Summary
"रुक टूटेंगे," निमेटोड सी के भीतरी ऊतकों को प्रकाश में लाने के लिए एक विधि प्रोटीन स्थानीयकरण के लिए एंटीबॉडी के लिए एलिगेंस, प्रदर्शन किया है.
Abstract
सी. दाग एंटीबॉडी के साथ एलिगेंस, अपेक्षाकृत अभेद्य छल्ली रासायनिक या यांत्रिक विधियों द्वारा नजरअंदाज किया जाना चाहिए. "रुक टूटेंगे" शारीरिक रूप से, दो पक्षपाती स्लाइड्स के बीच नेमाटोड compressing उन्हें ठंड, और अलग स्लाइड खींच कर नेमाटोड से छल्ली खींचने के लिए इस्तेमाल एक विधि है. रुक टूटेंगे रासायनिक उपचार के बिना ऊतकों के लिए पहुँच प्राप्त करने के लिए एक सरल और तेजी से रास्ता प्रदान करता है और fixatives की एक किस्म के साथ प्रयोग किया जा सकता है. हालांकि, यह नमूनों में से कई का नुकसान होता है और आवश्यक संपीड़न यंत्रवत् नमूना विकृत. अभ्यास अच्छा आकारिकी साथ नमूने की वसूली को अधिकतम करने की आवश्यकता है. रुक टूटेंगे विशिष्ट निर्धारण की स्थिति, नमूने की वसूली, या कम गैर विशिष्ट धुंधला के लिए अनुकूलित किया है, लेकिन नहीं सभी मापदंडों के लिए एक ही बार किया जा सकता है. बहुत मुश्किल निर्धारण स्थितियों की आवश्यकता है और रासायनिक छल्ली permeabilize करने के लिए आवश्यक रासायनिक उपचार, treatmen बर्दाश्त कि एंटीबॉडी के लिएसमाधान में बरकरार नेमाटोड की टी पसंद किया जा सकता. एंटीबॉडी एक हल्का तय की आवश्यकता है या इष्टतम निर्धारण शर्तों अज्ञात हैं, तो फ्रीज खुर तेजी प्रतिरक्षी परख करने और ब्याज की प्रतिजन के लिए विशिष्ट subcellular और सेलुलर स्थानीयकरण जानकारी प्राप्ति कर सकते हैं एक बहुत ही उपयोगी तरीका प्रदान करता है.
Introduction
प्रोटीन के सेलुलर और subcellular स्थानीयकरण का निर्धारण करने के लिए, वैज्ञानिकों को पारंपरिक रूप से विशेष रूप से विशेष रूप से प्रोटीन 1 पहचान करने के लिए चयनित एंटीबॉडी के साथ ऊतकों में चिह्नित किया है. ऐसे सी के रूप में कुछ मॉडल जीवों में एलिगेंस, एंटीबॉडी धुंधला अक्सर अधिक तेजी से परिणाम जो आणविक आनुवंशिक तकनीक, द्वारा प्रतिस्थापित किया गया है. ये प्रमोटर और ब्याज और हरे रंग का फ्लोरोसेंट प्रोटीन के जीन की कोडिंग क्षेत्रों के बीच जीन fusions से मिलकर निर्माणों के साथ बदलने से जीवों में शामिल हैं. हालांकि, आणविक तकनीक सच प्रमोटर और उच्च प्रतिलिपि संख्या (सी एलिगेंस में सामान्य तकनीक) 2,3 पर निर्माणों की अभिव्यक्ति में परिवर्तन को जानने के साथ समस्याओं सहित कलाकृतियों की एक संख्या के अधीन हैं. इसलिए, एंटीबॉडी के साथ धुंधला vivo में प्रोटीन समारोह के अध्ययन के कई वैज्ञानिकों के लिए एक लक्ष्य रहता है.
एंटीबॉडी के साथ ऊतकों धुंधला हो जाना, मुश्किल हो सकता है क्योंकि एकtibodies केवल एक विशेष रचना 1 में उनके प्रतिजन पहचान सकते हैं. उदाहरण के लिए, एंटीबॉडी एक खास तरह से तय ही विकृत या बरकरार प्रतिजन पहचान सकते हैं और बगल में प्रतिजन नहीं पहचान सकता है. नेमाटोड में एंटीबॉडी धुंधला की समस्या निमेटोड की छल्ली ऊतकों के लिए एंटीबॉडी का उपयोग रोकने, एक अपेक्षाकृत अभेद्य बाधा रूपों है कि इस तथ्य से exacerbated है.
सी. में एंटीबॉडी धुंधला के लिए इस्तेमाल कई अलग अलग तरीके हैं एलिगेंस (हमारे पिछले काम में समीक्षा 4). बरकरार दाग 'कीड़े,' तरीके फ्रीज और एक अपेक्षाकृत कठिन लगानेवाला (formaldehyde या glutaraldehyde) में पिघलना करने के लिए विकसित किए गए, फ्रीज पिघलना चक्र लगानेवाला 5 का तेजी से प्रवेश की अनुमति के छल्ली दरार करने के लिए मदद करते हैं. तरीकों एजेंटों, collagenase, या दोनों 5-7 कम करने के साथ उपचार शामिल; निर्धारण के बाद, छल्ली एंटीबॉडी के प्रवेश को अनुमति देने के लिए permeabilized गया था. इन टीreatments आकारिकी संरक्षित है, लेकिन अक्सर एंटीबॉडी मान्यता कम या नष्ट कर दिया. वैकल्पिक तरीकों एंटीबॉडी प्रवेश की अनुमति के विच्छेदन 8 शामिल हैं.
"रुक टूटेंगे" एंटीबॉडी 9-10 धुंधला अनुमति देने के लिए अर्द्ध बरकरार कीड़ा के इंटीरियर के लिए पहुँच प्राप्त करने के लिए एक ही रास्ता है. Collagenase और कमी उपचार से परहेज करते हुए रुक टूटेंगे निर्धारण स्थितियों की एक किस्म के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है. नेमाटोड, दो चिपकने स्लाइड्स के बीच रखा गया है जमे हुए, और उसके बाद स्लाइड अलग हो रहे हैं, नीचे स्लाइड पर निमेटोड की सबसे अधिक है और ऊपर स्लाइड पर छल्ली की बहुत छोड़ रहे हैं. नीचे स्लाइड लगानेवाला में रखा जा सकता है और पालन नेमाटोड के साथ पूरे स्लाइड एंटीबॉडी धुंधला प्रक्रिया के माध्यम से स्थानांतरित किया है. विधि मौजूद दो बड़ी कठिनाइयों करता है. सबसे पहले, यह उन्हें गंभीरता से विरूपण के बिना नेमाटोड विभाजित करने के लिए आवश्यक दबाव की सही मात्रा में लागू करने के लिए मुश्किल है. दूसरा, कीड़े के कई नहीं होगाया तो स्लाइड पर टिक, और लगानेवाला या rinses में खो जाएगा. हालांकि, उचित स्लाइड और अभ्यास के साथ, विधि तेजी से fixatives और एंटीबॉडी के एक व्यापक विविधता के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है, जो उचित आकारिकी साथ नेमाटोड निकलेगा.
