में यानी) के GFP सकारात्मक गेट में भेदभाव का विश्लेषण पर्याप्त अंतर का पता लगाने के लिए पर्याप्त है. ब्याज की एक जीन की अधिक सूक्ष्म प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, हम एक ही अच्छी तरह से (8 चित्रा) से गैर संक्रमित कोशिकाओं के साथ संक्रमित कोशिकाओं में भेदभाव की तुलना में है. ये एक आंतरिक विवाद के रूप में सेवामैं और एक अच्छी तरह से अंदर "रिश्तेदार भेदभाव" की गणना करने के लिए उपयोग किया जा सकता है. एक वायरस भेदभाव पर कोई प्रभाव नहीं है, तो "रिश्तेदार भेदभाव" आदर्श रूप में 1 हो जाएगा. हमारे हाथ में नियंत्रण वायरस के लिए रिश्तेदार भेदभाव 0.9-1.1 की एक सीमा है. रिश्तेदार भेदभाव केवल वायरस से संक्रमित नमूनों को नियंत्रित करने के लिए ब्याज संक्रमित नमूने जीन की तुलना करने के लिए लागू किया जाना चाहिए.

चित्रा 1
चित्रा 1. Adenovirus पीढ़ी के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. एंट्री वैक्टर (pENTR) पुनर्संयोजन दाता साइटों (AttL1, AttL2), ब्याज की जो दिशा एक जीन होते हैं. गंतव्य वेक्टर pCAGAdDu ई. में नकारात्मक चयन के लिए विष CcdB जीन flanking पुनर्संयोजन लक्ष्य साइटों (AttR1, AttR2) शामिल ब्याज की जीन की जगह है जो कोलाई,एलआर पुनर्संयोजन के माध्यम से. गंतव्य वेक्टर भी प्रतिकृति की कमी पुनः संयोजक एडिनोवायरस उत्पन्न करने के लिए हटा दिया गया है जो E1/E3 जीन के बिना एक मानव प्रकार 5 adenovirus जीनोम होता है. Paci linearization adenoviral जीन संक्रामक उत्पन्न करने के लिए सहन कि HEK293A कोशिकाओं में अभिकर्मक पहले उलटा दोहराता (आईटीआर) मुक्त adenovirus कणों कोशिकाविकृति संबंधी प्रभाव में है कि परिणाम. Adenovirus फ्रीज और पिघलना चक्र से उत्पादक कोशिकाओं से काटा जाता है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2. टी सेल संक्रमण और भेदभाव की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. भोले टी कोशिकाओं पंजाब के साथ धोया, 1.5 घंटे के लिए एक adenovirus lysate से संक्रमित थे एस और 37 पर 40 घंटे के लिए टी सेल मध्यम ° एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में सी में विश्राम किया. कोशिकाओं तो TGFβ और आईएल -2 की मौजूदगी में विरोधी CD28 और विरोधी CD3 एंटीबॉडी मिलकर मोती का उपयोग कर 72 घंटे के लिए सक्रिय थे. फिक्स्ड और दाग कोशिकाओं FACS द्वारा विश्लेषण किया गया है, और संक्रमित बनाम गैर संक्रमित कोशिकाओं में Foxp3 की अभिव्यक्ति निर्धारित किया गया था.

चित्रा 3
चित्रा 3. कोशिकाविकृति संबंधी linearized pCAGAdDu वेक्टर के 3 एनजी के साथ 10 5 HEK293A कोशिकाओं के अभिकर्मक के बाद सुबह दस बजे सीपीई के adenovirus उत्पादक HEK293A कोशिकाओं. घटना का प्रभाव. बाईं पैनल चरण विपरीत छवि को दर्शाता है, सही पैनल हरी प्रतिदीप्ति से पता चलता है.

