Summary
A actividade citotóxica do fenantridina PJ-34 em células de cancro sujeitos a mitose foi documentada em tempo real por meio de imagem confocal vivo. PJ-34 erradicou o câncer de mama humano MDA-MB-231 células abrigam extra-centrossomas na mitose. Ao contrário de mitose bi-focal normal, o Extra-centrossomas não foram agrupados nos dois pólos do fuso na presença de PJ-34.
Abstract
Derivados fenantreno que actuam como inibidores potentes PARP1 impedido o agrupamento bi-focal de centrossomas excedentários em células de cancro humano multi-centrosomal na mitose. O fenantridina PJ-34 foi a molécula mais potente. Declustering de extra-centrosomes provoca insuficiência mitótico e morte celular em células multi-centrosomal. Cânceres humanos mais sólidos têm alta ocorrência de extra-centrossomas. A actividade de PJ-34 foi documentada em tempo real por imagem confocal de cancro da mama humano vivo MDA-MB-231 transfectadas com vectores que codificam para fluorescente γ-tubulina, que é altamente abundante nos centrossomas e para histona H2B fluorescente presente na os cromossomos. Aberrantes arranjos cromossomos e focos γ-tubulina de-cluster representando centrosomes declustered foram detectados nas transfectadas MDA-MB-231 células após tratamento com PJ-34. Un-cluster extra-centrossomas nos dois pólos do fuso precedeu sua morte celular. Estes resultados ligados for a primeira vez que a atividade citotóxica exclusivo recentemente detectada de PJ-34 em células cancerosas humanas com extra-centrosomes de-agrupamento na mitose e insuficiência mitótico, levando à morte celular. De acordo com descobertas anteriores observados por imagem confocal de células fixas, PJ-34 células cancerosas erradicada exclusivamente com multi-centrosomes sem prejudicar as células normais submetidos a mitose com os dois centrossomas e fusos bi-focal. Esta atividade citotóxica de PJ-34 não foi compartilhada por outros inibidores potentes PARP1, e foi observada em PARP1 deficientes MEF extracentrosomes abrigam, sugerindo a sua independência de PARP1 inibição. Viver de imagem confocal ofereceu uma ferramenta útil para a identificação de novas moléculas células erradicar durante a mitose.
Introduction
Fenantreno derivados inibidores PARP1, incluindo PJ-34, foram projetados para proteger as células quiescentes de morte celular por apoptose induzida pela energia consumindo PARP1 mediada de reparo do DNA sob condições de estresse (acidente vascular cerebral ou infarto do miocárdio) 1. No entanto, recentemente descobrimos que PJ-34, em duas vezes maior concentração do que PARP1 inibição da indução, pode causar exclusivamente morte celular em células cancerosas humanas 2,3. Quanto mais rápida for a proliferação da célula era mais eficiente na erradicação das células era. A atividade citotóxica do PJ-34 foi atribuída a extra-centrosomes de-agrupamento na mitose 2. Muitos humano células cancerosas porto multicentrosomes 4,5. A incubação de células humanas de câncer de mama MDA-MB-231, que abrigam centrosomes supranumerários, com 20 mM PJ-34 eficientemente erradicadas destas células dentro de 72-96 horas, sem prejudicar as células quiescentes ou algumas células em proliferação benigna abrigar dois centrossomas em mitose
Montagem centrosome Bipolar é crucial para a formação do fuso bipolar na mitose 4,5. Portanto, células com mais de dois centrossomas desenvolveram um mecanismo molecular mal compreendida, agrupando os centrossomas extras em dois pólos 4-9. Falha de montagem bipolar dos seus centrossomas pode causar multipolar distorcida fusos e aberrante cromossomas segregação que prende o ciclo celular em G2 / M de detenção, e leva à morte das células por falha mitótico 4,5. Os mecanismos moleculares subjacentes extra-centrosomes de-agrupamento são intensamente investigadas <sup> 10. Compreender este mecanismo de morte permitirá erradicação exclusivos das células cancerosas, poupando os tecidos saudáveis 5,10.
