Summary
Nøyaktig massemåling representerer et viktig skritt i løpet av etterforskningen av proteiner. Matrix-assistert laser desorpsjon / ionisering (MALDI) massespektrometri (MS) kan bli brukt for denne bestemmelse, og dens viktigste fordelen er toleransen til salter, vaskemidler og forurensninger. Her vil vi illustrere en tilgjengelig metode for analyse av proteiner som er større enn 100 kDa ved MALDI-MS.
Abstract
Effektivt å bestemme masser av proteiner er avgjørende for mange biologiske studier (bl.a. for strukturbiologi undersøkelser). Nøyaktig masse bestemmelse gjør det mulig å evaluere riktigheten av protein primære sekvenser, tilstedeværelsen av mutasjoner og / eller post-translasjonelle modifikasjoner, den mulige proteinnedbrytning, prøven homogeniteten, og graden av isotop inkorporering i tilfelle av merking (f.eks 13 C merking ).
Elektrospray ionisasjon (ESI) massespektrometri (MS) er mye brukt for masse bestemmelse av denaturerte proteiner, men dens effektivitet påvirkes av sammensetningen av prøvebuffer. Spesielt nærvær av salter, vaskemidler og forurensninger sterkt svekker effektiviteten av proteinanalyse ved ESI-MS. Matrix-assistert laser desorpsjon / ionisering (MALDI) MS er et attraktivt alternativ, på grunn av sin salttoleranse og enkelheten av datainnsamling og tolkningersjon. Videre er massen bestemmelse av store heterogene proteiner (større enn 100 kDa) lettere ved MALDI-MS på grunn av fravær av overlappende høye kostnader staten fordelinger som er til stede i ESI-spektra.
Her presenterer vi en tilgjengelig metode for å analysere proteiner større enn 100 kDa av MALDI-time of Flight (TOF). Vi illustrerer fordelene ved å bruke en blanding av to matriser (dvs. 2,5-dihydroksybenzosyre og α-cyano-4-hydroxycinnamic syre) og nytten av det tynne laget Fremgangsmåte tilnærming for prøve deponering. Vi diskuterer også den kritiske rollen som matrisen og væske renhet, av standardene som brukes til kalibrering, av laser energi, og av oppkjøpet tid. Samlet gir vi informasjon som er nødvendig for en nybegynner for å analysere intakte proteiner større enn 100 kDa av MALDI-MS.
Introduction
Strukturell biologi er avhengig av produksjonen av høy kvalitet proteiner 1, og derfor må være kombinert med effektive og pålitelige teknikker for proteinanalyse 2,3. I vår massespektrometri (MS) innenfor laboratorie et institutt for strukturell biologi trenger vi å bekrefte primære sekvens av proteiner, evaluere nærværet av mutasjoner og modifikasjoner posttranslational, nedbrytning av proteiner, prøven homogeniteten, og kvaliteten av isotopisk merking (f.eks deuterert proteiner for kjernemagnetisk resonans-studier 4). Siden strukturelle biologer bruker begrenset proteolyse å skille strukturelt stive domener fra fleksible deler, trenger vi å pålitelig karakterisere slike avkortede proteiner ved hjelp av MS.
Når biomolekyler ble analysert ved MS, er to mulige tilnærminger benyttes for å mykt ionisere slike tunge og labile molekyler. Electro ionisering (ESI) ioniserer molekylene direkte fravæskefase 5, matrix-assistert laser desorpsjon ionisering (MALDI) krever at biomolekyler er co-krystallisert med ultrafiolett-absorberende organiske molekyler (dvs. matrise molekyler) 6.
ESI time-of-flight (TOF) MS koplet til væskekromatografi er blitt en rutinemessig teknikk for analyse av intakte proteiner, fordi den tillater massebestemmelse med høy nøyaktighet (≤ 50 ppm). Det er imidlertid ganske utsatt for sammensetningen av prøvebuffer (spesielt salter og vaskemidler), og til forurensninger (dvs. polymerer) som er noen ganger vanskelig å fjerne, slik at undertrykkelse av analytten signal.
