Summary
Fiskeri-inducerade förändringar av exploaterade kräftdjur fiske, som den amerikanska hummerfisket, skulle kunna påverka deras reproduktiva dynamik, vilket leder till en minskning av parning framgång. Denna studie har som mål var att utveckla en icke-invasiv metod för att utröna parning framgång kvinnliga hummer som kan vara fysiologiskt eller funktionellt mogna.
Abstract
Trots att en av de mest produktiva fisket i Nordatlantens västra del, är fortfarande mycket okänt om de naturliga reproduktiva dynamik amerikanska humrar. Senaste arbete i exploaterade kräftdjur populationer (krabbor och humrar) tyder på att det finns omständigheter där mogna kvinnor inte kan nå sin fulla reproduktiva potential på grund av begränsningar spermier. För att undersöka denna möjlighet i olika regioner i amerikansk hummer fiske, blev en tillförlitlig och icke-invasiv metod som utvecklats för provtagning stort antal kvinnliga hummer till havs. Denna metod innebär att föra in en trubbig spets nål i honans sädes-kärl för att fastställa närvaro eller frånvaro av en spermie plugg och för att ta ut ett prov som kan undersökas med avseende på förekomst av spermier. En rad kontrollstudier genomfördes vid kaj och i laboratoriet för att testa tillförlitligheten av denna teknik. Dessa ansträngningar medförde provtagning 294 kvinnliga hummer för att bekräfta att det finns ofa spermier kontakten var en tillförlitlig indikator på spermier i behållaren och därmed parning. Detta dokument specificerar metod och de resultat som erhållits från en delmängd av de totala honor ingick i urvalet. Av de 230 kvinnliga hummer samplade från Georges Bank och Cape Ann, MA (storleksintervall = 71-145 mm i ryggskölden längd), 90,3% var positiva för spermier. Möjliga förklaringar till avsaknaden av spermier i vissa honor är: omognad (brist på fysiologisk mognad), uppdelning av spermier kontakten efter att ha använts för att befrukta en koppling av ägg, och brist på parningsaktivitet. Undersökningarna tyder på att denna teknik för att undersöka parnings framgången för kvinnliga hummer är en pålitlig proxy som kan användas i fält för att dokumentera reproduktiv aktivitet i naturliga populationer.
Introduction
Amerikansk hummer (Homarus americanus) är en av de mest produktiva fisket i Nordatlanten (~ 56.000 mt under 2011, värderas över $ 390.000.000) 1. Men det finns en allmän brist på förståelse om de reproduktiva dynamiken i denna art i vilda populationer. Generera mer exakta uppskattningar av reproduktionskapaciteten, inklusive antalet och storlekarna individer aktivt i reproduktion, kan förbättra processen bedömning av bestånd. Exempelvis har kvinnor som hindras från att nå sin fulla reproduktiva potential på grund av begränsningar spermier identifierats som en angelägenhet för flera kommersiellt utnyttjade marina kräftdjur inklusive: taggig hummer 2, blå krabbor 3, kungskrabbor 4, sten krabbor 5 och snö krabbor 6. Det övergripande målet är att avgöra om begränsningen spermier kan vara en faktor i vissa regioner i amerikansk hummer fisket också.
