自動3D追跡システムを使用して、成魚のゼブラフィッシュの個体群と群れを記録

Summary

ゼブラフィッシュの個体やグループを追跡できる3D自動ビデオシステムの使用について説明しています。応用例として、NMDA受容体拮抗薬MK-801がゼブラフィッシュの群れに及ぼす影響について検討します。

Abstract

多くの水生動物と同様に、ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は3D空間を動きます。したがって、その動作を研究するために3D記録システムを使用することが好ましい。提示された自動ビデオ追跡システムは、ミラーシステムと、水から空気への光の遷移によってもたらされるかなりの誤差を補正するキャリブレーション手順を使用してこれを実現します。このシステムにより、ゼブラフィッシュの単体と成体ゼブラフィッシュのグループの両方を記録することができます。使用する前に、システムを校正する必要があります。このシステムは、Recording、Path Reconstruction、Data Processingの3つのモジュールで構成されています。キャリブレーションと3つのモジュールの使用に関するステップバイステップのプロトコルを示します。実験のセットアップに応じて、このシステムは、新恐怖症、白人嫌悪、社会的結束、運動障害、新規物体探索などのテストに使用できます。これは、薬物や突然変異が基本的な行動パターンに及ぼす影響を研究するための最初のステップツールとして特に有望です。このシステムは、ゼブラフィッシュの垂直分布と水平分布、運動学的パラメータのxyz成分(移動運動、速度、加速度、回転角度など)に関する情報を提供し、浅瀬を試験する際に社会的結束のパラメータを計算するために必要なデータを提供します。

Introduction

ゼブラフィッシュは、生物学的および薬理学的研究の重要なモデルとなっています^1-3。個々のゼブラフィッシュとゼブラフィッシュの群れの動きと空間分布パターンの追跡は非常に貴重です。古い研究では、記録された画像に基づいて手動による定量化が適用されています⁴。現在、2D自動ビデオトラッキングシステムが一般的に使用されています⁵。しかし、ゼブラフィッシュをはじめとする多くの水生動物や非水生動物が3次元空間を移動するため、3次元システムへの関心は高まっている⁶。記載されている3Dシステムは、2007⁷で最初に公開されました。技術的な詳細と他のシステムとの比較については、⁸ を参照してください。このシステムの基本的な利点は、ミラーリングシステムを使用して 2 つ (オプションで 3 つ) の同期ビューと独立したビューを取得し、2 ステップのキャリブレーションプロトコルを使用することです。最初のステップでは、ステレオシステムの3Dジオメトリ(カメラとミラーによって形成される)がキャリブレーションされます。2 番目のステップでは、光の屈折によってもたらされる非線形誤差が修正されます。水生動物を研究する場合、矯正せずに放置すると、光の屈折の影響が大きくなる可能性があります。これまでに公開された他のシステム(さらに新しい開発⁹)では、2段階のキャリブレーション手順が省略されています。オブジェクトの識別、マルチオブジェクトトラッキングによるオクルージョン、ジギングノイズなどに関する技術的な詳細については、こちらをご覧ください。読者は、元の出版物^8,9を参照します。このシステムは、不安様行動反応^10,11、浅瀬^8,11,12の研究、および予備研究ではゼブラフィッシュ¹³の拮抗行動の研究で検証されています。また、他の魚種(金魚⁸、ソードテイル、トラバーブ)やマウス⁹についてもテストされています。

以下では、キャリブレーションとシステムの使用に関するプロトコルについて説明し、NMDA受容体非競合アンタゴニストMK-801がゼブラフィッシュの浅瀬に及ぼす影響を検証した実験結果を代表的な例として提示し、システムで取得できるデータの種類を示します。

自然環境でも水族館でも、ゼブラフィッシュは通常浅瀬で泳ぎます¹⁴。群れの好みは、飼育、性別、食料の入手可能性など、いくつかの要因に依存しているようです^14,15。興味深いことに、群れ内の個々のゼブラフィッシュ間の距離は、警報フェロモン¹⁶や新規性¹¹などの潜在的な危険の信号が存在すると小さくなる。したがって、浅瀬のパラダイムは、抗不安薬¹⁷のテストにも使用されています。支配階層¹⁸と社会的学習¹⁹は、ゼブラフィッシュの行動の魅力的な側面です。ゼブラフィッシュは、その高度に発達した社会的行動特性のために、自閉症研究の関心事にもなっています^20,21。