MALDI-TOF MS representerer et effektivt alternativ til ESI-MS fordi ytelsen er mindre påvirket av bufferkomponenter, vaskemidler og forurensninger, og lar intakt protein massebestemmelse med tilstrekkelig nøyaktighet (≤ 500 ppm) for sekvens validering. Etter Proteinkonn fordøyelse, MALDI-TOF MS kan også benyttes til å analysere de oppnådde peptider for ytterligere bekreftelse primære sekvensen ved den såkalte "peptid masse fingerprinting".
I våre hender, massebestemmelse av intakte proteiner, som er større enn 100 kD og heterogene (på grunn av endringer eller trunkeringer), er enklere ved MALDI-MS enn ved ESI-MS. Dette er på grunn av mangel på overlappende ladetilstand fordelinger som er tilstede i ESI-spektra. Dessuten, siden den MALDI prosessen er ikke avhengig av analytten størrelse 7, slik fremgangsmåte gir høy følsomhet når et biomolekyl massen er over 100 kDa. Bemerkelsesverdig analyser av intakte proteiner ble utført ved hjelp av hjemmelagde instrumenter mellom slutten av 1980-tallet og begynnelsen av 1990-tallet 8-11.
MALDI-TOF kan også brukes som screening verktøy for å vurdere kvaliteten på protein prøver fordi det krever mindre tid for prøveopparbeidelse, og er mindre utsatt for FORSTYRRELCES grunn av vanlige urenheter (f.eks salter). Etter en første, rask evaluering av MALDI-MS, kan en prøve bli ytterligere analysert av ESI-TOF å bestemme massen med høyere nøyaktighet. Videre genererer MALDI ioner som inneholder færre kostnader enn ESI og derfor anskaffe og tolke MALDI data blir mer oversiktlig. Dette gjør at studentene arbeider i strukturbiologi å analysere sine rekombinante proteiner rett etter en kort opplæring.
To viktige faktorer som påvirker kvaliteten av MALDI-spektra: matriksen og den teknikk som brukes for matrisen deponering (f.eks tørket dråpe 8 og tynt lag 12-16,17,18). En enkelt organisk matrise [f.eks sinapinic syre (SA) 19-21 eller α-cyano-4-hydroxycinnamic syre (α-CHCA) 14,22,23] blir ofte brukt for MS undersøkelse av intakte proteiner og cross-linked protein komplekser . Ved hjelp av α-CHCA, Chait gruppe tidligere presentert en detaljert protokoll for preparing en ultra tynt lag før MALDI analyse av løselige og membran proteiner 14,15. Nylig Gorka et al. Illustrert grafitt-basert mål belegg for å forbedre MALDI analyse av peptider og proteiner ved hjelp av α-CHCA matriks som 24.
Her presenterer vi en enkel protokoll for analyse av intakte proteiner ved MALDI-TOF MS, å benytte en blanding av to matriser: 2,5-dihydroksybenzosyre (DHB) og α-CHCA 25.. Vi systematisk undersøkt utførelsen av DHB-CHCA blanding i forhold til de SA og α-CHCA matriser, for kontroll av intakte proteiner. Matrisen Blandingen tillater en bedre oppløsning (det vil si proteintopper er mye skarpere). Videre har nærværet av intens flere kostnader ioner (det vil si M +2 H 2 +, M +3 H 3 +, osv.) muliggjør en mer nøyaktig massebestemmelse fordi oppløsningen aksiale MALDI-TOF instrumenter er høyere ved lavere masse over kostnad (m / z) 26. Dette er spesielt nyttig for molekylvektbestemmelse av proteiner som er større enn 100 kDa.
Høyere følsomhet er også nås ved hjelp av DHB-CHCA blanding (0,5 pmol protein oppdaget på MALDI mål).
Som nevnt ovenfor, er en viktig faktor som må tas i betraktning ved hjelp av MALDI instrumentet er matrisen deponering. Laugesen et al. Foreslått bruk av DHB-CHCA blandingen for første gang, 25, ved hjelp av den tørkede dråpeavsetningen. Imidlertid ble det observert bedre resultater (f.eks mye høyere sensitivitet) når vi benyttet det tynne laget metode hvor det første lag er dannet av α-CHCA oppløst i aceton. Det tynne sjikt-metoden 12,27 innebærer dannelsen av et homogent substrat i matriks-krystaller på MALDI målet, som ble beskrevet i en jove video tidligere 15. Deretter blir prøven avsatt på dette substrat, og endeligytterligere matrise er avsatt (se nedenfor). I denne artikkelen har vi også illustrere hvordan å sette prøven på MALDI målet, men også hvordan du rengjør målet 15, til recrystallize, og forberede matrisene.