nt "> De första tecknen på en potentiell begränsning spermier problem i hummer observerades under den tid som en icke-närstående taggstudie med ovigerous kvinnliga hummer (med synligt intakta, nyligen extruderade ägg). Recapture rapporter från fiskare visade att ~ 15% av dessa djur hade sjunkit deras ägg kopplingar efter bara 1-2 månader. Arbetshypotesen var att några humrar bar på ägg som inte hade blivit befruktade och, som ett resultat, "föll bort" 7. Preliminära data från en senare studie har bekräftat att hummer kommer extrudera ägg även om de inte lyckas har parat sig och dessa obefruktade ägg görs endast för ~ 1 månad 8. Med tanke på den observationen av kvinnor som bär obefruktade ägg i naturliga populationer, sökte vi att bestämma i vilken utsträckning begränsningen spermier kan bidra till en submaximal nivå på reproduktionen av könsmogna hummer. För att uppnå detta mål, var en teknik som utvecklats för att upptäcka spermatophore deponerats av män under parning.Detta dokument och video beskriver en icke-invasiv, enkel metod som utvecklats för att utröna parning framgång kvinnliga hummer. Tekniken kan utnyttjas snabbt och säkert till sjöss, antingen ombord forskning eller kommersiella fiskefartyg. Detaljerna för denna provtagningsmetod samt några representativa resultat presenteras för att illustrera tillämpningen av tekniken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Del A: Fältprovtagningsteknik
1. Kvinnliga Mått
- För varje hona hummer, mäta ryggsköldslängd (CL) och bredden av det andra abdominala segmentet till närmaste 1,0 mm genom att använda ett par av skjutmått.
OBS: Den andra buken segmentet mäts eftersom bredden på buken (där kvinnor bär sina ägg) är en indikator på sexuell mognad. Dessutom kan det vara fördelaktigt att fastställa molt scenen för att sedan matcha dessa uppgifter med reproduktiva stadium (se steg 1.2). - Klipp en liten distala delen av en av buken pleopods (en standardmetodprotokoll i hummer) och lagra pleopod i rent havsvatten för senare visning med en dissekera mikroskop 9.
OBS: Detta steg kan även avslöja förekomst av cement körtlar på pleopods, som är en indikation på att kvinnor förbereder sig för att pressa sina ägg 10.
2. Needle Insertion
- För in injektionsnålen (18 G, se tabell 1) ~ 1 cm i den nyskapande kärl, vinklade mot svansen vid ~ 45 ° (Figur 1).
OBS: I humrar med intakta spermier pluggar, kan nålen träffa några motstånd under införande, eftersom det trycks genom spermapluggen innan det når den högsta koncentrationen av spermier i botten av det nyskapande behållaren (figur 1).
OBS: Närvaron av kontakten i sig är en tillförlitlig indikator på att hummer har parat sig. I vissa djur kan det vara lite motstånd, möjligen eftersom ingen spermatophore är närvarande, är det spermatophore liten, det har inte konkretiserats i en plugg ännu, eller det kanske redan har använts för att befrukta en eller flera kopplingar av ägg.
Figur 1. Nål insättning och syn på hummer sädes kärl. Sätta i trubbig spets nål i sädes-behållare av hummer för att extrahera ett spermaprov. Vinkeln och djupet av nålen är båda avgörande för att få konsekventa prover. Höger: Vy över en fruktbärande kärl som har dissekerat och delas vertikalt. Spermierna kontakten tar upp den övre eller yttersta delen av kärlet, medan spermier finns längst ner (djupaste punkt) i kärlet. Det är viktigt att notera att provtagning under detta djup kan punktera kärlet och resultera i ett blodprov förorenad. Klicka här för att visa en större bild .
3. Penetrerar Sperm Plug
- Efter den initiala insättningen brantare vinkeln hos nålen till nästan vertikalt (vinkelrätt mot kroppsaxeln), och mycket långsamt börjar arbeta detnedåt in i behållaren.
- Håll nålen lutas i en vinkel, så att spetsen är riktad något mot svans. I detta fall är nålspetsen är att komprimera den övre delen av pluggen, tills den så småningom tränger in i matrisen.
- Fortsätt att sakta in nålen nedåt tills ett motstånd känns igen - det är botten på behållaren och där provet tas.
4. Spermier Avlägsnande
- Ta ett prov (ofta fast plugg material, flytande spermier och annan vätska) från botten av behållaren och deponera provet i ett märkt 2,0 ml plaströr.
- Spola kärlet med ~ 0,1 till 0,5 ml kallt havsvatten.
- Ta bort ca 0,3 ml vätska och plats i samma rör.
- Affär spermaprover på is tills de kan undersökas i laboratorium.