विधि प्रयोगकर्ता के लक्ष्य पर निर्भर करता है, थोड़ा अलग किया जा सकता है. एकल नेमाटोड का धुंधला हो जाना (जैसे एक एकल transformant एंटीबॉडी धुंधला कर दिया है कि क्या यह निर्धारित करने के लिए) वांछित है, तो अधिक से अधिक आसंजन साथ स्लाइड्स (लेकिन उच्च पृष्ठभूमि धुंधला) (नीचे देखें) इस तरह के अतिरिक्त polylysine के साथ प्रयोगशाला में तैयार स्लाइड के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. नेमाटोड इन fixations के बाद polylysine को अधिक खराब पालन के बाद से formaldehyde या glutaraldehyde निर्धारण के लिए, उच्च आसंजन स्लाइड्स (प्रयोगशाला तैयार polylysine स्लाइड), इस्तेमाल किया जाना चाहिए. जंगली प्रकार नेमाटोड मेथनॉल और / या एसीटोन के साथ तय किया जा रहा है, तो कम आसंजन के साथ स्लाइड्स और कम पृष्ठभूमि धुंधला इस्तेमाल किया जाना चाहिए (वाणिज्यिक या एल) स्लाइड aboratory तैयार. एंटीबॉडी और fixatives की एक किस्म प्रयोगशाला में इस्तेमाल किया जा रहा है, तो स्लाइड्स की एक चयन के समय से आगे तैयार किया जा सकता है और जब तक जरूरत संग्रहीत.
निमेटोड ऊतक के लिए पहुँच प्राप्त करने के बाद, एंटीबॉडी धुंधला प्रक्रियाओं (अब ऊतकों की विशेषता incubations बजाय कोशिकाओं 1,11) के साथ मानक तरीकों का पालन करें.
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Protocol
नोट: एकाधिक प्रोटोकॉल कदम सेट अप और प्रयोग की विशिष्ट परिस्थितियों के आधार पर तैयार करने के लिए विकल्पों के साथ प्रस्तुत कर रहे हैं. इन मामलों के लिए, वैकल्पिक कदम वैकल्पिक कदम के साथ प्रोटोकॉल चित्रा 1 में उल्लिखित है ए, बी, सी, आदि के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं.
1. Polylysine लेपित स्लाइड्स की तैयारी
स्लाइड्स के तीन अलग अलग प्रकार की तैयारी, रिश्तेदार आसंजन, और एंटीबॉडी के गैर विशिष्ट बंधन में आसानी के बीच वांछित व्यापार बंद के आधार पर इस्तेमाल किया जा सकता है. स्लाइड तैयार करने के लिए विकल्प के विवरण आसंजन और बढ़ती जटिलता के क्रम में कदम 1 ए -1 सी में नीचे दिए गए हैं. इन विभिन्न तरीकों से तैयार स्लाइड एक ही प्रयोग के लिए एक साथ इस्तेमाल किया जा सकता है.
1 ए. कोई स्लाइड तैयारी
व्यावसायिक रूप से उपलब्ध polylysine लेपित स्लाइड्स कम आसंजन और कम पृष्ठभूमि प्रदान करते हैं.
-1 बी. स्लाइड जनसंपर्कमेथनॉल एसीटोन निर्धारण के लिए eparation इष्टतम
मध्यम आसंजन और कम पृष्ठभूमि.
- स्लाइड्स की सूई के लिए एक polylysine समाधान तैयार: बहुत उच्च आणविक वजन के 400 मिलीग्राम जोड़ें - दोहरा आसुत जल 200 मिलीलीटर (150,000 300,000 डी) पाली एल lysine. एक संरक्षक के रूप में 2 मिलीलीटर 10% सोडियम azide शेयर (अंतिम एकाग्रता 0.1%) जोड़ें. चेतावनी: सूखे सोडियम azide प्रतिक्रियाशील है और सभी रूपों विषाक्त कर रहे हैं. वजन पाउडर दोहरा आसुत जल में 10% शेयर बनाने के लिए, जबकि मुखौटा और दस्ताने पहनते हैं.
- एक प्रकार का वृक्ष मुक्त पोंछे, हटाने smudges और कणों के साथ ही अंत पाले सेओढ़ लिया गिलास स्लाइड साफ कर लें. इस पद पर नियुक्ति के साथ खरीदा स्लाइड्स पर भी किया जाना चाहिए "precleaned."
- जगह वापस करने के लिए वापस एक स्लाइड धारक में, Coplin जार या अन्य स्लाइड धुंधला कंटेनर, (बाद में जुदाई आसान बनाने के लिए) ऊपर और नहीं काफी पूरी तरह से गठबंधन तुहिनाच्छादित किनारों रखने स्लाइड. 70% इथेनॉल (अभिकर्मक ग्रेड शराब की जरूरत नहीं) डी में 1% एचसीएल के साथ साथ बीकर में टुकड़ा धारक रखेंपानी सुन्न या frosting के स्तर को धुंधला जार भर. 5 मिनट की एक न्यूनतम के लिए समाधान में स्लाइड्स रॉक. चेतावनी: इस समाधान जंग नहीं लगता, दस्ताने पहनते हैं. नोट: यह समाधान (कई महीनों तक) कई बार reused किया जा सकता है.
- 1 मिनट के लिए आसुत पानी चलाने में स्लाइड्स कुल्ला.
- 30-60 मिनट के लिए एक 40-60 डिग्री सेल्सियस ओवन में रखकर या कमरे के तापमान पर रातोंरात रखने के द्वारा या तो एक धूल मुक्त वातावरण में पूरी तरह से सूखे स्लाइड.
- 15 मिनट के लिए घुमाव पर (unfrosted हिस्सों को कवर) polylysine समाधान में स्लाइड्स सेते हैं.
- स्लाइड्स के सूखने दोहराएँ.
- Polylysine समाधान ऊष्मायन और सुखाने के चरणों को दोहराएँ.
- इस तरह के एक पतली वजन रंग के रूप में एक पतली धातु की वस्तु का उपयोग कर स्लाइड अलग करें. वे ठीक से पालन कर रहे हैं, वे अलग करना मुश्किल है. उचित सुरक्षा गियर (सुरक्षा चश्मा) पहनें और स्लाइड अलग हो रहे हैं जब कांच के छोटे टुकड़े ढीला उड़ सकता है, (इस्तेमाल के बाद त्याग करने) बेंच शीर्ष कागज पर काम करते हैं.
- स्वच्छ में दुकान स्लाइड्स4 डिग्री सेल्सियस (धूल से मुक्त) स्लाइड बॉक्स की जरूरत तक.