MK-801は、ゼブラフィッシュ^5,22,23の社会的行動を変化させることが報告されており、これは哺乳類への影響を彷彿とさせます²⁴。しかし、MK−801は、他の行動(例えば、遊泳行動、抑制的回避および場所選好²⁵⁻²⁷)に対する他の多くの影響も有する。したがって、初期の実験では、基本的な観察からできるだけ多くの情報を得ることが重要です。これは、よりターゲットを絞った実験を設計するための基礎を提供します。

録音装置・ソフトウェアの調査

現在の構成では、ゼブラフィッシュを収容した観測容器(25cm×25cm×18cm、長さ×幅×高さ)が観察室(91cm×46cm×56cm、長さ×幅×高さ)に配置されています。チャンバーには、カメラ、容器から約>45°の角度で吊り下げられたミラー、LEDライトバーも含まれています。図 1 は、簡略化された図を示しています。カメラは正面図と上面図(鏡)の両方を記録し、ゼブラフィッシュのx座標、y座標、z座標を決定することでゼブラフィッシュの3D軌道を構築します。オリエンテーションの目的で、座標ベクトルは観測コンテナの左前隅(カメラに対する位置)に表示され、Path Reconstruction Module(以下を参照)によって生成された3Dビュー(図15など)に表示されるベクトルに対応します。サンプリングレートは、カメラとコンピューターによって異なります。私たちの実験では、約40フレーム/秒(fps)です。記録されたフレームの空間解像度は 640 x 480 ピクセルです (この構成は、空間解像度と時間解像度の最適なバランスとして選択されています)。Windows XP 以降が必要です。

最初の記録の前に、容器の壁と水面の位置を決定し、記録されたフレームのスケーリング係数を決定し、水から空気に通過する光の屈折によって生成される大きな誤差を調整するために、システムを較正する必要があります。原則として、キャリブレーションは、初期設置時と、カメラやミラーなどのセットアップの一部を移動または交換した後にのみ実行する必要があります。それでも、キャリブレーションがまだ正しいかどうかを時々確認し、必要に応じて再キャリブレーションすることをお勧めします。

ソフトウェアは3つのモジュールで構成されています。録音モジュールはフレームを記録します(図2に2つのフレームの例を示します)。軌道モジュールは、すべてのゼブラフィッシュの経路を再構築します。データ処理モジュールは、さまざまな標準的な運動学的パラメータと空間パラメータを計算します。さらに分析するために、データをスプレッドシートまたは統計ソフトウェアにインポートできます。