For å konkludere vi tar sikte på å gi all nødvendig informasjon for å analysere intakte proteiner til forskere (særlig strukturelle biologer) som trenger å evaluere kvaliteten på produsert proteiner i en rask og enkel måte, og som ikke er så kjent med MALDI-TOF MS. Som spådd i midten av 1990-tallet 28, har MS hadde en økt betydning for biologisk forskning, som sin tilgjengelighet til biologer har økt. Vi håper at informasjonen vi blir gitt vil være nyttig å gjøre MALDI-TOF tilgjengelig for biologer og forskere som ønsker å begynne å bruke massespektrometri.
Protocol
En. Protein Prøvepreparering: Buffer Exchange (valgfritt)
5-25 pl av mikromolare konsentrasjoner av protein (1-20 uM) som er nødvendige. Buffer utveksling kan utføres ved hjelp av sentrifugal ultrafiltrasjon enheter (f.eks Vivaspin, Sartorius) eller mikro gelfiltreringsmetodene kolonner (f.eks Micro Bio-Spin 6 kromatografikolonner, Bio-Rad) 29,30. Buffer utvekslingsfremgangsmåten kan bli gjentatt to-3x. Detaljert beskrivelse av buffer utveksling ble tidligere presentert 29,30. For eksempel, bruker vi 20 mM tris (hydroksymetyl) aminometan (dvs. tris) pH 8 som endelig buffer.
Merk: Dette trinnet kan utelates i mange tilfeller. Det bør utføres når en proteinprøve inneholder molekyler eller buffere som kan sterkt påvirke MS deteksjon [for eksempel glycerol, 4 - (2-hydroksyetyl)-1-piperazin-etansulfonsyre, HEPES]. Det er også nyttig for å forbedre qusaklighet av spektrene.
2. Rekrystallisasjon av matriser for å forbedre deres Purity (valgfritt)
- Hell 10 ml 40% etanol (EtOH) inn i et Pyrex kolbe.
- Til 600 mg av en matrise.
- Ved hjelp av et vannbad, og et motstandsvarmeapparatet, å varme matriseløsning og omrør den før matrisen blir fullstendig oppløst ved hjelp av en glasstav og en magnetrører.
- Gjenta trinn 2 til du har en mettet løsning.
Merk: Ved hjelp av et for stort volum av oppløsningsmiddel eller oppløsnings matrisen langt under kokepunktet for oppløsningen vil føre til et dårlig utbytte av krystaller eller ingen krystaller i det hele tatt.
- Tillat løsningen å avkjøles langsomt. Kan la den ved værelsestemperatur i flere timer og deretter ved 4 ° C over natten. Merk: Dersom krystaller ikke er dannet, kan krystalliseringen fremkalles ved å skrape innsiden av begerglasset (like under løsning fra overflaten) ved bruk av en glassrørestav.
- Samle matrise krystaller ved filtrering.
- Vask krystallene med en minimumsmengde iskald oppløsningsmiddel og filtrere dem.
- La krystallene til tørk. Du kan bruke vakuum for dette trinnet.
Tre. Rengjøring av MALDI Stainless Steel Target
- Skyll MALDI plate med metanol (MeOH) og tørk forsiktig med en rengjøring vev spesielt laget for laboratoriebruk (f.eks Kimwipe).
- Skyll målet med H 2 O og tørk den med en ren vev.
- Sett MALDI plate i et 600 ml begerglass og dekke den med 50% EtOH.
- Sonicate målet i EtOH oppløsningen i 10 minutter i et ultralydbad.
- Hvis det er rester igjen på tallerkenen, gjenta trinnene 1-4 igjen.
- Til slutt skylles målet med MeOH (eller med vann, se note nedenfor), vipper det på en slik måte at all væske er samlet i en vaske vev. La målet tørt ved romtemperatur eller ved hjelp av en nitrogengasstrømmen.
Merk: En lignende prosedyre ble tidligere beskrevet 15.
Merk: oppløsningsmiddel (MeOH eller vann) som benyttes for den siste skylling av målet bestemmer noen mål-egenskaper. Hvis målet blir skylt med MeOH, sprer prøven på målet mye mer enn ved bruk av vann.