1C. Formaldehyde के निर्धारण के लिए तैयारी इष्टतम स्लाइड
उच्चतम आसंजन लेकिन उच्च पृष्ठभूमि.
- (हवा सुखाने के लिए) (ओवन में सुखाने के लिए) एक धूल से मुक्त, ओवन सुरक्षित पकवान में या एक फ्लैट धूल मुक्त सतह पर विधि 1 बी फ्लैट के साथ तैयार प्लेस स्लाइड.
- प्रत्येक स्लाइड के बीच पर polylysine समाधान की एक 20-60 μl बूंद रखें.
- पूरी तरह से ओवन में या कमरे के तापमान पर सूखी स्लाइड्स. यह उड जाती है polylysine पीला अंडाकार पीछे छोड़ देंगे. ये अंडाकार बहुत चिपकने वाला हैं. दुर्भाग्य से, वे भी भी अवरुद्ध करने के बाद, प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए बाध्य.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर साफ (धूल से मुक्त) स्लाइड बॉक्स में दुकान स्लाइड्स की जरूरत तक.
2. जमे हुए निमेटोड स्लाइड्स की तैयारी
पूरी तरह से (नेमाटोड की प्लेटों के लिए) विधि 2A का उपयोग जीवाणु से मुक्त rinsing या द्वारा धुंधला के लिए नेमाटोड की तैयारी2 बी (व्यक्तिगत नेमाटोड के लिए).
2A. नेमाटोड की प्लेटों से स्लाइड्स की तैयारी
- Prechill के लिए सूखी बर्फ पर धातु का एक फ्लैट टुकड़ा रखें.
- एक 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब में बैक्टीरिया के साथ एन जी एम थाली से कीड़े कुल्ला करने के लिए आसुत जल और एक गिलास विंदुक (कीड़े का नुकसान कम हो जाती है) या micropipette का प्रयोग करें. प्लेट्स उम्र सिंक्रनाइज़ या मिलाया जा सकता है, जब तक आवश्यक (दरार के लिए कठिन) कई dauers या भूखे कीड़े (वृद्धि हुई autofluorescence) के साथ प्लेटों का प्रयोग नहीं करते.
- बैक्टीरिया से मुक्त जब तक आसुत पानी के साथ कीड़े 3-4x कुल्ला. (कीड़े के नुकसान को कम करने के लिए एक ही गिलास पिपेट का उपयोग करें.), या तो कीड़े गोली उन्हें (ट्यूब के नीचे ज्यादातर वयस्कों को इकट्ठा करने के लिए) 3-5 मिनट के लिए बेंच पर बैठने या ~ 1000 rpm पर 30 सेकंड स्पिन जाने के लिए (~ 500 एक tabletop अपकेंद्रित्र में छ) () वयस्कों, लार्वा, और भ्रूण को इकट्ठा करने के लिए.
- कीड़े के रूप में पानी के बारे में दो बार मात्रा छोड़ने, कीड़े के साथ ट्यूब से पानी की सबसे निकालें (लेकिन कम से कम 25 μl कुल मात्रा).
- उपलब्ध नियमित (सफाया स्वच्छ लेकिन polylysine इलाज नहीं) "ऊपर" स्लाइड्स की संख्या बराबर.
- प्लेस ~ "नीचे" पक्षपाती स्लाइड पर और पिपेट टिप की ओर का उपयोग कर स्लाइड के मध्य भाग से अधिक कीड़े युक्त तरल फैल पानी में 25 μl कीड़े.
- कीड़े 30 सेकंड मिनट से 2 के लिए समझौता करते हैं. स्लाइड उचित चिपचिपा है तो वे स्लाइड संपर्क के रूप में, कीड़े के सिरों रहना होगा.
- एक हाथ में नीचे स्लाइड पकड़ो और पाले सेओढ़ लिया भागों लेकिन सभी अतिव्यापी हैं कि इतना नीचे स्लाइड पर शीर्ष स्लाइड जगह. कीड़े अभी भी थोड़ा स्थानांतरित इतना है कि तरल, थोड़ा अलग स्लाइड्स रखना चाहिए स्लाइड एक दूसरे पर पर्ची न जाने क्या -. इस कीड़े twists.
- ध्यान से सीधे नीचे प्रेसधीरे से ऊपर स्लाइड पर, प्रत्येक हाथ के अंगूठे और forefingers का उपयोग कर. दबाव की आदर्श राशि के साथ, स्लाइड के किनारे पर सबसे बड़ा hermaphrodites की कुछ वयस्क और लार्वा की सबसे प्रत्येक स्लाइड से संपर्क करेगा, जबकि टूटना होगा लेकिन बरकरार रहेगी.
- तुरंत और सावधानी (फिसल के बिना) सूखी बर्फ पर धातु के टुकड़े पर स्लाइड डाल दिया. स्लाइड एक मिनट के भीतर जमे हुए दिखाई देनी चाहिए. अच्छी तरह से जमे हुए जब तक 5 मिनट के लिए सूखी बर्फ पर रखें.
- इस बिंदु पर, स्लाइड्स कई दिनों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर एक लेबल बॉक्स में संग्रहित किया जा सकता है. (वे -80 डिग्री सेल्सियस पर हफ्तों रखा जाता है, तो पानी दूर उदात्त शुरू कर देंगे और कीड़े के रूप में अच्छी तरह से दाग नहीं होगा). स्लाइड्स -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत कर रहे हैं, उन्हें खुर से पहले 10 मिनट के लिए सूखी बर्फ पर 'को गर्म करते हैं.
- 3 (निर्धारण) चरण पर जाएँ.
2 बी. व्यक्तिगत नेमाटोड की स्लाइड्स की तैयारी
- Prec करने के लिए सूखी बर्फ पर धातु का एक फ्लैट टुकड़ा रखेंपहाड़ी.
- बैक्टीरिया से उन्हें मुक्त करने के लिए एक एन जी एम थाली पर पानी की एक बूंद के लिए व्यक्तिगत नेमाटोड स्थानांतरित करने के लिए एक कीड़ा लेने का उपयोग. निमेटोड (ओं) यदि संभव हो तो, autofluorescence कम करने के लिए अच्छी तरह से खिलाया जाना चाहिए. जरूरत के रूप में कीड़ा (ओं) जीवाणु से मुक्त कर रहे हैं जब तक पानी के नए स्थानों को हस्तांतरण दोहराएँ.
- अगले सूखी बर्फ, लेबल पक्ष के साथ कंटेनर के लिए काउंटर पर अमिट स्याही और जगह स्लाइड के साथ "नीचे" polylysine स्लाइड्स के तुहिनाच्छादित पक्ष लेबल. कम पक्षपाती "ऊपर" की एक समान संख्या में उपलब्ध (इलाज) स्लाइड है.