Protocol

すべての実験は、国立衛生研究所の実験動物のケアと使用に関するガイドに従って行われました。

1. キャリブレーション

1. 空の観察容器をチャンバー内に配置し、容器の足が設けられた穴に挿入されて正しく位置合わせされるようにします。半透明の壁(反射を減らすことが構造の目的)がカメラの向こう側と右側を向くようにコンテナを向けます。
2. 録画モジュールを開き、[カメラコントロール]を選択し、[ゲイン]と[シャッター](選択を解除した後、右側のボックス)を調整して、画像が鮮明になるようにします。サイドミラーを観察容器の左側に約45°の角度で配置して、コンピューターモニター上の容器の側面が完全に見えるようにします。さらに、コンテナの前面壁が1本の線として見えるようにミラーを位置合わせする必要があります(図3の矢印で示されています)。
3. キャリブレーションパネルを(カメラカードの)パラレルポートに接続し、レコードモジュールの「LEDパネルのオン/オフ」ボタンを押してLEDをオンにします。
4. 図3のように、5つのLEDがコンピューターモニターの正面、上面、側面に見えるように、キャリブレーションパネルを空の観察コンテナに置きます(ケーブルがビューを遮ることがありますが、この場合は移動します)。また、LEDが水位のマークの下にあること(これらのマークはタンクの内側底から135mmのところに観測容器に刻印されています)、パネルの位置が安定していること(手順1.9で容器に水を入れたときに動かないように
)を確認してください。
5. 観察室内の照明を消し、カーテンを閉めます(キャリブレーションパネルのケーブルやサイドミラーに触れないように注意してください)。
6. 「データの場所」ボタンを押して、キャリブレーション用のフォルダを作成または選択します files.これらのファイルは、再キャリブレーションが必要になるまで、後続のすべての記録(または実験)に使用されます。したがって、理想的には、キャリブレーション データをキャリブレーション フォルダーの名前の一部にしてください。
7. コンピュータ画面の3つの赤いボックスを調整して、各ボックスが3つのビューのいずれかの5つのLEDを囲むようにします(図4、左パネル)。ここでも、「カメラ制御」の下の「ゲイン」と「シャッター」を使用して、図4の右パネルのように、他の光点(ノイズ、反射、またはコンテナの壁の水滴による)の画像なしで、LEDの鮮明な画像を取得します。
8. LEDをオフにして、「水なしでキャリブレーションを収集」ボタンを押します。コンピューターの画面には、0 から 4 までの番号が付けられた 5 つのタグ ('x') が表示されます。パネルの電源を入れます。タグの位置は LED と一致する必要があります。そうでない場合は、手順 1.7 を繰り返します (左側のパネルでのタグ割り当てが正しくない場合と、右側のパネルでのタグ割り当ての誤りについては、図 4 を参照してください)。
9. 観察室にマークまで水を入れます。LEDは水位より下にある必要があります(手順1.4で説明したように)。それらが水位より上にある場合は、コンテナを空にして手順1.4に戻ります。容器に水を入れるときは、LEDパネルが動かないように注意してください。ただし、これが発生した場合は、コンテナを空にして手順1.4に戻ってください。キャリブレーションは、記録されたLEDの位置の水なしと水ありのLEDの位置の違いを決定することに基づいているため、これは重要です。
10. 「Collect calibration w. water」ボタンを押します。ここでも、ステップ1.8と同様に、5つのタグが画面に表示され、ほとんどの場合、水なしでのキャリブレーション中に取得されたタグからわずかにオフセットされます。このステップでは、ゲインとシャッターを再調整する必要がある場合があります。タグがLEDの上に正しく配置されるまで繰り返します(図4の右パネルを参照)。
11. 観察室の照明を点灯し、ゲインとシャッター(「カメラコントロール」の下)を調整して、画像が明るすぎないようにします。
12. 図 5 は、マウスを右クリックして順番に選択する必要がある 6 つのポイントを示しています。ポイントが指定された線上にあることを確認してください:1.正面図の水位、2.上面図のコンテナの左上尾根、3.側面図の正面壁の輪郭を描く垂直線。線の長さは必須ではありません。位置 1 と 2、3 と 4、5 と 6 をクリックすると、直線が表示されます (実際には数字は画面に表示されません)。「コンテナ情報の収集」を押して、この情報を保存します。
13. サイドミラーとLEDパネルの両方を取り外し、マークまで正確に水を満たします。「録音開始」を選択します。新しいウィンドウで、期間を分単位で尋ねられます。現在の目的のためには、1分で十分です。OKを押します。
14. 記録後、Record Moduleを終了し、Trajectoryモジュールを開き、「Data Location」を含むキャリブレーションフォルダ(手順1.6で作成)を選択します(ファイルの読み込みには時間がかかる場合があります)。このフォルダには、キャリブレーションファイルと記録したばかりのデータ(ステップ1.13)のファイルが含まれています。
15. 「背景を取得」ボタンを押します。新しいウィンドウが開き、何も変更せずにOKを押してください。モニターに観測タンクの(逆さまの)画像が表示されるまで待ちます。次に、「Load Background」を押します。背景画像が修正されます。新しいウィンドウが開き、ボックスの調整を求められます。OKを押すだけです。
16. 3番目から7番目のボタンを順番に押します:「水なしで通信をロードする」、「仮想カメラを調整する」、「屈折した通信をロードする」、「コンテナジオメトリを収集する」、「動物のコンテナ情報を取得する」。この後者の手順には数分かかる場合があります。画面に 3 本の白い線 (手順 1.12 で描画した線) が表示されたら完了です。「コンテナ情報を保存」ボタンを押します。
17. 「ボリュームを収集」ボタンを押します。次に、図6に示すように、直方体である水域の8つの角を連続してマークします。すべてのポイントについて、最初に正面図でクリックし、次に上面図でポイントをクリックします。
18. ウィンドウの左隅にある「3D」を選択します。新しいウィンドウが開き、底が白いボックスのアウトラインが表示されます (図 15 と同様ですが、軌道はありません)。マウスを右クリックして、ボックスビューの回転と平行移動を選択します。画像が表示されない場合、または画像が直方体の画像でない場合(つまり、手順1.17で角が間違った順序で右クリックされた場合)、次の手順を行います:軌道モジュールを閉じずに、Windowsを使用してキャリブレーションフォルダ(手順1.6で作成)に移動し、サブフォルダ「Animal container data」を選択し、TankVerticesという名前のファイルを削除して、手順1.17を繰り返します。
19. おめでとうございます、キャリブレーションが完了しました。理想的には、ダミーの魚でテストランを実行して、すべてがうまく機能するかどうかを確認する必要があります。良いニュースは、ミラーまたはカメラの位置が(わずかでも)変更された場合、または追跡に問題がある場合にのみ、再キャリブレーションを実行する必要があるということです(セクション3を参照)。