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4 चित्रा. A549 कोशिकाओं के संक्रमण से adenovirus lysates की अनुमापांक निर्धारण. 10 5 A549 कोशिकाओं, संकेत वायरस कमजोर पड़ने से संक्रमित 48 घंटे के लिए incubated और प्रवाह cytometry द्वारा संक्रमण मार्कर GFP की अभिव्यक्ति के लिए विश्लेषण किया गया. GFP सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या का इस्तेमाल वायरस की राशि के खिलाफ साजिश रची है. undiluted वायरस की अनुमापांक एक्स = 1000 μl का उपयोग कर रैखिक सीमा पर मानक वक्र से गणना की है.

चित्रा 5
चित्रा 5. एक MOI के 1 के पर adenovirus संक्रमण - 50 टी सेल व्यवहार्यता या Treg भेदभाव पर कोई प्रभाव नहीं है भोले टी कोशिकाओं DO11.10 टीजी से शुद्ध, CARΔ1 टीजी चूहों अलग Mois पर adenovirus से संक्रमित थे.90 मिनट के लिए, पीबीएस के साथ धोया और टी सेल के माध्यम में 40 घंटे के लिए विश्राम किया. कोशिकाओं को 72 घंटे के लिए ध्रुवीकरण की स्थिति Treg में सक्रिय थे. फिक्स्ड और दाग कोशिकाओं मृत सेल डाई का समावेश (ख), संक्रमण मार्कर GFP (एक) की और भेदभाव मार्कर Foxp3 (ग) की अभिव्यक्ति के लिए विश्लेषण किया गया. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 6
6 चित्रा. Adenovirus संक्रमण टी कोशिकाओं की सक्रियता की स्थिति में परिवर्तन नहीं करता DO11.10 टीजी से भोले टी कोशिकाओं;. CARΔ1 टीजी चूहों, 90 मिनट (लाइनें) या (क्षेत्रों) बाएं असंक्रमित के लिए एक MOI के 50 में से कम से adenovirus से संक्रमित पीबीएस के साथ धोया गया और 40 घंटे के लिए विश्राम किया. प्रकोष्ठों expre लिए विश्लेषण किया गयासक्रियण मार्कर से पहले (ऊपरी पैनल) और ध्रुवीकरण की स्थिति Treg में सक्रियण के बाद (कम पैनल) 40 घंटे के ssion.

7 चित्रा
चित्रा 7. . से मीर 155 overexpression के पहले और टी सेल सक्रियण के बाद रिश्तेदार भोले टी कोशिकाओं DO11.10 टीजी, CARΔ1 टीजी चूहों microRNA-155 के साथ एक MOI के 50 में से कम से संक्रमित थे (मीर 155) व्यक्त या नियंत्रण adenovirus, या असंक्रमित छोड़ दिया. कोशिकाओं तो, 40 घंटे के लिए विश्राम किया 40 घंटे के लिए सक्रिय है, या 40 घंटे सक्रियण द्वारा पीछा 40 घंटा विश्राम किया गया. MicroRNA-155 की अभिव्यक्ति qPCR के द्वारा SnoRNA202 के सापेक्ष निर्धारित किया गया था.

8 चित्रा
सकारात्मक (यानी संक्रमित कोशिकाओं) में कोशिकाओं Foxp3 के प्रतिशत के सापेक्ष व्यक्त की है + कोशिकाओं GFP नकारात्मक (गैर संक्रमित) कोशिकाओं में. ब्याज की overexpressed जीन भिन्नता Treg पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा तो सापेक्ष भेदभाव, 1 के बराबर होती है. 1 नीचे मूल्यों निरोधात्मक प्रभाव से संकेत मिलता है जबकि 1 से ऊपर मान, भेदभाव पर एक को बढ़ावा देने के प्रभाव का संकेत मिलता है.