- Polylysine साथ डबल इलाज नीचे स्लाइड के क्षेत्र पर पानी की एक 5-10 μl बूंद रखें. अधिक कीड़े स्थानांतरित अगर पूरा होने से पहले evaporating से पानी को रोकने के लिए, बड़ी मात्रा में प्रयोग करें.
- कीड़े चिपचिपा स्लाइड सतह को छूने के लिए नीचे सिंक के रूप में देखने के लिए माइक्रोस्कोप का उपयोग, कीड़ा लेने के साथ पानी की बूंद के लिए कीड़ा (ओं) स्थानांतरण. बूंद प्रति के रूप में कई + 20 के रूप में कीड़े के रूप में कुछ के रूप में एक कीड़ा स्थानांतरण.
- नीचे पकड़एक हाथ में LIDE और पाले सेओढ़ लिया भागों लेकिन सभी अतिव्यापी हैं कि इतना नीचे स्लाइड पर शीर्ष स्लाइड जगह.
- तुरंत और सावधानी (फिसल या compressing के बिना) सूखी बर्फ पर धातु के टुकड़े पर स्लाइड डाल दिया. 5-30 मिनट के लिए सूखी बर्फ पर रखें. (स्लाइड आसानी से बाहर सूखी के रूप में, इन स्लाइड्स दीर्घकालिक दुकान नहीं है.)
- 3 (निर्धारण) चरण पर जाएँ.
3. नियतन
Fixatives या तो precipitating द्वारा 'ठीक' सेल में जगह में प्रतिजन, ("प्रकाश निर्धारण") या पार से जोड़ने ("हार्ड निर्धारण") प्रतिजन के लिए आवश्यक हैं. फिक्सेशन प्रतिजनकता बाधित हो सकता है, सबसे अधिक जाना जाता एंटीबॉडी एक विशेष निर्धारण शर्त के साथ सबसे अच्छा काम करते हैं. नई एंटीबॉडी के लिए, निर्धारण स्थितियों की एक श्रृंखला का परीक्षण किया जाना चाहिए.
किसी भी निर्धारण के लिए, पहला कदम फॉस्फेट बफर खारा समाधान बनाने के लिए है. विधि एक (प्रकाश का उपयोग एंटीबॉडी धुंधला के लिए नेमाटोड के साथ अगले तय स्लाइड्समेथनॉल और एसीटोन) या बी (formaldehyde या glutaraldehyde का उपयोग कठिन तय करने) का उपयोग कर तय कर लो.
- 80 छ NaCl, 2.0 जी KCl, 27.2 जी 2 4 HPO • एच ना जोड़कर एक बाँझ 10x पीबीएस (फॉस्फेट बफर खारा) शेयर समाधान तैयार 2 0, 2.4 जी के.एच. 2 पीओ 4, 20 मिलीलीटर 10% सोडियम azide शेयर. यह स्टॉक समाधान बनाने के लिये दोहरा आसुत जल में 10% समाधान बनाने के लिए सोडियम azide पाउडर बाहर तौलना. जब तक भंग कोमल गर्मी के साथ खारा हिलाओ. चेतावनी: सूखे सोडियम azide प्रतिक्रियाशील है और सभी रूपों विषाक्त कर रहे हैं. ड्राई सोडियम azide या समाधान के साथ कार्य करते समय नकाब और दस्ताने पहनते हैं.
- 1-10 एम NaOH के साथ 7.2 खारा शांत (Tris पीएच संवेदनशील तापमान है) करते हैं, तो पीएच. दोहरा आसुत जल और बाँझ आटोक्लेव साथ 1 एल के लिए ऊपर. कमरे के तापमान पर स्टोर और बाँझ दोहरा आसुत जल के साथ की जरूरत के रूप में 1x को पतला. चेतावनी: NaOH कास्टिक है - प्रयोग के दौरान दस्ताने पहनते हैं.
3 ए. मेथनॉल एसीटोन का उपयोग बत्ती तय
- कम से कम 10 मिनट के लिए prechill को बर्फ पर धुंधला जार में 100% मेथनॉल, 100% एसीटोन, और 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) रखो. चेतावनी: मेथनॉल और एसीटोन, विषाक्त कर रहे हैं दस्ताने पहनते हैं.
- , सूखी बर्फ से नीचे और ऊपर स्लाइड की एक जोड़ी ले तेजी से उन्हें अलग मोड़, और तुरंत 2 मिनट के लिए बर्फ ठंड मेथनॉल में "नीचे" स्लाइड विसर्जित कर दिया. "ऊपर" स्लाइड खारिज किया जा सकता है.
- 4 मिनट के लिए ठंडे एसीटोन बर्फ मेथनॉल से स्लाइड्स स्थानांतरण. स्लाइड्स कई कीड़े था, (90%) सबसे भी सबसे अच्छा तैयार स्लाइड के साथ, ठीक में गिर जाएगा. एक कीड़ा स्लाइड ठीक से तैयार किए गए हैं, कीड़े पालन रहना चाहिए.
- जगह या पीबीएस (लगानेवाला कुल्ला करने के लिए) के साथ जार में स्लाइड्स डुबकी और 4 (धुंधला) कदम आगे बढ़ना.
3 बी. Formaldehyde या glutaraldehyde का उपयोग हार्ड तय
- 0.5-4% अंतिम एकाग्रता 1x पीबीएस में अभिकर्मक ग्रेड formaldehyde या glutaraldehyde समाधान पतला. Aliquots (1.5 एमएल) एमएY कसकर -20 -30 डिग्री सेल्सियस पर छाया हुआ संग्रहित किया जाना, बस का उपयोग करने से पहले बर्फ पर aliquots defrost. नोट: formaldehyde समाधान समय पर और हवा के संपर्क से नीचा. चेतावनी: formaldehyde और glutaraldehyde दस्ताने पहनते हैं और हुड में काम करते हैं, विषाक्त कर रहे हैं.
- , सूखी बर्फ से नीचे और ऊपर स्लाइड की एक जोड़ी ले तेजी से उन्हें अलग मोड़, और तुरंत ढक्कन के साथ फ्लैट पकवान में कीड़े के साथ "नीचे" स्लाइड जगह. (शीर्ष स्लाइड खारिज किया जा सकता है).
- तुरंत कीड़े के साथ स्लाइड के क्षेत्र के केंद्र पर 200 μl विषाक्त लगानेवाला पिपेट. लगानेवाला आंशिक रूप से स्लाइड के एक बड़े क्षेत्र को कवर करने के लिए पिघला तो, जगह में फ्रीज होगा.
- कीड़े पूरी तरह लगानेवाला के साथ कवर नहीं कर रहे हैं, तो तुरंत और ध्यान से एक micropipette का उपयोग अधिक लगानेवाला जोड़ें. लगानेवाला स्लाइड के किनारे पर प्रवाह करने की अनुमति न दें.