2. 録音

1. マークまで水で満たされた観察容器を観察室に入れ、容器の足が設けられた穴に挿入されるようにして、正しく位置合わせします。カメラから見て、半透明の壁(この例では白い壁 - ディスカッションを参照)が向こう側と右側を向くようにコンテナを向けます。
2. コンパートメントのライトをオンにし、(実験用またはダミーの)魚をコンテナに入れてカーテンを閉めます。注:システムは複数の魚を記録できます(代表的な結果のセクションを参照)。ただし、最初に単一の魚を記録することにより、システムの経験を積むことをお勧めします。
3. レコードモジュールを開きます。画面には、コンテナの正面図と上面図(鏡面)の画像が表示されます。画像は理想的ではない可能性があり(例:露出オーバー、例:図7)、魚と背景のコントラストを良好にするために調整(次の3ステップ)が必要になる場合があります(例:図8)。
4. 「カメラコントロール」を選択し、開いた「一般設定」ウィンドウで、「シャッター」と「ゲイン」を調整します(右側の対応するボックスの選択を解除した後、図9を参照)画像が露出オーバーにならず、魚と背景のコントラストが良好になるようにします。
5. 「カメラコントロール」ウィンドウの左側で「ホワイトバランス/カラー」を選択し、新しいウィンドウで「自動」ボックスの選択を解除し、赤と青の値を調整します(図10を参照)正面図と上面図の両方で最適なカラーコントラストを実現します。
6. 最適なカメラ設定を得るには、色の調整(「ホワイトバランス/カラー」の下)とゲインとシャッターの調整(「一般設定」の下)を数回切り替える必要がある場合があります。調整をしなくても満足する場合でも、「シャッター」、「ゲイン」、「オート」ボックスの選択を解除することが重要です(手順2.4と2.5で説明しました)そうしないと、記録の過程で背景が変動し、軌道を抽出できなくなります。その他の設定は変更しないでください。完了したら、「カメラコントロール」ウィンドウを閉じます。
7. レコードモジュールのメインメニューから「データの場所」を選択して、以前に作成したフォルダを作成するか、開きます。すべての記録(魚や浅瀬など)には独自のフォルダがあり、理想的には実験フォルダのサブフォルダである必要があることに注意してください。
8. 「録音開始」を押します。ウィンドウが開き、録音の継続時間を分単位で入力するように求められます(整数のみ入力してください)。「OK」を押すと、実際の録音セッションが開始されます。
9. 録音が完了したら、プログラムを終了します。次の魚を記録する前に、コンピューターを再起動することをお勧めします。Windows の [再起動] オプションを使用して、カメラの設定を保持します (手順 2.4 と 2.5 から)。録画の合間にコンピュータを再起動する必要があるのは、カメラカードにいくつかの問題があるためです。
10. パスの再構築のために軌道モジュールに移動する前に、キャリブレーションフォルダ(このプロトコルのセクション1で作成)から「Animal container data」および「Correspondence data」サブフォルダをコピーして、記録中に作成されたすべてのフォルダに貼り付けます。これらの後者のフォルダには、他の2つのサブフォルダ、つまり「生データ」と「タイムスタンプ」が存在します。前者には、JPEG形式で記録されたすべてのフレームが含まれます。後者には、フレームの総数とフレーム間の間隔 (ミリ秒単位) に関する情報が含まれています。