4. α-CHCA Thin Layer Løsning: Forberedelse og Nedfall på MALDI Target
- Oppløs α-CHCA i aceton for å foreta en mettet løsning.
- For hånd (uten noen pipette) dyppe en 10 mL spiss (f.eks GELoader Tip, Eppendorf) i α-CHCA mettet løsning: en liten mengde av oppløsningen vil flyte i tuppen (på grunn av kapillaritet).
- Trykk svært raskt (dvs. 1 sek) MALDI målet med pipettespissen og deponere α-CHCA aceton løsning på MALDI målet. Dette vil utgjøre grunnmassen tynt lag, hvor proteinetprøven vil bli deponert. Prøv å generere et tynt lag sted så liten som mulig.
Merk: Når SA som matrise, var vi et tynt lag ved hjelp av en mettet oppløsning av SA i aceton.
5. Utarbeidelse av Natrix Solutions: SA, α-CHCA, DHB og CHCA_DHB Blanding 25
- Tilbered en 20 mg / ml SA oppløsning i ACN, 0,1% TFA (70:30, vol / vol).
- Forbered 20 mg / ml α-CHCA løsning i ACN og 5% maursyre (70:30, vol / vol) [benevnt som "α-CHCA løsning"].
- Tilbered en 20 mg / ml DHB løsning i ACN og 0,1% trifluoreddiksyre (TFA) (70:30, vol / vol) [benevnt som "DHB-løsning"].
- Bland "α-CHCA-løsning" og "DHB-løsning" i forholdet 1:1 (vol / vol), for å oppnå den "CHCA_DHB løsning".
Merk: Man kan blande "α-CHCA løsning" og "DHB løsning" i forskjellige forhold, når analysere proteiner med masse mindre enn 100 kDa. For EXAmple en ratio på 40:60 mellom α-CHCA og DHB (vol / vol) gir en bedre oppløsning, men mindre følsomhet (se diskusjon).
6. Sample Nedfall på MALDI Target
- Forekomst 0,5 ul av proteinet prøven på forhånd fremstilt α-CHCA tynt lag. Umiddelbart etter dette, tilsett 0,5 mL av matrise-oppløsningen (dvs. SA løsning eller α-CHCA løsning eller "CHCA_DHB mix"). Dette innebærer å blande prøven og matrisen på målet.
Merk: vanligvis en blander proteinprøven med matrisen i et 1:1 forhold. Dette forholdet er avgjørende for den gode kvaliteten på MALDI spektra. Hvis du ønsker å teste ulike prøve konsentrasjoner, kan du bruke ACN_formic syreløsningen (beskrevet ovenfor) for å fortynne prøven.
Merk: Hvis du foretrekker det, kan du blande prøven og matrisen i et rør, og deretter sette den blandede "sample_matrix løsningsjon "på det tynne laget.
Merk: Vi anbefaler deg å teste ulike prøve konsentrasjoner fordi fortynne prøven kan du redusere forstyrrelser av forurensninger. Å fortynne prøven, kan du bruke ACN_formic syreløsningen (beskrevet ovenfor) for å fortynne prøven.
7. Calibrant Nedfall
- Depositum 0,5 mL av kalibreringsstandard (for eksempel "protein standard II", Bruker Daltonics, Bremen) deretter legge 0,5 mL av matrisen løsning.
Merk: Legg i kalibrerings på MALDI plate ved siden av protein prøven flekker (se diskusjon).
8. MALDI Spectra Oppkjøp av Calibrant og proteinprøver
Når prøvene og kalibrerings er tørket, kan du observere "flekker" under et mikroskop. Denne observasjonen er valgfri og kan være interessant hovedsakelig til nybegynnere. Å tilegne prøven spektra, setter the målet i MALDI-TOF instrument og velge de riktige instrumentale parametere som er forskjellig for hver type utstyr. For å få den mest passende oppsett man bør følge produsentens anbefalinger. Som generelle betraktninger når analysere intakte proteiner, bør man bruke instrumentet i lineær modus (ikke i reflektor-modus, noe som er hensiktsmessig for peptider analyser). Normalt vi utnytte vår instrument i positiv-ion-modus. Videre er en sentral parameter på "pulset ion utvinning" som forbedrer instrumental oppløsning 31. Enkelt sagt, kan den "pulset ion utvinning" defineres som en pause mellom generering av prøven ioner og den tiden da de ioner blir akselerert mot detektoren. Når du analyserer intakte proteiner, bør man utnyttet en "pulset ion utvinning" (f.eks 500 EFF) større enn når observere peptider (f.eks 80 EFF).