- एक ढक्कन के साथ पकवान कवर और 10 मिनट के लिए रात भर कमरे के तापमान पर के लिए छोड़ दें. अब incubations गिरफ्तारी पकवान humidified है सुनिश्चित करेंउपयोग किए गए ई - इस डिश के लिए मुड़ा हुआ गीला प्रकार का वृक्ष मुक्त पोंछे जोड़कर किया जा सकता है. पोंछे स्लाइड छूना मत देना.
- निर्धारण के पूर्ण होने पर, ध्यान से एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में ढीला कीड़े के साथ लगानेवाला पिपेट और पीबीएस के साथ एक धुंधला जार में स्लाइड डुबकी.
- गोली 30 सेकंड के लिए उच्च गति पर ढीला आया कि कीड़े के साथ ट्यूब स्पिन. पीबीएस के साथ दो बार कीड़े कुल्ला, तो स्लाइड पर कीड़े (बल्कि स्लाइड पर से microfuge ट्यूबों में कदम कर) के साथ समानांतर में प्रक्रिया.
- 4 (धुंधला) कदम आगे बढ़ना.
4. एंटीबॉडी धुंधला
एंटीबॉडी धुंधला प्रोटोकॉल स्लाइड पर किसी भी ऊतक के लिए मानक प्रोटोकॉल के समान है. इस प्रोटोकॉल की परवाह किए बिना कदम 1-3 में तैयारी की सभी स्लाइड्स के लिए ही है.
- 700 मिलीलीटर दोहरा आसुत जल मिश्रण से एंटीबॉडी बफर तैयार, 100 मिलीलीटर 10x पीबीएस, 5 एमएल ट्राइटन X-100 (0.5% अंतिम), 2 मिलीलीटर 0.5 एम EDTA पीएच 8 (1 मिमी अंतिम), 1 ग्राम बीएसए (0.1% अंतिम), 5 एमएल 10% सोडियम AZआईडीई समाधान (अंतिम 0.05%). एचसीएल के साथ 7.2 पीएच, तो 1 एल को दोहरा आसुत जल जोड़ने, 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान
- 45 मिलीलीटर एंटीबॉडी बफर (अंतिम 10% सीरम) को 5 मिलीलीटर सीरम जोड़ने, फिर दोहरा आसुत जल के साथ गधा सीरम पुनर्गठन द्वारा ब्लॉक तैयार करें.
- एंटीबॉडी बफर प्लस 1% BSA में एंटीबॉडी गिराए द्वारा प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें. अनुशंसित dilutions माध्यमिक एंटीबॉडी (प्राथमिक एंटीबॉडी बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया प्रजातियों के खिलाफ Cy3or OG488 संयुग्मित गधा एंटीबॉडी) के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए 1:50-1:2,000 और 1:1,000-1:5,000 हैं.
- दोहरा आसुत जल में 2.5 मिलीग्राम / एमएल मिश्रण से DAPI स्टॉक तैयार करें; सेल्सियस -30 पर जमे हुए 8 μl aliquots में दुकान चेतावनी: DAPI, एक जहरीले डीएनए बाध्यकारी डाई है वजन और aliquots में वितरण करते समय दस्ताने पहनते हैं.
- 200 मिलीग्राम N-propyl gallate, मिश्रण से 10 मिलीलीटर बढ़ते मध्यम तैयार 0.3 एमएल 1 एम Tris पीएच 9, एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 2.7 मिलीलीटर दोहरा आसुत जल. लगभग 10 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर हीट जब तक भंग.अच्छी तरह से 7 मिलीलीटर ग्लिसरॉल और DAPI की एक 8 μl विभाज्य और भंवर जोड़ें. विभाज्य मध्यम 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों में, पन्नी में लपेट, और 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में दुकान (हवा और प्रकाश दोनों मध्यम नीचा - इसे और अधिक पीला हो जाता है, तो Biohazard बेकार में त्यागने). चेतावनी: N-propyl gallate वजन जबकि दस्ताने पहनते हैं, एक प्रतिक्रियाशील एंटी ऑक्सीडेंट है.
- 4 डिग्री सेल्सियस (कठिन तय करने के लिए रातोंरात बेहतर) में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए या रातोंरात ब्लॉक के साथ एक धुंधला जार करने के लिए स्लाइड स्थानांतरण. खोने कीड़े से बचने के झटकों से बचें.
- स्थानांतरण एक humidified पकवान और शीर्ष 100-500 μl प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ प्रत्येक में फ्लैट प्राथमिक एंटीबॉडी या जगह स्लाइड के साथ जार धुंधला करने के लिए स्लाइड. झटकों के बिना 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात स्लाइड्स सेते हैं.
- प्राथमिक एंटीबॉडी ऊष्मायन के बाद, स्थानांतरण पीबीएस के जार धुंधला करने के लिए स्लाइड.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर फिल्टर पेपर और दुकान से अटे कीप के माध्यम से ब्लॉक फिल्टर, बाँझ फ़िल्टर की हर 1-2 सप्ताह, ब्लाक 1 महीने या उससे अधिक के लिए पुन: उपयोग किया जा सकता है. इसी तरह, फिल्टर और बचाने(धुंधला के लिए 10 या अधिक राउंड के लिए) पुन: उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर प्राथमिक एंटीबॉडी.
- कुल्ला प्रतिरक्षी बफर में तीन बार (~ 20 मिनट प्रत्येक) स्लाइड.
- एक हलका सा धुंधला कंटेनर में माध्यमिक एंटीबॉडी में स्लाइड प्लेस और 4 डिग्री सेल्सियस पर कमरे के तापमान या रातोंरात पर 4 घंटा सेते
- स्थानांतरण पीबीएस के जार धुंधला करने के लिए स्लाइड. फ़िल्टर और (धुंधला के लिए 10 या अधिक राउंड के लिए) पुन: उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर माध्यमिक एंटीबॉडी बचा.
- कुल्ला प्रतिरक्षी बफर में तीन बार (~ 20 मिनट प्रत्येक) स्लाइड.
- स्थानांतरण पीबीएस के लिए स्लाइड और माउंट करने के लिए तैयार है जब तक (मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर) पीबीएस में छोड़ दें.
- स्लाइड के मोर्चे पर कीड़े गीला रहने के लिए इतना है कि, व्यक्तिगत स्लाइड्स पर तेजी से काम करते हैं. एक प्रकार का वृक्ष मुक्त पोंछे के साथ वापस स्लाइड की सूखी, पीबीएस से एक स्लाइड निकालें, और कागज तौलिया पर जगह.
- प्लेस ~ स्लाइड और धीरे दो समाधान मिश्रण करने के लिए झुकाव स्लाइड पर मध्यम और पीबीएस लगभग बराबर भागों रहे हैं कि इतने कीड़े खत्म बढ़ते मध्यम के 20 μl. CAUTआयन: बढ़ते मध्यम विषैला होता है.
- झुकाव स्लाइड ताकि तुहिनाच्छादित धार कम है और समाधान frosting के निकट बटोरता है, तो समाधान पर 24 X 60 मिमी coverslip के एक किनारे रख दें.