Assim, os compostos que activam a morte celular catástrofe mitótica oferecer um novo modo de tratamento de um cancro selectiva, o que pode ser eficaz numa larga gama de resultados cancers.Our sólidos humanos sugerem que a imagem confocal pode ser utilizado para identificar moléculas que afectam extra-centrossomas no agrupamento mitose 2,3, tornando estes compostos câncer alvo candidatos a fármacos.
Nós documentamos a atividade citotóxica do fenantridina PJ-34, verificando células cancerosas humanas fixas e ao vivo (com alta ocorrência de extra-centrossomas na mitose) contra as células normais. Um passo a passo descrição dos procedimentos de imagiologia utilizadas para identificar a actividade citotóxica de PJ-34 em células de cancro humanas estão incluídas a seguir.
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Protocol
1. Cultura celular Preparação
MDA-MB-231 de células foram adquiridos a partir da ATCC (American Type Culture Collection) e armazenada em azoto líquido.
- Semente 10 6 MDA-MB-231 células em 92 mm de diâmetro, uma placa de Petri em 10 ml de meio completo contendo Dulbeco Modified Eagle Médium (DMEM), 10% de soro de cavalo, 1% de L-glutamina, e 1% de Penstrep-Anfotericina B. Permitir células a proliferar até cerca de 80-100% de confluência.
- Remover meio de cultura de prato e descarte.
- Lava-se a camada de células brevemente com 0,25% (w / v) de solução de tripsina-EDTA para remover todos os vestígios de soro.
- Adicionar 2,0 ml de solução de tripsina-EDTA para prato e observar as células por microscópio invertido até a camada de células é disperso (geralmente dentro de 5 a 15 min.)
- Adicionar 18 ml de meio de crescimento completo e aspirar suavemente as células com uma pipeta. Transferir para um tubo.
- Centrifugar a suspensão de células a 1.200 rpm.
- Re-suspender o sedimento celular em 24 ml de cuLTURE médio.
- Adicionar 2 ml de suspensão de células a 35 pratos de vidro de fundo mm (cerca de 25% de confluência) e colocar em incubadora (5% CO2, 37 ° C).
- Soluções:
- Meio Completo para a proliferação de células: DMEM com 10% de FBS, 1% de antibióticos (100 unidades / ml de penicilina G, 100 ug / ml de estreptomicina, a solução de Pen-Strep-ampho) e 2 mM de L-glutamina.
- Solução de tripsina-EDTA, com 0,25% de tripsina-EDTA.
- Pratos:
92 milímetros de diâmetro placas de Petri.
35 mm de diâmetro com poli-D-lisina de vidro revestida de placas de cultura de fundo.
2. Preparação de células para imagem confocal ao vivo
- Semente de 2 x 10 5 MDA-MB-231 células em placas de cultura de vidro de fundo em 2 ml de meio completo, como mencionado na seção 1. Quando a cultura de células atinge confluência de 60-70% (cerca de 3-4 x 10 5 células por prato), prossiga com a transfecção.
- Transfecção as células com dois plasmídeos Encodção das proteínas de fusão γ-tubulina-GFP (para detecção de fluorescência de centrossomas) e histona-RED (H2b-RED, para a detecção de fluorescência de cromossomas), utilizando o reagente de transfecção lipossómica Jet-PI, seguindo o protocolo de fabricação. Resumidamente, mistura de 2 ug de cada plasmídeo em um tubo com 100 ul de NaCl (150 mM). Misture o reagente de transfecção (100 ul) com 100 ul de NaCl (150 mM) em um segundo tubo, e incubar 5 minutos à temperatura ambiente (RT). Em seguida, combinar as duas soluções, misture (usando vórtice leve) e spin-down. Incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente.
- Durante a incubação da mistura de transfecção, lave as células uma vez com PBS e substituir o meio de células com 2 ml de DMEM morno sem suplementos (37 ° C).
- Adicionar cuidadosamente a mistura de transfecção às células em DMEM e em seguida as células voltem para a incubadora (37 ° C, 5% de CO 2) durante 8 horas.
- Após 8 horas de incubação, substituir o DMEM com 2 ml de meio completo e incubar as células na incubadora durante 24hr.