Velg riktig m / z serien, erverve spektra of kalibrerings, og kalibrere instrumentet. Når du kjøper spektra av prøvene, bruke riktig laser intensitet (se diskusjon).
Representative Results
Vi analyserte en intakt protein (Kromosom region vedlikehold 1-protein, Crm1, molekylvekt: 123 386 Da) ved hjelp av to forskjellige matriser, to avleiringsmetoder, og den samme laserintensiteten (figur 1). SA og en CHCA_DHB blanding ble brukt som matriser. Blandingen ga masse spektra av høyere kvalitet i form av signal til støy-forhold og av følsomhet (figur 1A og B). Spesielt kunne vi påvise 0,5 pmol av protein avsatt på MALDI målet (figur 1C). Den samme mengde protein var knapt påvisbar ved hjelp SA (fig. 1D). Dessuten, ved bruk av matriser blandingen, den foretrukne metode for matrisen deponering var "tynt"-tilnærming (figur 1A). Bruke "tørket dråpe"-metoden, fikk vi ikke påvise noen protein med en masse høyere enn 100 kDa (data ikke vist). Utnytte CHCA_DHB blanding (figurene 1A og 1C), multipliseres ladet ion av Proteinkonn ble observert, slik at massebestemmelse med høyere nøyaktighet fordi toppoppløsningen i aksial MALDI-TOF instrumenter er omvendt proporsjonal med m / z 26.
Vi analyserte også monomere beta-galaktosidase (116.300 Da) (figur 2). De CHCA_DHB spektra var bedre enn den SA-spektra gjelder følsomhet og oppløsning. Videre, tilstedeværelsen av multiplisere ladede ioner (M-2 +, M-3 og M + 4 +) mulig for oss å bekrefte at massen av protein med høyere nøyaktighet (figurene 2A og 2C). Ved hjelp av det tynne laget tilnærmingen, har vi sammenlignet ytelsen til CHCA_DHB blandingen, SA og α-CHCA alene for analysering av et immunoglobulin, IgG (148 500 Da) (figur 3). Når vi relatere de ulike data, protein signalene var høyere og med bedre oppløsning i CHCA_DHB spektra. For å konkludere, bruken av CHCA_DHB blandingen, og det tynne laget deponeringsmetode viste betydelige forbedringer i kvaliteten av store intakt protein massespektra ervervet ved hjelp av en MALDI TOF instrument.
Figur 1. MALDI-TOF analyse av intakt kromosom regionen vedlikehold ett protein, (Crm1), molekylvekt: 123 386 Da. A) en pmol av Crm1 ble analysert ved hjelp av DHB_CHCA blanding som matrise B) mengde:. En pmol; matrise:. SA C) mengde: 0,5 pmol; matrise: D) beløp DHB_CHCA: 0,5 pmol; matrise:. SA. Signalet av toppene, uttrykt i en vilkårlig intensitet enhetsskala, blir normalisert til maksimalverdien til stede i hvert spektrum.
pg "src =" / files/ftp_upload/50635/50635fig2.jpg "/>
Figur 2. MALDI-TOF-analyse av intakt beta-galactosidase (116 300 Da). A) mengde: 20 pmol; matrise DHB_CHCA B). Antall: 20 pmol; matrise:. SA C) mengde: 5 pmol; matrise: D) beløp DHB_CHCA:. 5 pmol; matrise: SA.