Del B: Granskning av spermier i labbet
OBS: Prov tas bort från de sädes-kärl av enskilda l obsters bör undersökas för att avgöra om spermier var närvarande eller frånvarande. - Ta bort ~ 50 l av vätska från varje plaströr, plats på en glasskiva med ett täckglas, och utsikt på 100X med ett sammansatt mikroskop.
- Poäng prover som: sperma knappa, många, eller frånvarande (gjorde denna studie inte kvantifiera faktiska antalet spermier, figur 2).
Figur 2. Exempel Hummer spermier bilder. Bilder av hummer spermaprover tagna från en kvinnlig sädes-kärl, sett med ett sammansatt mikroskop på 40X förstoring. Bild på vänster visar ett prov som innehöll många spermier, medan den andra (höger) visar en gles prov (skala bar = 10 nm).Jpg "target =". _blank "> Klicka här för att visa en större bild.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De uppgifter som redovisas här var för en delmängd av kvinnliga hummer som härstammar från både nearshore och offshore. Den nearshore-gruppen bestod av 44 humrar som fångas i kustvattnen i närheten av Cape Ann, Massachusetts och transporteras i kylare till laboratoriet för undersökning. Sammanlagt 186 offshore hummer fångades på Georges Bank och samplas med en kommersiell anläggning anläggning i New Hampshire.
Spermaprover erhölls från alla djuren och undersöktes omedelbart med avseende på närvaro eller frånvaro av spermier enligt förfaranden som beskrivs ovan. Totalt 90,3% av alla kvinnor i denna delmängd hade sperma på sina inflytelserika behållare. Överraskande, de celler som saknade spermier var inte nödvändigtvis vid den mindre änden av storleksområdet (figur 3).
ighres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50498/50498fig3.jpg "width =" 600px "/>
Figur 3. Provtagnings resultat för förekomst av spermier i hummer. Procent kvinnliga hummer i 5 mm CL storleksklass kärl som hade spermier i deras sädes behållare (procent positiva) som en indikator på parning. Honorna fångades från vattnen nära Cape Ann, MA (71-83 mm CL) och från Georges Bank (89-154 mm CL). Siffror inom staplarna representerar total stickprovsstorlek för att bin. Klicka här för att visa en större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna video och pappers kontur och demonstrera en metod för att bestämma om kvinnliga hummer har framgångsrikt parat. Denna metod är enkel nog att det kan användas för storskalig provtagning av humrar till havs av en mängd olika användare. Metoden bygger på att upptäcka närvaron av en spermatophore i det nyskapande kärl som överförs från manliga till kvinnliga hummer under parning. Dessa spermatophores delvis stelna till en spermie plugg kort efter att de har deponerats i kärlet, och därför är förekomsten av en spermie plugg också tecken på parning framgång. I denna studie, samt en efterföljande större studie har det framkommit att de flesta spermapluggar hade sperma i samband med dem 11. Men medan det finns en plugg finns en tillförlitlig indikator på parning aktivitet, är dess frånvaro inte.
Även om vi inte kan vara helt säker på om denna provtagningsmetod medför en negativ effekt på förmågan hos kvinnliga hummer för att leka end lyckas befrukta sina ägg koppling, det finns aspekter på detta spermier provtagningsprotokoll som talar för att skadan skulle vara minimal till antingen spermatophore eller kärlet. Det finns uppgifter (från pågående laboratoriestudier) som indikerar några humrar, efter sperma provtagning, fortfarande pressa befruktade kopplingar av ägg (n = 3) och kan befrukta fler än en koppling av ägg som använder samma spermatophore. Dessa ägg utvecklas och kläcks i likhet med hummer som inte har ingick i urvalet. Dessutom har denna provtagningsteknik endast tjänar till att sampla en liten bråkdel av den totala spermier. Den är inte avsedd att kvantitativt ta prov på hela innehållet i en behållare. På grund av den komplexa fysiska uppbyggnaden av kärlet 12,13, skulle en annan teknik (t.ex. dissektion) vara tvungen att skaffa den typen av resultat.
