Summary
Modèles de souris transgéniques et knock-out de maladies neurologiques sont utiles pour étudier le rôle des gènes dans la neurophysiologie normal et anormal. Cet article décrit les méthodes qui peuvent être utilisées pour étudier la potentialisation à long terme, un mécanisme cellulaire qui peut sous-tendre l'apprentissage et la mémoire, dans transgéniques et knock-out librement comporter des modèles de souris de neuropathologie.
Abstract
Les études de potentialisation à long terme de l'efficacité synaptique, un phénomène dépendant de l'activité synaptique ayant des propriétés qui le rendent attrayant en tant que mécanisme cellulaire apprentissage et les informations de stockage sous-jacente potentiel, ont longtemps été utilisés pour élucider la physiologie des divers circuits neuronaux dans l'hippocampe, l'amygdale et les autres structures limbiques et corticales. Dans cet esprit, des modèles de souris transgéniques de maladies neurologiques représentent plates-formes utiles pour mener la potentialisation à long terme des études (LTP) à développer une meilleure compréhension du rôle des gènes dans la communication synaptique normale et anormale dans les réseaux neuronaux impliqués dans l'apprentissage, de l'émotion et de l'information traitement. Cet article décrit les méthodes pour induire de manière fiable LTP dans la souris se comporter librement. Ces méthodes peuvent être utilisées dans les études de transgéniques et knock-out se comporter librement des modèles murins de maladies neurodégénératives.
Introduction
Le développement de la technologie pour manipuler les gènes a produit des modèles de souris transgéniques et knock-out de presque toutes les maladies neurodégénératives et neurologiques. Cela a nécessité la traduction de techniques de recherche électrophysiologiques précédemment utilisés dans les grandes espèces de rongeurs dans le modèle animal de souris. Une telle technique d'investigation neurophysiologique est l'utilisation de la potentialisation à long terme (LTP) pour tester l'efficacité des connexions synaptiques dans les réseaux neuronaux impliqués dans divers troubles neuropathologiques. Ce protocole décrit les techniques pour l'exploration électrophysiologique fiable de LTP en se comporter librement souris. L'avantage de ce protocole sur les autres est qu'il est simple et facile à mettre en oeuvre, elle est aussi un peu moins coûteux car il ne nécessite pas non plus l'utilisation de systèmes de microdrive coûteux contrôlés par l'ordinateur, ni effet de champ transistor headstages, et, à notre connaissance, est le premier protocole de vidéo des enregistrements électrophysiologiques chroniques to étudier LTP en se comporter librement souris. À cette fin, nous décrivons dans cet article les méthodes simples pour l'étude de la potentialisation à long terme chez la souris se comportent librement. Ces méthodes peuvent être facilement convertis en modèles de souris transgéniques et knock-out de troubles neuropathologiques.
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Protocol
Ce protocole est approprié pour les souris de 3 à 18 mois d'âge et le poids corporel approximatif de 30 à 50 g). Les souris peuvent être obtenus auprès de The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Tous les protocoles chirurgicaux et expérimentaux ont été approuvés par le Comité de protection et d'utilisation des animaux Trinity College et étaient en conformité avec le Guide du NIH pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire.
Une. Préparation des animaux et chirurgicaux
- Préparer cocktail d'anesthésie contenant de la kétamine (25 mg / ml), de xylazine (2,5 mg / ml) et de l'acépromazine (0,5 mg / ml). Injecter 1 ml / kg de poids corporel dans le quadrant inférieur droit de l'abdomen supplémenté par des injections de 0,2 ml / kg toutes les 45 min par la suite pour maintenir une profondeur de l'anesthésie stable à l'aide du réflexe de retrait de la pédale.
- Préparer souris anesthésiée pour la chirurgie par le rasage de la fourrure sur son crâne à l'aide d'un rasoir électrique. La zone rasée devrait inclure le milieu de l'œil vers le milieu de l'oreille. Veillez à ne pas se raser la whiskers comme ils font partie du système sensoriel du baril de souris.