- 24 horas após a transfecção, o meio de substituir as células com 2 ml de meio completo contendo 20 uM PJ-34.
- Incubar as células durante mais 18 horas (37 ° C, 5% de CO 2).
- Sujeitar as células a viver imagem confocal por pelo menos 16 horas em câmara de imagem mantendo as células em 5% de CO 2 e 37 ° C.
- Paralelamente, examinar a eficácia de transfecção 36 horas após a transfecção por microscopia de fluorescência como segue:
- Semente de 2 x 10 5 MDA-MB-231 células em placas de 6 poços contendo uma lamela por poço em 2 ml de meio completo.
- Transfectar as células, como mencionado em secções de 2,2-2,5.
- 36 horas após a transfecção as células transfectadas fixar montados numa lamela por incubação em metanol: acetona solução fria (1:1), 7 min, -20 ° C.
- Aspirar a solução de fixação e deixar a lamela com as células montadas para secar em uma capa química.
- Aplicar Prolongar reagente antifade ouro com DAPI e deixe ªlamela e secar no escuro durante 6 horas.
- Examine a lâmina sob o microscópio fluorescente e calcular a porcentagem das células transfectadas (sinais vermelho e verde) da população total de células (coloração DNA por DAPI). A percentagem de transfecção desejada é de cerca de 20-40% quando 100-200 células são contadas.
3. Parâmetros técnicos do confocal Configurações do scanner imagens ao vivo
- ScanMode XYZT; Pinhole [arejado] 1,00; Zoom 3,5; Resolução de 8 bits; DPSS 561 nm; argônio, laser visível 488 nm; laser He / Ne visível 633 nm; Objetivo HCX PL APO CS 63x 1,40 OIL UV; Abertura numérica 1,4; Velocidade de digitalização de 700 Hz, índice de refração 1,52.
- Imagem apresentação 3-D foram preparadas por Imaris imaging software 7.0.
4. Imagem confocal de mitose em células fixas
- Semente de 2 x 10 5 MDA-MB-231 células de câncer de mama (ATCC), fibroblastos embrionárias de camundongos normais (MEF), ou PARP1 deficiente MEF (PARP - / -, preparado pelo Dr. Françoise Dantzer) em lamelas de vidro em placas de 6 cavidades em 2 ml de meio completo. As lamelas foram lavadas com etanol a 96%, seguido de lavagem com água estéril DD, secou-se durante 2 horas e colocada em cada poço do prato de 6 poços.
- Adicionar PJ-34 (10-30 uM) ao meio e incubar as células durante o tempo necessário (normalmente até 96 horas).
- Lavar as lamelas uma vez com PBS (tampão fosfato salino), e fixar as células usando a incubação em metanol arrefecido em gelo: solução de acetona (1:1), 7 min, -20 ° C.
- Aspirar a solução fixadora e deixar as lamelas secar ao capuz química (nesta fase, as lamelas podem ser mantidos em -20 ° C durante várias semanas).
- Lavar as lamelas uma vez com PBST (PBS suplementado com 0,1% de Tween-20), para permeabilizar as membranas celulares e bloquear as células com 10% de NDS (soro normal de burro) em PBST ('solução de bloqueio ") durante 1 hora à temperatura ambiente.
- Incubar as células fixas permeabilizadas com Antibodi primárioes durante 2 horas à temperatura ambiente (para fusos e centrossomas coloração). Os anticorpos são diluídas em solução de bloqueio, como segue: anti-tubulina α (diluição 1:250) e anti-γ tubulina (diluição 1:200). Os anticorpos primários são aplicados como se segue: 100 ul de aplicar (em uma gota) de uma mistura dos anticorpos presentes na solução de bloqueio para cada uma lamela sobre a cobertura da placa de 6 poços (a tampa é de cabeça para baixo). Com cuidado, coloque a lamela sobre a queda de anticorpos, as células semeadas enfrentando a queda. Incubar as lamelas que enfrentam os anticorpos durante 2 horas à temperatura ambiente.