Sperma hittades i ett antal djur i urvalet som saknade en spermie plugg, möjligen på grund av att spermatophore var relativt new, och hade ännu inte konkretiserats i en plugg, eller spermatophore hade tidigare använts för att befrukta en eller flera kopplingar av ägg och hade försämrats. Därför är det viktigt att både kontroll för en spermie plugg och provet för spermier i syfte att erhålla det mest exakta index av parning framgång.
Exakt inriktning av nålen under provtagningsförfarandet är kritisk av flera skäl. Först, att säkerställa att nålen är parallell med den laterala kroppsplanet hindrar den från att tränga in den tunna sidan av nyskapande behållaren. När den teknik som utförs korrekt, orsakar det ingen dödlighet, eftersom nålen aldrig faktiskt tränger kroppshåligheten. För det andra, 45 ° införingsvinkel, följt av en brantare lutning av nålen, bidrar till att säkerställa att nålen når botten av behållaren där spermatozo är koncentrerad utan att penetrera väggen av spermatophore och kommer in i intilliggande organ sinus (Figur 1) .
13. När spermierna har reagerat, börjar de att bryta ner i provet och bli svåra att identifiera. Av detta skäl bör omrörning av provampuller hållas till ett minimum. Att hålla proven svalna synes även hjälpa till att bevara integriteten av spermier. Slutligen föreslås det att använda sterila havsvatten när prov behandling. Detta kan verka för att minimera tillväxten av bakterier och andra mikroorganismer (under 36-48 h) som kan skada spermier.
De flesta (90.3%) av de kvinnliga hummer samplade hade parat framgångsrikt, baserat på förekomsten av spermier i deras sädes kärlen. Resten av djuren kunde inte ha varit spermier positivt eftersom antingen de var sexuellt omogna, deras spermapluggar hade försämrats över tid och hade varasv fullt användas för att befrukta en eller flera kopplingar av ägg, eller de hade aldrig parat sig, möjligen därför att de aldrig stött på en lämplig hane vid rätt tid i deras molt cykel 11. Kvinnliga humrar i Georges Bank-regionen har en relativt stor storlek-vid förfall, med endast 50% av kvinnorna förfaller vid 100 mm 14. Cape Ann honor mognar på en något mindre storlek än gör offshore hummer, med 50% av kvinnorna mogna vid 90 mm CL 15. Med hänsyn till att de minsta honorna var 71 mm CL, är det inte orimligt att föreslå att några av honorna saknar spermier pluggar sannolikt omogna och alltså inte skulle ha parad. Många stora kvinnliga hummer, som de samplade i vår offshore-undergrupp, kan leka i på varandra följande år utan ömsat och remating 16.
Flera fertilizations med samma spermatophore kan så småningom leda till en uppdelning av pluggen materialet och kan använda upp spermierna som finns i receptAcle, vilket gav ett negativt resultat. Men den mekaniska nedbrytningen av spermier kontakten över tid har inte, så vitt vi vet, har beskrivits. Slutligen är det möjligt att dessa kvinnor utan sperma i sina kärl kunde inte hitta en partner. Skeva kvinnliga könskvoter har dokumenterats i Georges Bank kräfta 17, och möjligheten att detta leder till en begränsning spermier förtjänar ytterligare uppmärksamhet på grund av de eventuella följderna för reproduktionskapaciteten av hummer befolkningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar några intressekonflikter.