- Utilisez des cotons-tiges pour appliquer de l'alcool isopropylique, Betadine à la zone rasée sur la tête. Puis, en utilisant également des cotons-tiges, appliquer une petite quantité d'huile minérale sur les yeux pour éviter les yeux de sécher.
- Utilisation infantiles poignets de l'oreille de rat au lieu de barres d'oreilles réguliers pour monter la tête de l'animal sur le dispositif de cadre stéréotaxique. Pour ce faire, tout d'abord monter l'oreille gauche sur la manchette de l'oreille gauche. Puis déplacez doucement l'oreille droite sur le poignet droit en soutenant doucement la tête de l'animal avec une main et l'avancement de la manchette de l'oreille de l'autre main. Ensuite, placez un coussin chauffant sous le corps de l'animal et le mettre à 86 ° C pour maintenir la température du corps.
- Ensuite, vérifier la rigidité bilatérale en tentant de déplacer le côté de la tête à l'autre. L'animal est correctement monté sur le cadre stéréotaxique lorsque la tête est rigide et ne peut être déplacé latéralement, mais peut facilement pivoter vers le haut et vers le bas.
- Reposer doucement lale museau de la souris sur la barre nez / dent ensemble faire en sorte que les incisives se reposent doucement mais fermement dans l'ouverture de la dent de l'nez / dent.
- L'utilisation d'un scalpel stérile, faire une incision médiane à partir du milieu de l'œil vers le milieu de l'oreille. Assurez-vous que le scalpel est lieu à un angle de 45 ° et appliquer une pression suffisante pour couper à travers l'aponévrose sous-jacente mais pas à travers le crâne car cela causer des saignements excessifs.
- Utilisez des cotons-tiges pour séparer le fascia et exposer le crâne. Crâne landmarks bregma et lambda doit être clairement visible (figure 1A). Assurez-vous que l'animal est en position de crâne plat en ajustant la barre nez / dent de telle sorte que Bregma et lambda sites sont à même le poste dorso-ventral (DV) (+ 0,1 mm).
- Appliquez une petite quantité de solution saline stérile à la zone exposée et utiliser des cotons-tiges pour nettoyer doucement le crâne. Ensuite, attendre 2-3 minutes pour le crâne complètement à l'air secavant de poursuivre.
- Monter une aiguille sur le bras gauche stéréotaxique pour mesurer la position de DV de bregma et lambda. Le positionnement DV de ces deux points de repère doit être de 0,1 mm à l'intérieur de l'autre. Si non, la barre de nez du cadre stéréotaxique peut être ajusté en hauteur pour atteindre cet objectif.
- Placez l'aiguille sur bregma pour enregistrer son antéro-postérieur (AP), latérale (LAT) et (DV) mesures dorso-ventral. Assurez-vous que l'aiguille touche le crâne et ne pénètre pas.
- Utilisez une souris atlas du cerveau, telles que «Le cerveau de la souris dans stéréotaxique Coordonnées" 1, pour déterminer les coordonnées des structures cibles: médial voie perforante (MPP) dans le faisceau angulaire et le gyrus denté (DG) de l'hippocampe, par rapport au lambda et bregma, respectivement (voir le tableau 1). Ensuite, utilisez un stylo à pointe fine ou un crayon pour marquer ces points sur le crâne.
- En outre, marquer deux points de plus sur le côté opposé du crâne. Ces points which servira de masse (GND) et de référence (REF) devrait être d'environ 3 mm de la ligne médiane et positionné longitudinalement par rapport à l'autre (figure 1A, également le tableau 1).
- Retirez le marqueur de l'aiguille du bras stéréotaxique gauche et le remplacer par une fraise dentaire électrique équipé d'une monture stéréotaxique. Placez le forage sur chaque point marqué et faire de petits trous de bavures d'environ 0,5 mm de diamètre. Lors du perçage, utiliser un mouvement de va-et-vient répétitif et vérifier fréquemment si le forage a pénétré dans le crâne pour exposer la surface du cerveau.