- Coloque as lamelas em volta dos poços e lavam as células 3 vezes com PBST. Em seguida, usar o mesmo processo descrito no ponto 4.6 para a marcação de células sobre as lamelas com os anticorpos secundários fluorescentes. Incubar as células nas lamelas de cobertura, com os anticorpos secundários durante 1 hora, temperatura ambiente, no escuro. Os anticorpos são diluídos em solução de bloqueamento como a seguir: Alexa Fluor 488 (diluição 1:1000; verde) e Alexa Fluor 568 (diluição 1:1000;vermelho).
- Monte as lamelas utilizando Prolongar reagente antifade ouro com DAPI (para coloração cromossomos) e incubar durante a RT no escuro para secar.
- Examine as lamínulas por microscopia confocal.
5. A viabilidade celular medido pela produção de ATP
Produção de ATP é medida por um kit de ensaio de detecção de ATP luminescente.
- Semente as células na placa de 96 poços, a aproximadamente 20.000 células em 800 ul de meio, em cada poço. Três poços do branco deve ser utilizado para a determinação da luminescência do meio do fundo.
- Prepare a série de diluições padrão de ATP a partir de cerca de 10 uM a 100 uM e manter em gelo.
- Adicionar 50 ul de detergente a cada poço e agitar a placa durante 5 minutos, em agitador orbital, a 700 rpm.
- Reconstituir cada frasco do "substrato liofilizado 'com 5 ml de" tampão de substrato de' no kit.
- Adicionar 50 ul da solução de substrato reconstituído aos poços, e agitara placa por 5 min em agitador orbital, a 700 rpm.
- Manter a placa na obscuridade durante 10 min.
- Meça luminiscence de cada poço por ELISA leitor de microplacas.
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Representative Results
PJ-34 é uma água solúvel estável fenantridina 1 (Figura 1). Os nossos resultados precedentes revelaram a morte celular e de agrupado extra-centrossomas em vários tipos de células cancerosas multi-centrosomal fixas que tenham sido tratados com o PJ-34. Em contraste, a proliferação de células normais não foram prejudicados 2,3. Centrossomas foram identificados por dupla marcação com anticorpos dirigidos contra centrine1 e γ-tubulina nas células extra-centrosomal fixos 2.
Aqui, a actividade citotóxica de PJ-34 foi documentada nestas células extra-centrosomal vivo em tempo real por meio de microscopia confocal vivo. Vivo de cancro da mama humano MDA-MB-231 de células, que têm uma ocorrência elevada (> 50%) de extra-centrossomas 4,5, foram verificados por pelo menos 16 horas por imagem confocal focada em células transfectadas com γ-tubulina-GFP ( marcação fluorescente de γ-tubulina focos 2) e com histona H2b-RED (fluorescente labeling de cromossomos). De seis a dez células transfectadas vivos foram digitalizados em paralelo em cada experimento. Duplo imunomarcação dos focos γ-tubulina nas células transfectadas com centrin1 era tecnicamente impossível.
Dispersos focos γ-tubulina e aberrante arranjo cromossomos foram raramente detectadas em selecionados aleatoriamente não tratados MDA-MB-231 células em mitose. Agrupamento bifocal de focos de γ-tubulina, representando extra-centrosomes agrupamento bifocal, foi documentada na maioria dos vivos não tratados MDA-MB-231 células (Figura 2), em contrapartida, centrossomas e arranjo anormal de cromossomos não-cluster foram detectados em directo transfectadas MDA-MB-231 células incubadas com o PJ-34 (20 uM), e a mitose em células estes acabaram por morte celular (Figura 3). Estas células foram incubadas com o PJ-34 para 18 - 24 horas antes da digitalização e durante 16 horas adicionais durante a análise (figura 3). A documentação em tempo real da célula death durante a mitose apoia fortemente uma correlação positiva entre os anteriormente definidos, o número de células malignas humanas com fusos multipolar na mitose e a percentagem de morte celular em células incubadas com o PJ-34 (20 uM) 2.