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Discussion

वायरस जनरेशन और अनुमापन

इष्टतम अभिकर्मक परिणामों के लिए, linearized वेक्टर की गुणवत्ता और मात्रा को सबसे महत्वपूर्ण दिखाई देते हैं. संक्रमण जल्दी से एक बार कुशल वायरस उत्पादन होता है आगे बढ़ना होगा क्योंकि हम संस्कृति का एक प्रारंभिक अतिवृद्धि से प्राथमिक lysate उत्पादन पर नकारात्मक प्रभाव का पालन नहीं किया. हालांकि, HEK293A कोशिकाओं से वायरस उत्पादन क्षमता कम होती है कि लंबे समय सम्मिलित करता है से प्रभावित किया जा सकता है. कुछ खुला पढ़ने फ्रेम वास्तव में वायरस उत्पादन के साथ हस्तक्षेप करने के लिए पाए गए. ये वायरल शेयरों आमतौर प्रवर्धन के कई दौर के माध्यम से बचाया जा सकता है, और केवल कुछ ही खुला पढ़ने फ्रेम वायरस उत्पादन के साथ असंगत होना पाया गया है. 5 एक्स 10 10 संक्रामक कणों / मिलीलीटर - हमारे अनुभव से, वायरस प्रवर्धन के लिए संक्रमण के बाद 48 घंटे के भीतर सीपीई की उपस्थिति आमतौर पर के बारे में 1 एक्स 10 9 में से एक वायरल lysate निकलेगा.

भोले टी कोशिकाओं की adenoviral संक्रमण

भोले टी कोशिकाओं की adenoviral संक्रमण उत्तेजना से पहले और बाद टी कोशिकाओं की सक्रियता स्थिति बदल नहीं है. इस पारगमन प्रणाली पर प्रारंभिक TCR उत्तेजना से टी सेल भेदभाव का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली प्रायोगिक उपकरण बनाती है. सेल अब भी अनुभवहीन है और सक्रियण के संकेत नहीं दिखा है जब हम कुशल अस्थानिक संक्रमण के बाद ब्याज की जीन की अभिव्यक्ति और एक समय में 40 घंटे के लिए टी कोशिकाओं की 'आराम' निर्धारित किया है. यह बाद में टी सेल सक्रियण के दौरान, ब्याज की जीन पहले से ही overexpressed है और शुरू से ही टी सेल भेदभाव पर इसके प्रभाव डालती सकता है. इस प्रकार, adenoviral पारगमन इलेक्ट्रोपोरेशन या सक्रियण की आवश्यकता होती है और केवल प्रारंभिक TCR संकेत 15,28 के बाद ब्याज की एक जीन है कि एक्सप्रेस रेट्रोवायरल पारगमन पर एक स्पष्ट लाभ है. भेदभाव की देर पहलुओं का विश्लेषण किया और किया जाएगा लेकिन, अगर ब्याज की जीन की अभिव्यक्ति प्रारंभिक टी सेल activ के पहले की आवश्यकता नहीं हैसमझना, भोले टी कोशिकाओं के रूप में अच्छी तरह से adenoviral पारगमन के बाद सीधे प्रेरित किया जा सकता है. Adenoviral संक्रमण बहुत ही कुशल है, यह इस तरह Thy1.1 या hCD2 के रूप में अन्य संक्रमण मार्करों व्यक्त कि एडिनोवायरस साथ डबल संक्रमण के प्रदर्शन से ब्याज की दो जीनों की सहकारी गतिविधियों का अध्ययन करने के लिए बढ़ाया जा सकता है. बाद में भी एंटीबॉडी सतह धुंधला करने के लिए सुलभ है और निर्धारण के दौरान मार्कर संरक्षण में कठिनाइयों को दरकिनार कर सकते हैं. सक्रिय टी कोशिकाओं में, हालांकि, adenoviral संक्रमण एक बहुत कम क्षमता है, और electroporation या रेट्रोवायरल पारगमन तरीकों अनुकूल हो सकता है. Adenovirus के आवेदन के लिए एक और चेतावनी है कि अभिव्यक्ति की क्षणिक चरित्र है. Adenovirus सेल के परमाणु मैट्रिक्स से जुड़ी एक episome के रूप में बनाए रखा है और टी कोशिकाओं टी सेल सक्रियण (डेटा नहीं दिखाया., रेफरी 17) के बाद पांच से सात दिन के भीतर मार्कर जीन अभिव्यक्ति के नुकसान के लिए अग्रणी पैदा करना ही पतला हो जाएगा. इसके अलावा, कोशिकाओं readil हैं adenovirus-transducedवाई माउस में टी कोशिकाओं के दत्तक हस्तांतरण प्रयोगों में, उदाहरण के लिए, vivo में इसके उपयोग की सीमा है, जो एक अक्षुण्ण प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा मान्यता प्राप्त है और सफाया कर दिया. Adenoviral प्रणाली का एक अन्य संभावित आवेदन DO11.10 टीजी से अलग Treg कोशिकाओं का संक्रमण हो सकता है, CARΔ1 टीजी चूहों Treg समारोह या वंश स्थिरता पहलुओं का अध्ययन करने के लिए.