- धीरे (विरंजन बढ़ाने के लिए और देखने को बाधित करता है) हवाई बुलबुले को कम करने के लिए coverslip कम है. बुलबुले फार्म है, तो कीड़े भर coverslip फिसलने के बिना यह relower, धीरे धीरे coverslip के किनारे उठा.
- ध्यान से एक प्रकार का वृक्ष मुक्त पोंछे के साथ किनारों compressing द्वारा, coverslip चलते बिना स्लाइड के किनारे से सूखी. स्लाइड की अपेक्षाकृत शुष्क किनारे सब coverslip के किनारे के आसपास दिखाई जानी चाहिए
- नेल पॉलिश के 2-3 परतों के साथ coverslip सील. स्लाइड तैयार करने और प्रकाश से बचाने के लिए भंडारण के दौरान एक फ्लैट स्लाइड धारक में रखा जा सकता है. स्लाइड अच्छी तरह से सील कर दिया है और सूखी एक बार, स्लाइड की coverslip और वापस साफ.
- अच्छी तरह से सील स्लाइड्स -20 डिग्री सेल्सियस पर 4 डिग्री सेल्सियस या सप्ताह में दिन के लिए अंधेरे में रखा जा सकता है अब अवधियों, DAPI स्टेशनडीएनए और सबसे हरे रंगों (जैसे 488 एनएम उत्तेजना) फीका के ining. किसी भी तेल विसर्जन लेंस का उपयोग करने के बाद आवश्यकतानुसार और नेल पॉलिश, जैसे के साथ coverslip reseal.
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Representative Results
कीड़े ठीक से संकुचित फटा, और हल्के ढंग से तय कर रहे हैं, लगभग पूरे कीड़ा (देखें चित्र 2) एंटीबॉडी धुंधला करने के लिए सुलभ हो सकता है. DAPI धुंधला द्वारा संकेत के रूप में नाभिक के स्थान कीड़ा के कुछ हिस्सों कीड़े ऐसे formaldehyde के रूप में एक कठिन लगानेवाला, के अधीन हैं जब की अस्वाभाविक लहराती उपस्थिति के रूप में देखा, कृमि की आकारिकी (विकृत हो सकता है बरकरार हैं, जो इंगित करता है आंकड़े 3 ए डी में मांसपेशियों). एक अन्य आम समस्या असमान निर्धारण या विशेष ऊतकों की पैठ है. इस का एक उदाहरण मांसपेशी डीएनए धुंधला सहित अन्य धुंधला हो जाना, की उपस्थिति, (शरीर के कम से कम हिस्सा मौजूद था कि इंगित करता है कि इस तथ्य के बावजूद, केवल कीड़ा के एक हिस्से में दाग है जहां आंकड़े 3E-एच, में दिखाया गया है यानी,) फ्रीज खुर के दौरान हटा नहीं. आंशिक धुंधला के परिणामस्वरूप पैटर्न आसानी से अभ्यास के साथ पहचाना जा सकता है, तो यह है कि पूरे distributiधुंधला की पर किसी एक कीड़ा असमान धुंधला से पता चलता है, भले ही निर्धारित किया जा सकता है.
फ्रीज खुर किसी भी निर्धारण हालत उपयोग करने के साथ सामना करना पड़ा आम समस्याओं अंतिम आंकड़ा (चित्रा 4) में सचित्र हैं. सबसे आम समस्या के कारण संपीड़न के दौरान दो स्लाइड्स के सापेक्ष गति को नमूना के घुमा रहा है. कीड़ा के शरीर सिर्फ ग्रसनी के पीछे मुड़ तथ्य यह है कि दाग ऊतकों की आकारिकी द्वारा देखा जा सकता है. इस छवि के कारण भी एंटीबॉडी स्लाइड कोटिंग पाली lysine से चिपके करने के लिए, पृष्ठभूमि धुंधला के साथ समस्या को दर्शाता है. इन छवियों के सभी एक कोशिका जीव विज्ञान प्रयोगशाला कोर्स में स्नातक से नीचे के पहले एंटीबॉडी धुंधला प्रयास के दौरान बनाया स्लाइड्स का उपयोग कर एकत्र किए गए थे कि, हालांकि, ध्यान दें. यहां तक कि अभ्यास के साथ, कई व्यक्तिगत कीड़े चित्रा 4 में देखा समस्याओं दिखाएगा. हालांकि, किसी भी एक स्लाइड पर, आंकड़े 2 और 3 में देखा उन लोगों की तरह कीड़े फाउंडेशन हो सकता हैडी और जांच की.
चित्रा 1. प्रक्रियाओं की रूपरेखा. पूरा फ्रीज खुर कार्यविधि को पूरा करने के लिए कदम का संकेत चार्ट प्रवाह. विभिन्न निर्धारण की स्थिति और कीड़े की संख्या के लिए विकल्प संकेत कर रहे हैं.
चित्रा 2. हल्के ढंग से तय हो, अच्छी तरह से सना हुआ कीड़े मेथनॉल एसीटोन के साथ तय की और कई एंटीबॉडी और रंगों के साथ लेबल दो वयस्क hermaphrodites के प्रमुखों:. ए) प्राथमिक एंटीबॉडी) (कोलीन acetyltransferase चैट करने के लिए और Cy3 संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी, बी) DAPI (नीला डीएनए) , सी) अयस्कग्रीन 488-विरोधी GFP (हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन) gon, डी) (दो कोलिनर्जिक मार्कर के साथ, Cy3 विरोधी चैट और Cy5 विरोधी VAChT (vesicular एसिटाइलकोलाइन ट्रांसपोर्टर) ओवरले लाल के रूप में दिखाया गया है) से पता चलता है. इस ट्रांसजेनिक तनाव (PS4657) ग्रसनी शिखर जंक्शनों पर पाया GFP और AJM-1 के बीच एक अनुवाद संलयन, व्यक्त करता है. छवियों confocal छवियों की श्रृंखला के लिए अधिक से अधिक अनुमानों हैं; पैमाने बार 50 माइक्रोन है.