PJ-34 atua como um potente inibidor PARP1 1. Estudámos, portanto, a possibilidade de PARP1 inibição causando morte celular associada com insuficiência mitótico. Ao contrário de imagens ao vivo, imagens fixas de células MDA-MB-231 permitiu o exame de uma grande população de células em culturas de células, permitindo assim a análise estatística dos efeitos dos inibidores PARP1 em uma variedade de linhas de células cancerosas humanas. A actividade de PJ-34 foi comparada com a actividade de outros inibidores potentes, não-fenantreno PARP1 nas células normais ou deficientes PARP1 (isto é normal e PARP1 (- / -), fibroblastos de rato embrionárias (MEF)) (Figura 4). PARP1 deficientes MEF porto multi-centrossomas na mitose, mas não sãot células tumorais 11. Estas células foram preparadas pelo Dr. Francoise Dantzer, em Estrasburgo, França.
Fixo normal e PARP1 (- / -) MEF foram immunolabeled para α e γ-tubulina que rotulado seus fusos e centrossomas, respectivamente, conforme relatado antes de 2. Algumas das culturas celulares examinadas foram tratados com inibidores potentes, PJ-34 ou outro não-fenantreno PARP1, incluindo o ABT-888 e AG01469, que inibem a actividade enzimática de PARP1 e BSI-201, um composto que, aparentemente, atenua a ligação PARP1 peguei DNA 12-14. Nenhum dos inibidores testados PARP1 MEF deficientes em concentrações normais inibição da actividade de PARP1 (Figura 4). Em contraste, PJ-34 dependente da dose causada não-aglomeração de focos γ-tubulina, distorção de fusos e a morte celular em PARP1 (- / -) MEF (Figuras 4A e B). Isto não foi observado no MEF normal tratados com PJ-34 (Figure 4B) ou em PARP1 (- / -) não tratados com MEF-phenenthrene PARP1 inibidores ABT-888 ou AG014699 (Figura 4C). Deve notar-se que o PJ-34 em concentrações superiores a 20 uM alterou a MEF normal, embora MEF normais eram mais resistentes à actividade de PJ-34 de PARP1 (- / -) MEF.
O facto de PJ-34 erradicada PARP1 (- / -), apesar da sua MEF PARP1 deficiência, e a correlação entre a formação de fusos multi-focal e erradicação de células em PARP1 (- / -) MEF incubadas com PJ-34 em concentrações superiores as requeridas para a inibição PARP1, não eram consistentes com uma relação causal entre extra-centrossomas de-agrupamento em PARP1 (- / -) e MEF PARP1 inibição (Figura 4A). A atividade citotóxica do PJ-34 em PARP1 (- / -) MEF pode ser melhor explicada por sua atividade como um extra-centrosomes agente de-agrupamento em células multi-centrosomal 2 ( Informações Complementares "/> Figura 3. A documentação de imagens ao vivo confocal de morte celular em um selecionados aleatoriamente MDA-MB-231 células em mitose com a UN-cluster γ-tubulina rotulados extra-centrossomas. MDA-MB-231 células foram incubadas com o PJ-34 durante 24 horas antes da digitalização e durante as 16 h de imagem confocal vivo. PJ-34 Aplicou-se 24 horas após a transfecção com vectores que expressam γ-tubulina-GFP (focos, e centrossomas γ-tubulina verdes) e H2b-RED (vermelho, cromossomas). 
Figura 1. O fenantridina PJ-34: N-(6-oxo-5 ,6-di-hidro-phenanthridin-2-il)-N, N-dimetil-acetamida. 
Figura 2. Agrupamento Bi-focal de extra-centrossomas em sorteados ao vivo MDA-MB-231 células em mitose. A. Painel superior: centrosomes rotulado de selecionados aleatoriamente ao vivo MDA-MB-231 células transfectadas com γ-tubulina-GFP painel inferior:. Cromossômicas re-arranjos durante a mitose em uma sorteados MDA-MB-231 células transfectadas com histona H2b-RED. B. mitose Bi-focal com cluster extra-centrosomes identificados em um culto selecionados aleatoriamentefigurada MDA-MB-231 celular. As células foram transfectadas tanto pela γ-tubulina-GFP (rotulagem focos γ-tubulina; verde) e histonas H2b-RED (cromossomos rotulagem; Vermelho). 48 horas após a transfecção, as células foram expostas a uma imagem confocal ao vivo, durante 16 horas. Seis células foram digitalizadas em paralelo em cada experimento. Foram realizados quatro experimentos diferentes. Veja também informações suplementares. Clique aqui para ver a figura maior . 
