Un metodo per la coltura embrionale C. elegans Celle

Summary

Descriviamo qui un protocollo riveduto per la cultura su larga scala di embrionale C. elegans cellule. Embryonic C. elegans cellule coltivate in vitro utilizzando questo metodo, sembrano differenziare e ricapitolare l'espressione di geni in maniera specifica cella. Tecniche che richiedono l'accesso diretto alle cellule o l'isolamento di specifici tipi cellulari da altri tessuti possono essere applicati su C. elegans cellule in coltura.

Abstract

C. elegans è un potente sistema modello, in cui le tecniche genetiche e molecolari sono facilmente applicabili. Fino a poco tempo però, tecniche che richiedono l'accesso diretto alle cellule e isolamento di specifici tipi cellulari, potrebbero non essere applicate in C. elegans. Questa limitazione è dovuta al fatto che i tessuti sono confinati all'interno di una cuticola pressurizzato che non è facilmente digeribile mediante trattamento con enzimi e / o detergenti. Basata su lavoro di pioniere da Laird Bloom, Christensen e colleghi ¹ sviluppato un metodo affidabile per la coltura di C. elegans cellule embrionali in larga scala. Le uova sono isolati dagli adulti gravide mediante trattamento con candeggina / NaOH e successivamente trattati con chitinase per rimuovere i gusci d'uovo. Le cellule embrionali sono poi dissociate da pipettaggio manuale e piastrati su substrato di vetro ricoperto nei media siero arricchito. Entro 24 ore di celle di isolamento cominciare a differenziare cambiando la morfologia ed esprimendo cellule marke specificars. C. elegans cellule coltivate utilizzando questo metodo sopravvivono superiore 2 settimane in vitro e sono stati utilizzati per elettrofisiologica, immunochimici, imaging analisi così come sono state filtrate e utilizzati per microarray profiling.

Introduction

Caenorhabditis elegans (C. elegans) è un potente organismo modello per studiare le basi molecolari della funzione cellulare, differenziamento, e il comportamento. Mentre il suo genoma, vie metaboliche e biosintetiche sono simili ai vertebrati ', la sua trattabilità genetica e molecolare sono di gran lunga maggiore ^2. Tra i suoi vantaggi sono la sua dimensione e semplice anatomia, il suo rapido ciclo di vita (3 giorni a 25 ° C), di breve durata (2 settimane) e il gran numero di figli (> 200). Grazie alla sua natura ermafrodita e breve ciclo di vita, manipolazioni molecolari e genetici sono semplici in C. elegans, compresa la generazion....

Protocol

Asterischi (*) indicano passaggi nuovi o modificati rispetto alla Christensen et al. ¹

1. Setup materiale

1. La procedura di coltura cellulare richiede grandi quantità di uova isolato dagli adulti gravide. Crescere C. elegans su 8P piastre di agar seminato con NA22 (disponibile attraverso il C. elegans Consorzio genetica - CGC) batteri per isolare grandi quantità di uova. In queste tavole la quantità di peptone usata è 8 volte l'importo che viene normalmente utilizzato per piastre NGM. La concentrazione peptone superiore sostiene la crescita di batteri NA22 più efficiente, che contrariamen....

Results

C. elegans cellule in coltura e differenziare cellule espresso marcatori specifici

Christensen e colleghi utilizzando trypan colorazione blu hanno dimostrato che il> 99% dei embrionale C. cellule elegans sopravvivono alla procedura di isolamento. Al giorno 9 e 22 dopo la placcatura, 85% e 65%, rispettivamente, sono ancora vivi ^1. Isolato embrionale C. cellule elegans devono aderire ad un substrato al fine di differenziare. Le cellule ch.......

Discussion

C. elegans è un potente organismo modello per decifrare i meccanismi genetici coinvolti nello sviluppo, il comportamento e l'invecchiamento. La sua convenienza deriva principalmente dalla facilità con cui può essere geneticamente manipolato e dal suo ciclo di vita breve. Nonostante la sua convenienza, C. elegans ha i suoi limiti. C. elegans cellule sono minuscole e confinato all'interno di una cuticola pressurizzata che limita l'applicazione di metodi che richiedono l'accesso d.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Bacto Peptone VWR	International Inc.	90000-382
Difco Agar granulato	VWR International Inc.	90000-784
Bacto Tryptone	VWR International Inc.	90000-284
Estratto di lievito Bacto	VWR International Inc.	90000-724
Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid	Invitrogen	11415-064
Siero fetale bovino	Invitrogen	16140-063
Penicillina-streptomicina	Sigma	P4333-100ML
Chitinasi da Streptomyces Griseus	Sigma	C6137-25UN
NA22 Escherichia coli	Caenorhabditis Centro
Lectina di arachidi	Sigma	L0881-10MG
Saccarosio	Sigma	57903-1KG
D-(+)Glucosio	Sigma	67528-1KG
Glicole etilenico-bis (2-amin– acido N,N,N',N'- tetraacido (EGTA)	Sigma	E0396-25G
Hepes	Sigma	H3375-500G
Colesterolo
NaCl	Sigma	57653-1KG
KCl	Sigma	P9333-500G
CaCl2	Sigma	C1016-500G
MgCl2	Sigma	M8266-100G
MgSO4	Sigma	M2643-500 g
K2HPO4	Sigma	P2222-500G
KH2PO4	Sigma	P9791-500G
NaOH		Sigma S8045-500G
KOH	Sigma	P1767-500G
Etanolo
Autoclavato distillato H2O
Candeggina
EQUIPMENT
101-1000 μ l Punte per pipette graduate blu	USA Scentific	1111-2821
Pipetta sterilizzata da 10 ml confezionata singolarmente	USA Scentific	1071-0810
Volume variabile ergonomico (100-1000 μ l) Pipettatore con espulsore di puntale	VWR International Inc.	89079-974
Apparecchio per pipette portatile, Drummond	VWR International Inc.	53498-103
Pipetta di trasferimento in plastica sterile	VWR International Inc.	14670-114
Tubo conico da 15 ml	USA Scentific	1475-1611
Tubo conico da 50 ml	USA Scentific	1500-1811
Aghi sterili calibro 18	Becton, Dickinson and Co.
Siringhe sterili da 10 ml	Becton, Dickinson and Co.
Filtri per siringhe in plastica Corning 0,20 μ m dimensione dei pori	Corning	431224
Filtro per siringa acrodico da 25 mm con 5 μ m versapor Membrana	VWR International Inc.	28144-095
Piastra Petri 60x15 mm sterile	VWR International Inc.	82050-548
Piastra Petri 100x15 mm sterile	VWR International Inc.	82050-912
Vetrini coprioggetti in vetro da 12 mm di diametro	VWR International Inc.	48300-560
Piastre per colture cellulari trasparenti 24 pozzetti a fondo piatto con coperchio	Thomas scientific	6902A09
Dumont #5- Pinze fini	Strumenti per la scienza	11254-20
Centrifuga 5702	Eppendorf	022629883
a cappa
Eppendorf con obiettivo
			umidificato ad aria ambiente