- Doucement mais conduire fermement une électrode à vis (# 0-80 1/8 à vis de la machine en acier inoxydable, fendue Vis à tête) dans chacun des trous controlatérale (GND et REF) de telle sorte que ce qu'ils touchent la surface corticale sans la pénétrer (figure 1A ). Ces deux électrodes à vis servent de terrain et de référence.
- Monter stimulantes et d'enregistrement des électrodes dans l'électroDE supports sur les bras gauche et droit stéréotaxiques, respectivement.
- Connectez les électrodes bornes stimulant à un stimulateur électrophysiologique à l'isolement actuel et la borne d'électrode d'enregistrement à un amplificateur électrophysiologique différentiel (gain = 1000, filtre passe-bande = 1 Hz à 3 kHz), puis à un oscilloscope numérique pour l'inspection visuelle des réponses évoquées. En outre, la connexion GND et des bornes d'électrodes REF à l'amplificateur différentiel.
- Doucement et lentement inférieure à la fois stimulant et électrodes d'enregistrement par incréments de 0,5 mm tandis que la surveillance visuelle de la réponse évoquée à un choc de relance de 600-800 uA. Continuer à diminuer chaque électrode jusqu'à ce qu'ils atteignent leur position DV cible respectif et un signal stéréotypée est observé sur l'oscilloscope (figure 1B).
- Ensuite, utiliser du ciment acrylique dentaire pour faire un bonnet pour maintenir les bornes d'électrodes en place, tout le ciment dentaire qui touche la peau doit être essuyéeimmédiatement. Une fois que le ciment dentaire est complètement durci transférer l'animal à partir du cadre de stéréotaxie à une cage de rongeur propre. Utilisez une lampe chauffante ou un tampon pour maintenir la température de base.
- Surveillance de l'animal toutes les heures jusqu'à ce qu'il reprenne conscience. Une injection de flunixine peut être administré comme analgésique.
2. LTP induction
- Permettre à l'animal de 5-7 jours à se remettre de la chirurgie. Placer l'animal dans le milieu d'enregistrement constitué d'une cage de Faraday (122 cm x 43 cm x 43 cm) équipé d'un matériau insonorisant et un 5 canal collecteur tournant reliant l'électrode conduit à la configuration de stimulation / enregistrement.
- Laisser l'animal de s'acclimater pendant 1-2 heures dans l'environnement d'enregistrement avant de brancher les électrodes à des instruments de stimulation et d'enregistrement (reportez-vous à l'étape 1.17).
- Réglez les commandes de stimulation de la production de 400 uA et enregistrer l'amplitude d'une moyenne de 10 réponses évoquées en s'assurant eà au moins 10 secondes s'écouler entre les stimuli. Utiliser le procédé illustré à la figure 1C pour quantifier la réponse évoquée. Répétez cette procédure pour 600, 800, 1000, 1200, et 1400 uA.
- Construire une courbe d'entrée / sortie en traçant l'amplitude moyenne de la réponse évoquée par rapport à l'intensité du stimulus. D'après ce tracé déterminer l'intensité de stimulation qui correspond à 50% de l'amplitude maximale mesurée. Utiliser l'intensité de 50% pour le reste de l'expérience.
- Puis, en utilisant l'intensité du stimulus de 50%, d'obtenir un niveau de référence en enregistrant l'amplitude moyenne de 5 réponses évoquées toutes les minutes pendant 15 min. Vérifiez encore une fois au moins 10 secondes s'écouler entre les stimuli.
- Par la suite fournir la stimulation tétanique constitué de 10 salves d'impulsions délivrées à 10 400 Hz avec une vitesse de 5 Hz à la voie perforante médiane de la salve. Surveillance de l'animal de près les signes de saisie, y compris les tremblements de chien mouillé. Si l'animal a une crise de la expériment doit être terminé et toutes les données de cet animal doit être exclu des résultats de l'étude.
- Ensuite, continuer à enregistrer l'amplitude moyenne de 5 réponses évoquées toutes les minutes pendant 30 min posttetanization. Après cela, comparer cette amplitude à l'amplitude de référence obtenu à l'étape 2.5, en calculant le changement de pour cent par rapport au départ (figure 2).