Figur 3. MALDI-TOF analyse av en intakt immunoglobulin, IgG (148 500 Da), mengde:. 1,7 pmol Spektrene innhentet ved hjelp av CHCA_DHB blandingen var mye mer intense (maksimum: 8200 vilkårlig enhet, au) enn SA spektra (maksimum: 1200 au) og α-CHCA spektra (maksimum: 4500 au)
Discussion
Vi har presentert en detalj protokoll for å skaffe høy kvalitet massespektra av store intakte proteiner med molekylvekter som er større enn 100 kDa, med en MALDI-TOF instrument. En rekke kritiske aspekter vedrørende prøvepreparering bør vurderes nøye for å forbedre kvaliteten på massespektra. Matriser og løsningsmidler med høy renhetsgrad er av avgjørende betydning fordi alle forurensninger som er tilstede i matrisene og oppløsningsmidler er konsentrert på MALDI målet etter inndampning oppløsningsmiddel. For å øke renheten av MALDI matrikser er det mulig å rense dem ved hjelp av klassiske metoder for omkrystallisasjons (se ovenfor). Vi anbefaler også å nystekte forbereder matrisene løsninger (minst en gang i uken) for å bøte matrisen krystallisering og for å unngå matriksdegradering.
Matriksen deponering tilnærming er svært viktig for den endelige kvalitet av spektrene. Som beskrevet ovenfor, er det tynne laget fremgangsmåte vår metode of valg 12. Videre har vi optimalisert metode for avsetning av det første lag. Når grunnmassen er oppløst i aceton for å oppnå en mettet oppløsning, lar propanon hurtig fordampning av oppløsningsmidlet, men også gjør størrelsen av det første laget er svært vanskelig å kontrollere. Vi foreslår at du bruker en GELoader tips så lite børste som du dypper i matrix_acetone løsning for å få et minimumsvolum som du raskt sette inn på målet. Størrelsen av det første laget eller annen måte styrer den endelige størrelsen av MALDI flekk: en liten flekk (dvs. 0,5 til 0,75 mm i diameter) er å foretrekke, fordi i dette tilfellet prøvekonsentrasjonen er høyere enn i tilfellet av en stor flekk. Innhenting av en liten flekk er forskjellig fra den ultra-tynt lag tilnærming tidligere foreslått i en JOVE video 15. I Fenyo et al. Det tynne laget løsningen er spredt over hele MALDI målet med siden av en pipettespiss. Denne tilnærmingen krever testing av det tynne laget som skal tilfredsstille visse kriterier(For eksempel hastighet av fordampningen løsningsmiddel). Dersom kriteriet ikke er oppfylt, må MALDI målet skal vaskes, og et nytt tynt lag skal fremstilles. Dette gjør forberedelsene ganske arbeidskrevende for en nybegynner. Videre avsetning av prøven / matriseblandingen på plate krever aspirasjon av det overskytende oppløsningsmiddel ved hjelp av en vakuumledning, og et vasketrinn ved hjelp av TFA 15 er nødvendig, noe som gjør Fenyo et al. Preparat litt vanskeligere enn vår tilnærming.
Volumforholdet mellom matrisen og prøven er svært viktig for en vellykket analyse av intakte proteiner ved MALDI-TOF. Etter å ha testet ulike forholdstall foreslår vi å bruke et 1:1-forhold. En annen matrise: andel prøven kunne kompromittere kvaliteten på spektra, sannsynligvis på grunn av inhomogene krystallisering. Rekkefølgen som matrise og prøven avsettes er også kritisk. Etter deponering matrisen tynt lag, prøven avsettes og umiddelbart etter (før sample flekk blir tørr) den CHCA_DHB blandingen tilsettes. Denne fremgangsmåten er blitt definert som "sandwich-metoden" 27, hvor prøven alene er deponert mellom to matriselagene. Som et alternativ, kan den CHCA_DHB løsning og prøven blandes i 0,5 ml rør og deretter flekket på CHCA tynt lag 12.. Dette gir en flekk med et homogent sjikt av krystaller resulterer i høykvalitets-spektra. Ved analyse av proteiner med en masse lavere enn 100 kDa, konsentrasjonen av DHB kan økes (for eksempel 60:40 DHB: CHCA), og dette kan gi skarpere topp, men kan gå ut over målefølsomhet (dvs. mindre intense topper).
For en korrekt instrumentkalibrering, er det viktig å sette de Calibrant standarder svært nær de små punkter, slik at man får en bedre masse nøyaktighet. En "pseudo-intern kalibreringsprosedyren" ble tidligere foreslått 15: etter oppkjøpet av en prøve spekteret, den kalibrerings sted jegs laser skutt og signal av kalibrerings legges til prøven spekteret. Dette gjør at du kan internt kalibrere prøven spekteret ved hjelp av kalibrerings toppene.