संक्रमित कोशिकाओं पर एडिनोवायरस प्रभाव की मान्यता

Adenovirus संक्रमण कुशल था और टी सेल व्यवहार्यता और Treg भेदभाव पर लगभग कोई प्रभाव था. एक MOI के 50 से कम है, हम टी कोशिकाओं पर adenovirus संक्रमण के प्रतिकूल प्रभाव को देख बिना सबसे अच्छा संक्रमण दक्षता प्राप्त की. इस प्रणाली आम तौर पर ब्याज की जीन की अभिव्यक्ति के बिना खाली adenovirus का उपयोग कर अनुमापन प्रयोगों द्वारा, अन्य सेल संस्कृति या भेदभाव हालत के लिए लागू किया जाता है जब भी इसी तरह स्थापित हो गया है. जैसे adenoviral संक्रमण, प्रयोग के परिणाम को प्रभावित करता है, तोखाली adenovirus साथ रुचि रखनेवाला adenovirus के जीन की तुलना में अभी भी ब्याज की हस्तांतरित जीन के प्रभाव को उजागर करने के लिए उपयुक्त है. Adenoviral संक्रमण का कोई असर नहीं है, तो मापा पैरामीटर भी एक ही नमूने के असंक्रमित और संक्रमित कोशिकाओं के बीच तुलना की जा सकती है.

डेटा विश्लेषण

यहाँ वर्णित निर्धारण विधि संक्रमण मार्कर GFP के साथ एक साथ भेदभाव मार्कर Foxp3 का एक साथ विश्लेषण की अनुमति देता है, एक 'रिश्तेदार भेदभाव' निर्धारित किया जा सकता है. यह खाते में अच्छी तरह से अच्छी तरह से विविधताओं लेता है के बाद से एक नमूना भीतर दो आबादी के इस विश्लेषण के दो नमूनों के बीच थोक आबादी तुलना से सूक्ष्म प्रभाव के लिए उच्च संवेदनशीलता है. अच्छी तरह से व्यापक प्रभाव, एक स्रावित कारक द्वारा लगाए जाने जैसे प्रभावों, उपेक्षित किया जाएगा हालांकि, जबकि संक्रमित कोशिकाओं को आंतरिक केवल प्रभाव, इस विधि द्वारा मान्यता प्राप्त हो जाएगा. रिश्तेदार भेदभाव प्रत्येक में नियंत्रित किया जाना चाहिएभेदभाव पर संक्रमण खुद के प्रभाव को बाहर करने के लिए नियंत्रण से संक्रमित कोशिकाओं को शामिल करके प्रयोग. उच्च संक्रमण दर कई नमूनों के बीच थोक तुलना में अनुकूल हैं जबकि इष्टतम परिणामों के लिए, एक नमूना भीतर असंक्रमित कोशिकाओं को संक्रमित के एक लगभग समान दर, के लिए उद्देश्य से किया जाना चाहिए.