- Suite à la conclusion d'expériences, l'animal est euthanasié par inhalation d'isoflurane-une méthode qui est conforme aux lignes directrices sur l'euthanasie de l'American Veterinary Medical Association.
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Representative Results
Le tableau 1 montre les coordonnées de la DG et mPP employé dans le présent protocole figure 1A montre les marquages pour les structures cibles sur le crâne;.. Sont également indiqués l'emplacement des électrodes de masse et de référence figure 1B illustre représentant réponse évoquée retrace à la fois pré- et posttetanization chez le même animal. A noter que le posttetanization réponse évoquée est plus grande que la réponse de pretetanization qui est indicatif de la LTP induction 2. Figure 1C illustre la méthode utilisée pour quantifier l'amplitude de la réponse. En effet, la figure 2 montre le changement pour cent en amplitude de la réponse sur un parcours de temps couvrant les deux périodes pré-et temps de posttetanization. Il est à noter que les valeurs de crête LTP dépassé 100%. Ces résultats du renforcement de l'amplitude de la réponse tétanisation suivant indiquent que ce protocole est un succès et donc fiable pour étudier LTPdans le modèle de souris se comporter librement.
Tableau 1. Coordonnées des structures cibles. Antéro-postérieur (AP) coordonne pour le gyrus denté (DG) et REF sont donnés par rapport au bregma, tandis que ceux pour médial voie perforante (MPP) et GND sont liés à Lambda. Toutes les coordonnées sont DV par rapport à la surface corticale dure-dessous.
Figure 1. Electrode emplacement et des traces représentatives de la réponse évoquée. A) représentation schématique de la position relative des électrodes sur la SKU de la sourisll. B) des traces typiques de la réponse évoquée à la fois avant et posttetanization. C) algorithme utilisé pour quantifier l'amplitude de la réponse évoquée.
Figure 2. LTP dans le gyrus médial perforant synapse chemin-denté. Résultat représentatif de la LTP induction dans mPP-DG synapse d'une souris se comporter librement. Remarque stimulation post-tétanisation amélioration de l'amplitude de la réponse évoquée indicatif d'induction de LTP.
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Discussion
Dans ce protocole, nous avons démontré une méthode simple et fiable pour l'étude de LTP à la DG chez la souris se comportent librement. Alors que de nombreuses études de LTP chez des rats éveillés ont été réalisées 3,4, très peu ont été menées chez des souris éveillées principalement en raison de la complexité technique posé par l'immobilier crânienne limitée chez la souris et le poids de headstages d'électrodes par rapport au poids moyen de 5 souris. Les quelques études qui ont démontré LTP à la DG en se comporter librement souris soit systèmes d'électrodes Microdrive ou transistor à effet de champ à jonction (JFET) des préamplificateurs intégrés dans le headstage qui ajoute nécessairement à la charge électrode de charge utile à l'animal 6-10 utilisés. La signification de la présente protocole est qu'il représente une amélioration par rapport aux méthodes existantes pour induire la LTP de la DG en se comporter librement souris car elle évite l'utilisation de systèmes d'électrodes Microdrive ou une headstage JFET de.
Il est importantTant de mettre en évidence les étapes critiques de ce protocole. Il s'agit notamment: 1) le montage de la tête de la souris dans le cadre stéréotaxique tel qu'il est bilatéralement rigide (cette étape peut être le plus difficile, car il exige de la pratique et la connaissance de la technique), 2) le positionnement optimal des électrodes pour optimiser la réponse ampleur peut être améliorée en s'assurant que bregma et lambda sont dans un même plan qui peut généralement être obtenue en ajustant la barre stéréotaxique de dent de trame de telle sorte que la différence de positionnement dorso-ventral du bregma et lambda n'est pas supérieure à 0,1 mm, 3) au cours de la phase d'enregistrement d' l'expérience, il est recommandé que les animaux soient autorisés de temps pour s'habituer à l'environnement d'enregistrement parce que la nouveauté de l'environnement d'enregistrement peut insinuer fluctuations dans les données de réponse évoquée recueillies; 4) choix approprié des électrodes permettra d'améliorer la qualité du signal et la fidélité: électrodes bipolaires ( acier inoxydable tube hypodermique en acier inoxydable de 0,2 mminsert de fil avec une séparation de pointe de 0,5 mm) sont préférés pour stimuler tout électrodes monopolaires (seul fils brin de tungstène epoxylite isolé) sont utilisés pour l'enregistrement dans le tissu nerveux, et 5) la souris peut être anesthésié à l'aide d'une injection intrapéritonéale d'un mélange de kétamine (25 mg / ml), de xylazine (2,5 mg / ml) et de l'acépromazine (0,5 mg / ml). Ce mélange anesthésique doit ensuite être administrée à une dose de 1ml/kg qui est habituellement efficace en environ 20 min, complétée par 0,2 ml / kg toutes les 45 min pour maintenir une profondeur de l'anesthésie stable.
