A morte celular associada com mitose anormal observado por imagem confocal em células vivas Câncer

Summary

A actividade citotóxica do fenantridina PJ-34 em células de cancro sujeitos a mitose foi documentada em tempo real por meio de imagem confocal vivo. PJ-34 erradicou o câncer de mama humano MDA-MB-231 células abrigam extra-centrossomas na mitose. Ao contrário de mitose bi-focal normal, o Extra-centrossomas não foram agrupados nos dois pólos do fuso na presença de PJ-34.

Abstract

Derivados fenantreno que actuam como inibidores potentes PARP1 impedido o agrupamento bi-focal de centrossomas excedentários em células de cancro humano multi-centrosomal na mitose. O fenantridina PJ-34 foi a molécula mais potente. Declustering de extra-centrosomes provoca insuficiência mitótico e morte celular em células multi-centrosomal. Cânceres humanos mais sólidos têm alta ocorrência de extra-centrossomas. A actividade de PJ-34 foi documentada em tempo real por imagem confocal de cancro da mama humano vivo MDA-MB-231 transfectadas com vectores que codificam para fluorescente γ-tubulina, que é altamente abundante nos centrossomas e para histona H2B fluorescente presente na os cromossomos. Aberrantes arranjos cromossomos e focos γ-tubulina de-cluster representando centrosomes declustered foram detectados nas transfectadas MDA-MB-231 células após tratamento com PJ-34. Un-cluster extra-centrossomas nos dois pólos do fuso precedeu sua morte celular. Estes resultados ligados for a primeira vez que a atividade citotóxica exclusivo recentemente detectada de PJ-34 em células cancerosas humanas com extra-centrosomes de-agrupamento na mitose e insuficiência mitótico, levando à morte celular. De acordo com descobertas anteriores observados por imagem confocal de células fixas, PJ-34 células cancerosas erradicada exclusivamente com multi-centrosomes sem prejudicar as células normais submetidos a mitose com os dois centrossomas e fusos bi-focal. Esta atividade citotóxica de PJ-34 não foi compartilhada por outros inibidores potentes PARP1, e foi observada em PARP1 deficientes MEF extracentrosomes abrigam, sugerindo a sua independência de PARP1 inibição. Viver de imagem confocal ofereceu uma ferramenta útil para a identificação de novas moléculas células erradicar durante a mitose.

Introduction

Fenantreno derivados inibidores PARP1, incluindo PJ-34, foram projetados para proteger as células quiescentes de morte celular por apoptose induzida pela energia consumindo PARP1 mediada de reparo do DNA sob condições de estresse (acidente vascular cerebral ou infarto do miocárdio) ^1. No entanto, recentemente descobrimos que PJ-34, em duas vezes maior concentração do que PARP1 inibição da indução, pode causar exclusivamente morte celular em células cancerosas humanas ^2,3. Quanto mais rápida for a proliferação da célula era mais eficiente na erradicação das células era. A atividade citotóxica do PJ-34 foi atribuída a extra-centrosomes de-agrupame....

Protocol

1. Cultura celular Preparação

MDA-MB-231 de células foram adquiridos a partir da ATCC (American Type Culture Collection) e armazenada em azoto líquido.

1. Semente 10 ⁶ MDA-MB-231 células em 92 mm de diâmetro, uma placa de Petri em 10 ml de meio completo contendo Dulbeco Modified Eagle Médium (DMEM), 10% de soro de cavalo, 1% de L-glutamina, e 1% de Penstrep-Anfotericina B. Permitir células a proliferar até cerca de 80-100% de confluência.
2. Remover meio de cultura de prato e descarte.
3. Lava-se a camada de células brevemente com 0,25% (w / v) de solução de tripsina-EDTA para remover todos os ves....

Results

PJ-34 é uma água solúvel estável fenantridina ¹ (Figura 1). Os nossos resultados precedentes revelaram a morte celular e de agrupado extra-centrossomas em vários tipos de células cancerosas multi-centrosomal fixas que tenham sido tratados com o PJ-34. Em contraste, a proliferação de células normais não foram prejudicados ^2,3. Centrossomas foram identificados por dupla marcação com anticorpos dirigidos contra centrine1 e γ-tubulina nas células extra-centrosomal fixos ^2. <.......

Discussion

Moro imagem confocal fornecida uma documentação em tempo real do efeito citotóxico do PJ-34 em células multi-centrosomal vivo durante a mitose (Figura 3 e da informação suplementar). Esta foi a primeira documentação vivo atribuindo a citotoxicidade de PJ-34 em células de cancro humano para centrossomas extras de-agrupamento e da morte celular, o que sugere a indução de morte celular catástrofe mitótica por PJ-34 ^5-9. Em contraste, clustering bi-focal de centrossomas super-numerários foi obser.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
DMEM	Invitrogen (GIBCO)	41965
FBS (Soro fetal bovino)	Invitrogen (GIBCO)	12657
Solução Pen-Strep-Ampho	Biological Industries, Israel	03-033-1B
L-glutamina	Invitrogen (GIBCO)	25030-024
0,25% Tripsina-EDTA	Invitrogen (GIBCO)	25200
Placas de Petri de 92 mm	Nunc,Thermo scientific	150350
Pratos de cultura com fundo de vidro revestido de poli-D-lisina de 35 mm	MatTek Corporation, EUA	P35GC-0-14-C
Kit de teste de detecção de ATP luminescente	Abcam	ab113849
NDS (Soro de Burro Normal)	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Anticorpo anti-&alfa;-tubulina	Sigma	T9026	diluição 1:250 (IF)
Anticorpo anti-letama;-tubulina	Sigma	T5192	diluição 1:200 (IF)
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG	Invitrogen	A-11017	diluição 1:1.000 (IF)
Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG	Invitrogen	A-10042	diluição 1:1.000 (IF)
Reagente antidesbotamento ProLong Gold com DAPI (montagem)	Invitrogen	P36935
JetPEI (reagente de transfecção lipossomal)	Polyplus	101-10
EQUIPMENT
Microscópio confocal	Leica (Mannheim, Alemanha)	TCS SP5II