Laseren energi bør også nøye kontrollert i løpet av spektra oppkjøpet. I de fleste tilfeller øker høyere energi-følsomheten, men senker oppløsning. Vi foreslår at du bruker minst mulig laser energi uten at det går utover følsomheten av oppkjøpet. Videre, for å forbedre spektral kvalitet, kan man skaffe flere skudd på hver prøve spot. Normalt flere skudd du erverver (1,000-2,000 skudd), jo høyere er intensiteten av signalet. Når trykket stedet med laser, må man finne riktig posisjon (dvs. "sweet spot"), siden utvalget ikke er homogent fordelt. Du kan skyte på samme område før signalet er økende, og deretter prøve å finne et annet område som inneholder prøven.
I konklusjonen, høy renhet av matriser og solventene, de metoder som brukes for prøven og matriser deponering på målet, plasseringen av standardene som brukes til kalibrering, intensiteten av laser energi, oppkjøpstidspunktet (antall skudd / spot) er kritiske faktorer som man bør ta hensyn til når analysere intakte proteiner ved MALDI-TOF MS.
Forfatter bidrag
LS og EBE designet forsøkene, utført massespektrometri eksperimenter, analysert data, og skrev manuskriptet.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Christophe Masselon (iRTV, CEA, Grenoble) og medlemmer av virusinfeksjon og Cancer Group ved IBS, for deres kritisk vurdering av manuskriptet og for nyttige diskusjoner. Vi er takknemlige for Cyril Dian for den type gave av proteinet Crm1. Dette vitenskapelige arbeidet fant sted i massespektrometri innretningen av Grenoble Instruere Centre (ISBG; UMS 3518 CNRS-CEA-UJF-EMBL). Det ble finansielt støttet av den franske Infrastruktur for Integrert strukturbiologi Initiative (FRISBI, ANR-10-INSB-05-02), GRAL (ANR-10-LabX-49-01) [i Grenoble Partnerskap for strukturbiologi] og etter den franske nasjonale senter for vitenskapelig forskning (CNRS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253 | |
| Trizima | Sigma | T6066 | |
| Micro Bio-Spin 6 chromatography columns | Bio-Rad | 732-6221 | |
| Vivaspin 500 | Sartorius | VS0122 | various molecular weight cut off |
| Methanol | Fluka | 14262 | |
| Ethanol | Fluka | 02860 | |
| KIMTECH SCIENCE Precision Wipes Tissue Wipers | Kimberly Clark | 05511 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma Aldrich | C8982 | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 650501 | |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid | Fluka | 39319 | |
| GELoader Tips | Eppendorf | 0030 001.222 | |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34998 | |
| Formic acid | Fluka | 09676 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich | 302031 | |
| Protein Standard II | Bruker Daltonics | 207234 | It contains Trypsinogen, Protein A, Serum Albumin-Bovine |
| Immunoglobulin G | ABSciex | GEN602151 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EQUIPMENT | |||
| Water purifier PURELAB Ultra Analytic | ELGA LabWater | 89204-052 | |
| Autoflex MALDI-TOF instrument | Bruker Daltonics | ||
| MALDI-TOF target | Bruker Daltonics | ||
References
- Rupp, B. Biomolecular Crystallography : Principles, Practice, and Application to Structural Biology. , Garland Science - Taylor & Francis Group. (2010).
- Cohen, S. L., Chait, B. T. Mass spectrometry as a tool for protein crystallography. Annual review of biophysics and biomolecular structure. 30, 67-85 (2001).
- Chait, B. T. Mass spectrometry--a useful tool for the protein X-ray crystallographer and NMR spectroscopist. Structure. 2, 465-467 (1994).
- Gans, P., et al. Stereospecific isotopic labeling of methyl groups for NMR spectroscopic studies of high-molecular-weight proteins. Angew Chem Int Ed Engl. 49, 1958-1962 (2010).
- Wilm, M. Principles of electrospray ionization. Molecular & cellular proteomics : MCP. 10, M111 009407 (2011).
- Urban, P. L., Amantonico, A., Zenobi, R. Lab-on-a-plate: extending the functionality of MALDI-MS and LDI-MS targets. Mass spectrometry reviews. 30, 435-478 (2011).
- De Hoffmann, E., Stroobant, V. Mass Spectrometry: Principles and Applications. , Wiley. (2007).