इन विट्रो भेदभाव प्रोटोकॉल में साथ संयुक्त adenovirus का उपयोग कर भोले टी कोशिकाओं में निष्कर्ष, जीन स्थानांतरण में भेदभाव Treg के आणविक आधार की जांच के लिए एक शक्तिशाली प्रणाली है. यह ज्ञान की पीढ़ी एलर्जी और autoimmune रोग के खिलाफ चिकित्सकीय दृष्टिकोण में Tregs द्वारा प्रदत्त प्रमुख सहिष्णुता का फायदा उठाने के लिए अनुमति दे सकता है.

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Disclosures

लेखक ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा.

Acknowledgments

लेखकों निर्धारण प्रोटोकॉल के प्रावधान के लिए pCAGAdDU वेक्टर और ओलिवर Gorka के निर्माण के लिए Lirui दू धन्यवाद देना चाहूंगा.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pENTR/D-TOPO Cloning Kit Invitrogen K240020
Gateway LR Clonase II Enzyme mix Invitrogen 11791020
PacI New England Biolabs R057S
jetPEI Polyplus-transfection 101-10N
HEK293A Cell Line Invitrogen R705-07
A549 ATCC CCL-185
6-well plates BD Falcon 353046
14 cm tissue culture dish Nunc 168381
BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CARΔ1)1Jdgr Taconic Farms Model Nr. 4285
Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II Miltenyi Biotech 130-094-131
DMEM Invitrogen 41966-052
FBS PAN Biotech 1502-P110704
PenStrep Invitrogen 15140-122
RPMI 1640 Lonza BE12-167F
NaPyruvate Lonza BE13-115E
NEAA 100x Lonza BE13-114E
L-Glutamine Invitrogen 25030
HEPES Buffer Solution (1 M) Invitrogen 15630-056
β-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M-7522
MEM Essential vitamin mixture (100x) Lonza 13-607C
Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 for Cell Expansion and Activation Invitrogen 114-56D
Recombinant Human TGF-beta 1 R&D Systems 240B
Proleukin S (18 x 106IE) Novartis
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit Invitrogen L-23105
Mouse BD Fc BlockT BD Pharmingen 553141
Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE eBioscience 12-5773-82
Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay Roche Applied Biosystems 4427975
LightCycler 480 Probes Master Roche Applied Biosystems 04902343001
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit Roche Applied Biosystems 4366596