Il ya quelques limitations de ce protocole qui méritent d'être mentionnés. Ce protocole ne donne aucune indication sur les mécanismes de canal ionique ou la synthèse des protéines de récepteur pouvant subserve LTP. Par conséquent peu d'informations sont disponibles concernant le nombre réel de neurones dans la population en cours d'enregistrement. Une autre limitation est que, puisque les réponses évoquées sont recueillis chez les animaux éveillés il est difficile de ASCERTain et disséquer l'effet de facteurs tels que le stress, la manipulation ou la contamination du signal enregistré par l'activité sensori-motrice parasite. Ces limitations peuvent être surmontées en s'assurant que les réponses évoquées ne sont comptabilisés que lorsque l'animal est l'état inactif, mais alerte, autrement connu comme l'état de veille de vigilance tranquille.
Néanmoins, les techniques décrites dans ce protocole constituent la plate-forme la plus physiologiquement pertinente pour étudier l'activité électrique du cerveau comportement sous-jacent. Après les étapes décrites dans ce protocole, toute la structure du cerveau peut être ciblée en utilisant les coordonnées appropriées, comme indiqué par un atlas du cerveau de la souris 1. Il est important de noter que le cadre stéréotaxique de rat adulte peut être utilisé chez les souris, à condition que les poignets de l'oreille de rat pour nourrissons appropriée sont utilisés à la place des barres d'oreilles réguliers. Les manchettes d'oreille seront immobiliser la tête sans endommager les oreilles de la souris. Enfin, les méthodes présentées ici peuvent être readily traduit de l'exploration électrophysiologique de modèles transgéniques et de souris knockout d'une multitude de troubles neurologiques.
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Disclosures
Les auteurs ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier les personnes suivantes: Dr Joseph Bronzino, le Dr Khamis Abu-Hassaballah, M. Austin RJ-LaFrance, et Mme Jessica Koranda.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine (100 mg/ml) | Henry Schein | 10177 | |
| Xylazine (20 mg/ml) | Henry Schein | 33197 | |
| Acepromazine (10 mg/ml) | Henry Schein | 2177 | |
| Dental acrylic powder | Lang Dental Manufacturing Co. | 1330CLR | |
| Dental acrylic liquid | Lang Dental Manufacturing Co. | 1306CLR | |
| Tungsten wire (0.127 mm) | World Precision Instruments | TGW0515 | |
| Stainless Steel Hypodermic Tubing (0.286 mm) | World Precision Instruments | 832400 | |
| Flunixin (50 mg/ml) | Henry Schein | 14165 | |
| Epoxilyte | Superior Essex | EP 6001-M | |
| Stainless steel wire insert (0.2 mm) | World Precision Instruments | 792900 | |
| Stereotaxic frame apparatus | Kopf Instruments | Model 902 | |
| Ear cuffs (ear cups) | Kopf Instruments | Model 921 | |
| Electrophysiological stimulator | Astro-Med, Inc. | S88 | |
| Digital oscilloscope | B K Precision Corp. | 2542 | |
| Current isolation unit | Astro-Med, Inc. | PSIU-6 | |
| Differential amplifier | World Precision Instruments, Inc. | DAM-50 | |
| Commutator | Plastics One | SLC6 | |
| Dental drill | Stoelting | 58650 |
References
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