चित्रा 3. शरीर की Cy3-phalloidin साथ दाग Formaldehyde जुड़े विकृतियों. Formaldehyde तय वयस्कों (filamentous actin बांधता है), DAPI (नीला डीएनए), और ओरेगन ग्रीन 488-विरोधी GFP. ई.) चौके छवियों सिर्फ) छोड़ दिया (योनी के पीछे में विकृति के कारण एक अस्वाभाविक लहराती आकारिकी दिखा वही निमेटोड, मेंनियतन से पेश किया. ए) लाल phalloidin थोड़ा अनियमित मांसपेशी आकृति विज्ञान से पता चलता है. बी) नाभिक (नीला) के बराबर कीड़ा भर में फैले हुए हैं. सी) ग्रीन के प्लाज्मा झिल्ली में एक CED-1 :: GFP संलयन प्रोटीन का वितरण से पता चलता है लिम-7 प्रमोटर (तनाव MD701). डी) द्वारा संचालित gonadal म्यान सेल,. एह) लेबल एक ही निमेटोड पर विभिन्न रंगों के साथ भिन्न हो सकते हैं इन तीन रंगों का आच्छादन दिखाता है. ई) Phalloidin (लाल) के केवल एक हिस्से लेबल असमान तीव्रता के साथ दाग हालांकि कीड़ा के एक तरफ की मांसपेशी. एफ) नाभिक (नीला)) (कीड़ा भर में मौजूद हैं. जी) OG488 विरोधी GFP की एक साइड पर छल्ली में कोलेजन -19 :: GFP लेबल कि मांसपेशियों का संकेत है, और अधिक केंद्रीय मांसपेशियों के ऊतकों की धुंधला अभाव है कि कीड़ा मौजूद है, लेकिन एक सतह पर धुंधला नहीं. एच) तीन रंगों का आच्छादन दिखाता है. छवियों अधिकतम कर रहे हैंconfocal छवियों की श्रृंखला के imal अनुमानों; स्केल सलाखों 50 माइक्रोन हैं.
चित्रा 4. एक साथ दाग संपीड़न जुड़े विकृतियों. Formaldehyde तय लार्वा) Cy3-phalloidin (filamentous actin बांधता है), बी) DAPI (नीला डीएनए), सी) ओरेगन ग्रीन 488-विरोधी GFP, डी) ओवरले. बस ग्रसनी के पीछे शरीर में मोड़ शरीर के बाकी के ऊपर हरे रंग मल त्यागने सेल और उदर तंत्रिका कॉर्ड क्रॉस के रूप में, स्पष्ट है. उच्च पृष्ठभूमि धुंधला भी Cy3-phallodin साथ स्पष्ट है. इस तनाव मल त्यागने सेल में मुख्य रूप से स्थित एक VHA -8 :: GFP संलयन प्रोटीन, व्यक्त करता है. पैमाने बार 50 माइक्रोन है, छवियों (उच्च पृष्ठभूमि धुंधला करने के लिए अग्रणी) स्लाइड की सतह के लिए बढ़ा दिया है कि confocal छवियों की श्रृंखला के लिए अधिक से अधिक अनुमानों हैं.
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Discussion
फ्रीज खुर प्रोटोकॉल सी. में एंटीबॉडी धुंधला के लिए कई तरीकों में से एक है एलिगेंस. यह कीड़े दाग एक अपेक्षाकृत सरल तरीका प्रदान करता है, लेकिन विशिष्ट अभिकर्मकों की आवश्यकता होती है और अधिकतम परिणाम के लिए अभ्यास करता है. (चित्र 1 में उल्लिखित) गंभीर कदम शामिल हैं: 1) स्लाइड तैयारी () देखें चरण 3 (चरण 2 और 3) तेजी से निर्धारण देखने (चरण 1 और नेमाटोड के 2) मैनुअल संपीड़न देखें. सबसे पहले, स्लाइड्स पर नेमाटोड के आसंजन को अधिकतम करने के लिए, यह बजाय व्यावसायिक तौर पर तैयार स्लाइड पर भरोसा कर के, उच्च आणविक भार (लंबी बहुलक) polylysine साथ स्लाइड तैयार करने के लिए सबसे अच्छा है. फ्रीज खुर स्लाइड पूरे नेमाटोड की छल्ली के लिए छड़ी करने के लिए डिजाइन कर रहे हैं, जबकि वाणिज्यिक स्लाइड्स, कोशिकाओं पालन करने के लिए अनुमति देने के लिए polylysine के साथ लेपित हैं. दूसरा, ठंड से पहले स्लाइड्स के बीच कीड़े की सही संपीड़न के लिए प्रक्रिया महत्वपूर्ण है. यह सही राशि का उपयोग कर एक साथ स्लाइड प्रेस करने के लिए स्थिर हाथ और अभ्यास की आवश्यकता हैव्यक्तिगत कीड़े उनके आकारिकी नष्ट करने के बिना दोनों स्लाइड्स संपर्क इतना है कि दबाव. बहुत अधिक या बहुत कम संपीड़न या तो नियतन के दौरान कीड़े की वृद्धि हुई हानि की ओर जाता है. इसके अलावा देखभाल एक दूसरे के सापेक्ष स्लाइड चलते बिना ठंड के लिए सूखी बर्फ ठंडा सतह पर स्लाइड स्थानांतरित करने की जरूरत है. ऐसे किसी भी प्रस्ताव कीड़े आंसू या मोड़ करने के लिए कारण होगा. तीसरा, किसी भी निर्धारण तकनीक के साथ के रूप में, जमे हुए कीड़े defrosting से पहले लगानेवाला में सीधे रखा जाना चाहिए. अन्यथा, प्रतिजन subcellular स्थानीयकरण के बारे में भ्रामक जानकारी प्रदान करने, फैलाना हो सकता है. इन महत्वपूर्ण कदम सब ठीक से किया जाता है, तो सबसे अच्छा परिणाम के लिए यह सबसे अच्छा आकारिकी साथ कीड़े खोजने के लिए कई दाग स्लाइड स्कैन करने के लिए भी आवश्यक है.
इस तकनीक का एक अपरिहार्य पहलू कीड़े एक आयाम में संकुचित हो जाएगा. संपीड़न Z-अक्ष में गोल शरीर के स्पष्ट व्यास केवल 1-4 हो सकता है, जहां वयस्कों में सबसे महत्त्वपूर्ण हैएक्स और वाई-कुल्हाड़ियों में देखा कि वें. इस संपीड़न छोटे लार्वा में कमी के लिए जाता है, और भ्रूण में नगण्य हो सकता है. कारण रहने वाले नेमाटोड स्लाइड तैयार करने के दौरान चाल, जिस तरह दाग कीड़े अक्सर उनके पक्ष में हैं. इस पार्श्व midline (आंकड़े 2-4 देखें) दाग कीड़ा के बीच नीचे तक झूठ बोल के साथ, अगर बर्तन पर कीड़े के उन्मुखीकरण mimics. इस प्रकार, सम्पीडन पार्श्व आयाम में आम तौर पर है. यह वास्तव में मानक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी आसान बनाता है (नमूना के अधिक एक साथ ध्यान में होगा), यह 3 डी पुनर्निर्माण सही नहीं होगा कि इसका मतलब है.