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References

  1. Lahl, K., Loddenkemper, C., et al. Selective depletion of Foxp3+ regulatory T cells induces a scurfy-like disease. The Journal of Experimental Medicine. 204 (1), 57-63 (2007).
  2. Kretschmer, K., Apostolou, I., Hawiger, D., Khazaie, K., Nussenzweig, M. C., von Boehmer, H. Inducing and expanding regulatory T cell populations by foreign antigen. Nature Immunology. 6 (12), 1219-1227 (2005).
  3. Zhang, X., Izikson, L., Liu, L., Weiner, H. L. Activation of CD25(+)CD4(+) regulatory T cells by oral antigen administration. Journal of Immunology (Baltimore, Md). 167 (8), 4245-4253 (2001).
  4. Josefowicz, S. Z., Niec, R. E., et al. Extrathymically generated regulatory T cells control mucosal TH2 inflammation. Nature. 482 (7385), 395-399 (2012).
  5. Samstein, R. M., Josefowicz, S. Z., Arvey, A., Treuting, P. M., Rudensky, A. Y. Extrathymic generation of regulatory T cells in placental mammals mitigates maternal-fetal conflict. Cell. 150 (1), 29-38 (2012).
  6. Laurence, A., Amarnath, S., et al. STAT3 Transcription Factor Promotes Instability of nTreg Cells and Limits Generation of iTreg Cells during Acute Murine Graft-versus-Host Disease. Immunity. 37 (2), 209-222 (2012).
  7. Terabe, M., Berzofsky, J. A. Immunoregulatory T cells in tumor immunity. Current Opinion in Immunology. 16 (2), 157-162 (2004).
  8. Li, X., Kostareli, E., Suffner, J., Garbi, N., Hämmerling, G. J. Efficient Treg depletion induces T-cell infiltration and rejection of large tumors. European Journal of Immunology. 40 (12), 3325-3335 (2010).
  9. Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).
  10. Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).
  11. Chen, W., Jin, W., et al. Conversion of Peripheral CD4+CD25- Naive T Cells to CD4+CD25+ Regulatory T Cells by TGF-β Induction of Transcription Factor Foxp3. The Journal of Experimental Medicine. 198 (12), 1875-1886 (2003).
  12. Xu, W., Lan, Q., et al. Adoptive transfer of induced-treg cells effectively attenuates murine airway allergic inflammation. PloS ONE. 7 (7), e40314 (2012).
  13. Circosta, P., Granziero, L., et al. T cell receptor (TCR) gene transfer with lentiviral vectors allows efficient redirection of tumor specificity in naive and memory T cells without prior stimulation of endogenous TCR. Human Gene Therapy. 20 (12), 1576-1588 (2009).
  14. Patel, C., Muthuswamy, J. High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA). J. Vis. Exp. (67), e4415 (2012).
  15. Zhong, S., Malecek, K., Perez-Garcia, A., Krogsgaard, M. Retroviral transduction of T-cell receptors in mouse T-cells. J. Vis. Exp. (44), e2307 (2010).
  16. Leon, R. P., Hedlund, T., et al. Adenoviral-mediated gene transfer in lymphocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (22), 13159-13164 (1998).
  17. Wan, Y. Y., Leon, R. P., et al. Transgenic expression of the coxsackie/adenovirus receptor enables adenoviral-mediated gene delivery in naive T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13784-13789 (2000).
  18. Hurez, V., Dzialo-Hatton, R., Oliver, J., Matthews, R. J., Weaver, C. T. Efficient adenovirus-mediated gene transfer into primary T cells and thymocytes in a new coxsackie/adenovirus receptor transgenic model. BMC Immunology. 3, 4 (2002).
  19. Eitelhuber, A. C., Warth, S., et al. Dephosphorylation of Carma1 by PP2A negatively regulates T-cell activation. The EMBO Journal. 30 (3), 594-605 (2011).
  20. Glasmacher, E., Hoefig, K. P., et al. Roquin binds inducible costimulator mRNA and effectors of mRNA decay to induce microRNA-independent post-transcriptional repression. Nature Immunology. 11 (8), 725-733 (2010).
  21. Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. The Journal of General Virology. 81 (Pt. 11), 2573-2604 (2000).
  22. Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C., Nairn, R. Characteristics of a Human Cell Line Transformed by DNA from Human Adenovirus Type 5. Journal of General Virology. 36 (1), 59-72 (1977).
  23. Landy, A. Dynamic, structural, and regulatory aspects of lambda site-specific recombination. Annual Review of Biochemistry. 58, 913-949 (1989).
  24. Bernard, P., Couturier, M. Cell killing by the F plasmid CcdB protein involves poisoning of DNA-topoisomerase II complexes. Journal of Molecular Biology. 226 (3), 735-745 (1992).
  25. Thai, T. -H., Calado, D. P., et al. Regulation of the Germinal Center Response by MicroRNA-155. Science. 316 (5824), 604-608 (2007).
  26. Rodriguez, A., Vigorito, E., et al. Requirement of bic/microRNA-155 for Normal Immune Function. Science. 316 (5824), 608-611 (2007).
  27. Cobb, B. S., Hertweck, A., et al. A role for Dicer in immune regulation. The Journal of Experimental Medicine. 203 (11), 2519-2527 (2006).
  28. Steiner, D. F., Thomas, M. F., et al. MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-γ Production in Helper T Cells. Immunity. , (2011).
अनुभवहीन सीडी 4 की adenoviral पारगमन Treg भेदभाव का अध्ययन करने के लिए कोशिकाओं टी
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Warth, S. C., Heissmeyer, V.… More

Warth, S. C., Heissmeyer, V. Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation. J. Vis. Exp. (78), e50455, doi:10.3791/50455 (2013).

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