- Karas, M., Hillenkamp, F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Analytical chemistry. 60, 2299-2301 (1988).
- Spengler, B., Cotter, R. J. Ultraviolet laser desorption/ionization mass spectrometry of proteins above 100,000 daltons by pulsed ion extraction time-of-flight analysis. Analytical chemistry. 62, 793-796 (1990).
- Beavis, R. C., Chait, B. T. High-accuracy molecular mass determination of proteins using matrix-assisted laser desorption mass spectrometry. Analytical chemistry. 62, 1836-1840 (1990).
- Hillenkamp, F., Karas, M., Beavis, R. C., Chait, B. T. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of biopolymers. Analytical chemistry. 63, 1193A-1203A (1991).
- Beavis, R. C., Chait, B. T. Matrix-assisted laser desorption ionization mass-spectrometry of proteins. Methods in enzymology. 270, 519-551 (1996).
- Xiang, F., Beavis, R. C. A method to increase contaminant tolerance in protein matrix-assisted laser desorption/ionization by the fabrication of thin protein-doped polycrystalline films. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8, 199-204 (1994).
- Cadene, M., Chait, B. T. A robust, detergent-friendly method for mass spectrometric analysis of integral membrane proteins. Analytical chemistry. 72, 5655-5658 (2000).
- Fenyo, D., et al. MALDI sample preparation: the ultra thin layer method. J. Vis. Exp.. (3), e192 (2007).
- Gabant, G., Cadene, M. Mass spectrometry of full-length integral membrane proteins to define functionally relevant structural features. Methods. 46, 54-61 (2008).
- Hook, P., et al. Long range allosteric control of cytoplasmic dynein ATPase activity by the stalk and C-terminal domains. The Journal of biological chemistry. 280, 33045-33054 (2005).
- Vorm, O., Roepstorff, P. Peptide sequence information derived by partial acid hydrolysis and matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Biological mass spectrometry. 23, 734-740 (1994).
- Beavis, R. C., Chait, B. T. Cinnamic acid derivatives as matrices for ultraviolet laser desorption mass spectrometry of proteins. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 3, 432-435 (1989).
- Madler, S., Boeri Erba,, E,, Zenobi, R. MALDI-ToF Mass Spectrometry for Studying Noncovalent Complexes of Biomolecules. Topics in current chemistry. , (2012).
- Wortmann, A., Pimenova, T., Alves, S., Zenobi, R. Investigation of the first shot phenomenon in MALDI mass spectrometry of protein complexes. The Analyst. 132, 199-207 (2007).
- Beavis, R. C., Chaudhary, T., Chait, B. T. Alpha-Cyano-4-hydroxycinnamic Acid as a Matrix for Matrix-assisted Laser Desorption Mass Spectrometry. Organic Mass Spectrometry. 27, 156-158 (1992).
- Liu, Z., Schey, K. L. Optimization of a MALDI TOF-TOF mass spectrometer for intact protein analysis. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 16, 482-490 (2005).
- Gorka, J., Bahr, U., Karas, M. Graphite supported preparation (GSP) of alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) for matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI-MS) for peptides and proteins. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23, 1949-1954 (2012).
- Laugesen, S., Roepstorff, P. Combination of two matrices results in improved performance of MALDI MS for peptide mass mapping and protein analysis. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 14, 992-1002 (2003).
- Sparkman, D. O. Mass Spectrometry Desk Reference. , Global View Publishing. (2000).
- Kussmann, M., Roepstorff, P. Sample preparation techniques for peptides and proteins analyzed by MALDI-MS. Methods Mol Biol. 146, 405-424 (2000).
- Wang, R., Chait, B. T. High-accuracy mass measurement as a tool for studying proteins. Current opinion in biotechnology. 5, 77-84 (1994).
- Kirshenbaum, N., Michaelevski, I., Sharon, M. Analyzing large protein complexes by structural mass spectrometry. J. Vis. Exp. (40), e1954 (2010).
- Hernandez, H., Robinson, C. V. Determining the stoichiometry and interactions of macromolecular assemblies from mass spectrometry. Nature protocols. 2, 715-726 (2007).
- Vestal, M. L., Juhasz, P., Martin, S. A. Delayed extraction matrix-assisted laser desorption time-of-flight massspectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 9, 1044-1050 (1995).