Figura 3. Extra-centrosomes de-agrupamento precedido a morte celular em vivo MDA-MB-231 células tratadas com PJ-34. Uma sorteados ao vivo MDA-MB-231 células em mitose com centrosomes dispersos (um quadro rua à esquerda) terminou com a morte celular ( 2 º e 3 º quadros). Este cell foi seleccionada aleatoriamente em uma cultura de células incubadas durante 24 horas com o PJ-34 (20 uM) aplicado 24 horas após a transfecção com vectores que expressam γ-tubulina-GFP (rotulagem focos γ-tubulina incluindo centrossomas; verde) e histona H2b-RED ( rotulagem cromossomos; Vermelho). A célula foi digitalizada para 16 horas por imagem confocal ao vivo. Seis células foram digitalizadas em paralelo em cada experimento. Foram realizados três experimentos diferentes. Veja também informações suplementares. Clique aqui para ver a figura maior . 
Figura 4. A actividade citotóxica do PJ-34 em PARP1 (- / -), fibroblastos de rato embrionários. A. (Esquerda) A porcentagem de eixos multi-focal calculada em normal (linha preta) e PARP1 - / - (linha cinzenta) MEF, incubadas durante 48 horas com o PJ-34 nas concentrações indicadas. A porcentagem de eixos multi-polar foi calculado em 20 fusos total detectado em três experimentos diferentes. (Direita) reduziu a sobrevivência das células detectada em culturas de células foram incubadas durante 72 h com o PJ-34 (20 uM) em relação à sobrevivência de células não tratadas de controlo ((linha preta normais) e PARP1 - / - (linha cinzenta) MEF). A sobrevivência celular foi determinada por produção de ATP das células (protocolo 5). Apresentam-se os valores médios das quatro medições para cada linha celular em três experiências diferentes B. fusos normais escolhidos aleatoriamente e fixado PARP1 -. / - FAE na mitose, não tratada (controle) ou incubadas com o PJ-34 durante 48 h à indicada concentrações. PJ-34 causou multipolar fusos. As células foram fixadas, permeabilizadas e immunolabeled para α e γ-tubulina (rótulo verde de eixos e rotulagem vermelho de centrossomas, respectivamente). Cromossomos foram marcados com reagente DAPI (azul). . Resultados representativos de três experimentos diferentes C. Os inibidores potentes não fenantreno PARP1 não afetou centrosomes agrupamento em PARP1 (- / -) MEF. Os fusos normais de aleatoriamente seleccionados e PARP1 - / - MEF são apresentados; MEF não tratada (controlo) ou MEF tratado durante 48 horas com os inibidores de PARP não-fenantreno, AG01469 (20 uM) ou ABT888 (20 uM). Cromossomos são rotulados com o reagente DAPI (azul). Resultados semelhantes foram obtidos em três experimentos diferentes. Clique aqui para ver a figura maior .
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Clique aqui para ver a figura maior .
Figura 2B. Figura Suplementar. Uma selecionados aleatoriamente MDA-MB-231 células em anáfase com bi-focal cluster γ-tubulina rotulado extra-centrosomes foi digitalizada para 16 horas por imagem confocal ao vivo, 48 horas depois de ser transfectadas com vetores expressando γ-tubulina-GFP e H2b-RED (focos de rotulagem γ-tubulina e centrossomas das células fixas (verde) e H2b rotulagem histona dos cromossomos (vermelho), respectivamente).
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Discussion
Moro imagem confocal fornecida uma documentação em tempo real do efeito citotóxico do PJ-34 em células multi-centrosomal vivo durante a mitose (Figura 3 e da informação suplementar). Esta foi a primeira documentação vivo atribuindo a citotoxicidade de PJ-34 em células de cancro humano para centrossomas extras de-agrupamento e da morte celular, o que sugere a indução de morte celular catástrofe mitótica por PJ-34 5-9. Em contraste, clustering bi-focal de centrossomas super-numerários foi observada em vivo não tratados MDA-MB-231 células em mitose normal com bi-focali cluster centrosomes extras (Figura 2, informações complementares).