Acknowledgments
Författarna vill tacka alla New England kommersiella lobstermen vars båtar vi fick prov från - deras samarbete är mycket uppskattat. Dessutom tackar vi Little Bay Lobster Company (Newington, NH) och Champlin Seafood (Point Judith, RI) som tillät oss att genomföra provtagning på sina anläggningar. Följande UNH studenter till ovärderlig hjälp under hela denna studie: Haley Vit, Françoise Morrison, Sarah Havener, Audra Chaput, och maj Grose. Projektet har finansierats med bidrag från NH SeaGrant på WHW (projekt # R/CFR-11) och en UNH Marine Program Bidrag till JSG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calipers | Mitutoyo Digimatic | 500-196-20 | http://www.globalindustrial.com |
| 3 ml Luer-Lok syringe | Beckton-Dickinson | 309585 | www.bd.com |
| Monoject aluminum hub blunt needles, 18 G x 1 | Webster Veterinary | 8881202348 | www.mywebstervet.com |
| 2.0 ml Plastic storage tubes | Eppendorf | wu-06333-72 | http://www.coleparmer.com |
| Styrofoam cooler with ice | |||
| Compound light microscope | Olympus | BH System | http://www.olympusamerica.com |
| Glass sides with cover slip | 75 mm x 25 mm, ~1 mm thickness | ||
| Pipettor with disposable tips |
References
- FAO and Agriculture Organization of the United Nations). Fisheries and Aquaculture Department. , Available from: http://www.fao.org (2012).
- MacDiarmid, A., Butler, M. J. Sperm economy and limitation in spiny lobsters. Behav. Ecol. Sociobiol. 46, 14-24 (1999).
- Kendall, M. S., Wolcott, D. L., Wolcott, T. G., Hines, A. H. Influence of male size and mating history on sperm content of ejaculates of the blue crab Callinectes sapidus. 230, 235-240 (2002).
- Sato, T., Ashidate, M., Goshima, S. Effects of male mating frequency and male size on ejaculate size and reproductive success of female spiny king crab, Parolithodes brevipes. Mar. Ecol. Prog. Ser. 296, 251-262 (2005).
- Sato, T., Goshima, S. Impacts of male-only fishing and sperm limitation in manipulated populations of an unfished crab, Hapalogaster. 313, 193-204 (2006).
- Rondeau, A., Sainte-Marie, B. Variable mate-guarding time and sperm allocation by male snow crabs (Chionoecetes opilio) in response to sexual competition, and their impact on the mating success of females. Biol. Bull. 201, 204-217 (2001).
- Waddy, S. L., Aiken, D. E. Mating and insemination in the Ameri can lobster,Homarus americanus. Crustacean sexual behavior. Bauer, R. T., Martin, J. W. , Columbia University Press. NY. 126-144 (1990).
- Johnson, K. J., Goldstein, J. S., Watson, W. H. Two methods for determining the fertility status in early-stage American lobster, Homarus americanus, eggs. J. Crust. Biol. 31, 693-700 (2011).
- Aiken, D. E. Proecdysis, setal development, and molt prediction in the American lobster (Homarus). 30, 1337-1344 (1973).
- Aiken, D. E., Waddy, S. L. Cement gland development, ovary maturation, and reproductive cycles in the American lobster Homarus americanus. J. Crust. Biol. 2, 315-327 (1982).
- Pugh, T. L., Goldstein, J. S., Lavalli, K. L., Clancy, M., Watson, W. H. At-sea determination of female American lobsters (Homarus americanus) mating activity: Patterns vs. expectations. Fish. Res. 147, 327-337 (2013).
- Bauer, R. T. Phylogenetic trends in sperm transfer and storage complexity in decapod crustaceans. J. Crust. Biol. 6, 313-325 (1986).
- Talbot, P., Helluy, S. Reproduction and embryonic development. Biology of the Lobster: Homarus americanus. Factor, J. R. , Academic Press. NY. 177-216 (1995).
- Cooper, R. A., Uzmann, J. R. Ecology of juvenile and adult Homarus. The biology and management of lobsters. Cobb, J. S. 2, Academic Press. NY. 97-142 (1980).
- Estrella, B. T., McKiernan, D. J. Catch-per-unit-effort and biological parameters from the Massachusetts coastal lobster (Homarus americanus) resource: description and trends. NOAA Tech. Rep. NMFS. 81, (1989).
- Waddy, S. L., Aiken, D. E. Multiple fertilization and consecutive spawning in large American lobster, Homarus americanus. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 43, 2291-2294 (1986).
- Atlantic States Marine Fisheries Commission (ASMFC). American lobster stock assessment report for peer review. ASMFC Stock Assessment. , Washington, D.C. (2009).