किसी भी एंटीबॉडी धुंधला के साथ के रूप में, यह बाध्यकारी की विशिष्टता की जांच जरूरी है. अधिकांश प्रजातियों में, इस तरह के आकर्षण अपने एंटीबॉडी घट या कोई प्राथमिक उपयोग कर के रूप में नियंत्रण द्वारा किया जाता है. सी. में एलिगेंस, विशिष्टता के लिए जाँच की अधिक विशिष्ट साधन अक्सर उपलब्ध हैं. ब्याज की जीन और प्रोटीन के लिए अशक्त म्यूटेंट प्रदानधुंधला विशिष्टता के लिए एक उत्कृष्ट नियंत्रण. धुंधला आमतौर पर निर्धारण निर्भर है के बाद से दोनों उपभेदों, तुलना से पहले समान शर्तों के तहत तय की जानी चाहिए. कोई अशक्त उत्परिवर्ती उपलब्ध है, तो यह सी में अपेक्षाकृत आसान है आरएनएआई (आरएनए निषेध 12) के साथ प्रोटीन का स्तर कम होती है और आरएनएआई इलाज कीड़े में कमी आई धुंधला के लिए देखने के लिए एलिगेंस.
पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी अक्सर प्रतिजन के साथ आत्मीयता शुद्ध, भले ही गैर विशिष्ट धुंधला दिखा. अक्सर, मेथनॉल और एसीटोन (उन्हें precipitating बजाय उन्हें crosslinking द्वारा प्रोटीन को ठीक करता है) का उपयोग करते हुए प्रकाश निर्धारण formaldehyde या glutaraldehyde (विभिन्न पार से जोड़ने की वजह से अधिक संस्करण epitopes उत्पन्न करता है) 1,11 से कम गैर विशिष्ट धुंधला देता है. हालांकि, सी में एलिगेंस गैर विशिष्ट धुंधला विशेष रूप से पेट में, किसी भी निर्धारण शर्त के तहत बहुत ही आम है. अपने प्रतिजन पेट में व्यक्त किया जाता है, तो यह गैर विशिष्ट धुंधला अपनी विशिष्ट staini मुखौटा हो सकता हैएनजी. अशक्त म्यूटेंट अपने प्रोटीन के लिए उपलब्ध हैं, तो इस विधि के साथ तय कीड़े अपने सीरम खलाना आत्मीयता के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रतिजनकता निर्धारण की परिस्थितियों पर निर्भर करता है, आप अपने एंटीबॉडी खलाना करने के लिए उपयोग कीड़े कि आप धुंधला कर रहे हैं जंगली प्रकार के कीड़े के रूप में उसी तरह से तैयार किया जाना चाहिए. गैर विशिष्ट धुंधला हो जाना, उत्परिवर्ती और जंगली प्रकार के कीड़े की कमी का एक दौर के बाद एक शानदार नियंत्रण के लिए समाप्त हो सीरम के साथ समानांतर में दाग जा सकता है. आवश्यक के रूप में म्यूटेंट के साथ कमी के अतिरिक्त दौर से किया जा सकता है.
इस तकनीक स्थितियों की एक किस्म के तहत विशिष्ट धुंधला के लिए नई एंटीबॉडी परीक्षण के लिए बहुत उपयोगी है. ये सी. के खिलाफ उत्पन्न एंटीबॉडी हो सकता है एलिगेंस अन्य प्रजातियों से संरक्षित प्रोटीन के खिलाफ उत्पन्न प्रोटीन या एंटीबॉडी. किसी भी अगर यह विधि हल्के से तय नेमाटोड के साथ सबसे अच्छा आकारिकी देता है, यह जो स्थितियां निर्धारित करने के लिए fixatives की एक श्रृंखला की कोशिश करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है,, विशिष्ट परिणाम देएस. Formaldehyde या glutaraldehyde, enzymatic या उपचार को कम करने का उपयोग कठिन निर्धारण के लिए अन्य तरीकों के विपरीत नमूना तैयार करने के लिए आवश्यक नहीं कर रहे हैं. इन उपचार प्रतिजनकता कम हो सकती है, अत: यह विशिष्ट एंटीबॉडी और उनके इष्टतम निर्धारण की स्थिति की पहचान करने की क्षमता बढ़ जाती है. कठिन निर्धारण की स्थिति सबसे अच्छा काम करते हैं, प्रयोगकर्ता तो (हमारे पिछले काम 4 में संक्षेप) बेहतर आकारिकी प्राप्त करने के लिए बरकरार कीड़े पर प्रदर्शन के तरीकों को बदल सकते हैं. प्रकाश निर्धारण प्रतिजनकता को बरकरार रखता है, तो इस तकनीक प्रकाश माइक्रोस्कोपी के लिए सभी आगे धुंधला के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
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Disclosures
लेखक वह कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि वाणी है.
Acknowledgments
अनुदान NSF CCLI # 0633618 और ओहियो विश्वविद्यालय द्वारा प्रदान किया गया. कुछ उपभेदों Caenorhabditis जेनेटिक्स केंद्र द्वारा प्रदान किया गया. ग्रेजुएट छात्र Reetobrata बसु वीडियो में दिखाई देता है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| poly-L-lysine slide (ESCO brand) | Fisher | 12-545-78 | Sigma brand slides also suitable |
| poly-L-lysine hydrobromide | Sigma | P1524 | IMPORTANT: Brand and high molecular weight of polylysine critical |
| single frosted edge slides | Fisher | 48312-002 | Other brands are suitable |
| sodium azide | Sigma | S2002-25G | TOXIC, wear gloves and mask while weighing out powder to make 10% stock. Wear gloves when pipeting stock solution |
| coplin staining jar | VWR | 47751-792 | Other brands are suitable |
| 5-slide mailer | Electron Microscopy Science | 71549-01 | One of many different brands of small slide holder, suitable for staining |
| Paraformaldehyde | VWR | MK262159 | IMPORTANT: Regular formalin solutions (37% formaldehyde) are NOT suitable. Either 1) Dissolve crysatlaline paraformaldehyde in phosphate buffer and store in small aliquots frozen. Or 2) buy electron microscopy grade paraformaldehyde in aliquots. TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water. |
| Glutaraldehyde solution, 25% in water | Sigma | G 5882 | IMPORTANT: purchase electron microscopy grade glutaraldehyde in ampules; TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water. |
| Triton X-100 | VWR | EM-9410 | Other brands are suitable |
| Bovine Serum Albumin | Fisher | ICN820451 | Other brands are suitable |
| Donkey Serum, lyophilized | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | Other brands are suitable |
| Cy3 Donkey anti-Mouse IgG multi-labeling | Jackson Immunoresearch | 715-165-150 | This company is recommended for high quality multi-label (affinity depleted) antibodies. Select appropriate dye and antigen (animal used to raise primary antibody). |
| n-propyl gallate | Fisher | ICN10274750 | Other brands are suitable |
| DAPI, 4’,6’-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma | D 9542 | TOXIC. Wear gloves and dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure |
| Whatman #1 15 cm diameter filters | Fisher | 09805G | |
| Coverslip #1 1/2 rectangle 24 x 60 mm | VWR | 48393-252 | #1 1/2 thickness is optically best |
| Microscope slide folder | VWR | 48429-092 | Other brands are suitable |
References
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