De acordo com estes resultados, vivo de imagem confocal de células transfectadas podia ser útil para detectar a translocação de proteínas implicadas em extra-centrossomas agrupamento em células transfectadas durante a mitose 5,9,15,16. Identificação de proteínas afectadas por PJ-34 em multi-Centroscélulas Omal pode dar algumas pistas para a compreensão dos mecanismos de morte ativados por extra-centrosomes de-clustering.
A vantagem de imagem confocal ao vivo no fornecimento de informações em tempo real durante a mitose em células vivas, também é obrigado a várias limitações. O número de células examinadas por experiência é limitada. Portanto possibilidades para detectar células em mitose são baixas, e são necessárias várias experiências de repetição para um estudo em tempo real da mitose nas células digitalizados. Além disso, o sucesso é altamente dependente de alta eficiência de transfecção de células com vectores que expressam as proteínas marcadas. Assim, apesar de ser confiável, imagem confocal ao vivo é demorado e exige muito trabalhadores altamente experientes.
Em comparação, imunocitoquímica e confocal de células fixas permitir a análise de um grande número de células por experiência, que é necessário para uma análise estatística de confiança. Utilizamos esse método para comparar aefeitos da PJ-34, a mitose de células benignas normais aos seus efeitos em células de câncer submetidos a mitose com centrosomes supranumerários 2,3. De igual modo, este método foi utilizado para comparar os efeitos do PJ-34 a que os inibidores de não-fenantreno PARP1 em PARP (- / -) MEF abrigando extra-centrossomas (células com elevada ocorrência de multi-centrossomas 11) (Figura 4).
Em resumo, os nossos resultados mostram a vantagem de combinar a informação em tempo real, mais valiosa é fornecida por imagem confocal de células vivas na mitose (Figuras 2 e 3) com citoquímica confocal e análise de células fixadas. Uma combinação destes métodos pode ser útil para identificar a actividade citotóxica de pequenas moléculas que, como PJ-34, o alvo de mecanismos específicos crucial para a sobrevivência celular. A dependência exclusiva de muitas células cancerosas humanas em extra-centrosomes agrupamento bi-polar para a sua proliferação e sobreviveual torna PJ-34, um possível candidato para a terapia do câncer.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Fontes de financiamento da pesquisa: um fundo comum de empresa da Universidade de Tel Aviv transferência de tecnologia, RAMOT eo Centro-Sheba Medical (M. CA e SI.), ICRF - Câncer israelense fundação de pesquisa (M. CA.) E Fundação Israel ciência ( SI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DMEM | Invitrogen (GIBCO) | 41965 | |
| FBS (Fetal bovine Serum) | Invitrogen (GIBCO) | 12657 | |
| Pen-Strep-Ampho solution | Biological Industries, Israel | 03-033-1B | |
| L-glutamine | Invitrogen (GIBCO) | 25030-024 | |
| 0.25% Tripsin-EDTA | Invitrogen (GIBCO) | 25200 | |
| 92 mm Petri dishes | Nunc,Thermo scientific | 150350 | |
| 35 mm poly-D-lysine coated glass bottom culture dishes | MatTek Corporation, USA | P35GC-0-14-C | |
| Luminescent ATP detection assay kit | Abcam | ab113849 | |
| NDS (Normal Donkey Serum) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Anti α-tubulin antibody | Sigma | T9026 | 1:250 dilution (IF) |
| Anti γ-tubulin antibody | Sigma | T5192 | 1:200 dilution (IF) |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11017 | 1:1,000 dilution (IF) |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | A-10042 | 1:1,000 dilution (IF) |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI (mounting) | Invitrogen | P36935 | |
| JetPEI (liposomal transfection reagent ) | Polyplus | 101-10 | |
| EQUIPMENT | |||
| Confocal microscope | Leica (Mannheim, Germany) | TCS SP5II | |
References
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