3. パスの再構築

1. Trajectoryモジュールを開き、[Data location]を押してレコードモジュールで作成されたフォルダを選択し、[System Setup]ボタンを押して[Parameters]を開きます(図11を参照)。
2. 上面と下面のビューの色のしきい値を選択します。適切な開始値は 1,000 です。この値が低い場合、ソフトウェアはノイズを記録する可能性が高くなります。ただし、値が高すぎると、魚が検出範囲を下回っている可能性があります。後で(ステップ3.11および3.12)、色のしきい値を再調整する必要が生じる場合があります。また、上部と下部の色のしきい値は同じである必要はないことに注意してください。
3. [Top and Bottom View Size Thresholds] を選択します。中型のゼブラフィッシュは10、非常に大きいゼブラフィッシュは20、非常に小さいゼブラフィッシュは5から始めるのが良いでしょう。サイズのしきい値が高いほど、ノイズを拾う可能性が低くなります。ただし、高すぎると、ソフトウェアが魚を検出できない可能性があります。ここでも、ステップ 3.11 と 3.12 で、サイズのしきい値を再調整する必要が生じる場合があります。また、サイズの上部と下部のしきい値は同じでなくてもよいことにも注意してください。
4. 「Upper Size Threshold」の場合は通常 3,000 の値が適切で、「Specific Length」の場合は 220 (プリセット済み) のままにします。「魚の数」とは、観測水槽の中の魚の数を指します。「Max num of Points」はフレームの総数を指します。この数字または少し小さい数字を覚えて(または書き留めて)、覚えておいてください(または書き留めてください（例えば、45,703は45,000として記憶されるかもしれません)。OKを押します。
「
5. Load correspondence w/no water」、「Calibrate virtual camera(s)」、「Load animal container info」ボタンを順番に押します。calibration-subfolders 'Animal container data' と 'Corresponding data' が現在の実験フォルダにコピーされなかった場合、エラーメッセージが生成されます (ステップ 2.10 を参照)。その場合は、ここでそれらのサブフォルダをコピーして貼り付け、ボタンをもう一度押します。
6. 「背景を取得」ボタンを押します。新しいウィンドウでは、'from' と 'to' にそれぞれデフォルト値の 0 と 100 を入力するように求められます。100 を最大フレーム数に変更します (ステップ 3.4 の例では、これは 45,000 と簡略化できます)。OKを押します。
7. (歪んだ)画像が表示されるまで待ちます。次に、[背景をロード]を押すと、正しい背景画像が確立されます。この背景画像では魚が見えないようにする必要があります。魚が見える場合は、他の記録セグメントからより良い背景を取得してみてください(たとえば、手順3.6で0〜1,000、1,000〜2,000などを試してください)。
8. 録画セッション中に魚がまったく動かなかった場合、背景を取得する唯一の方法は、魚を削除して魚なしで新しい短い録画を行うことですが、同じ「カメラコントロール」設定を使用します(これは重要です)。背景を取得し、「Background data」サブフォルダを現在の実験フォルダにコピーします。次に、「背景をロード」を押し、「背景を取得」を押さないでください。カーテンを開閉すると背景が多少変わることが多いため、ノイズを減らすためにステップ3.2と3.3でしきい値を調整する必要があるかもしれないことに注意してください。ステップ3.11は、ノイズをチェックする方法を示しています。
9. 背景を読み込んだ後、図 12 に示すように、マウスを使用して 3 つの赤いボックスを調整します。ボックスは、ソフトウェアが魚を探しているエリアを示しています。左側のボックスを閉じます(つまり、線または点に縮小します)。側面図はキャリブレーションにのみ使用されます(手順1.7で説明したように)。
10. 「軌道の生成を開始」ボタンを押します。開始フレーム番号を求めるウィンドウが開きます。デフォルトの「0」を使用します。「OK」を押すと、「Tag assignments」ウィンドウが開きます(図13を参照)。タグ(「X0」)が画面に表示されるまで「ステップフォワード」を押します。タグが魚の画像に配置されていない場合は、正しく配置されるまで「いいえ」を押してください。次に、「Go」を押します。正しく割り当てられていない(またはまったく)場合は、とにかく「実行」を押して問題を探します(次の手順)。
11. パスの再構築が開始されます。理想的には、タグは常に(または少なくともほとんどの場合)魚の画像に配置する必要があります。間違って配置されることが多い場合は、「情報」ウィンドウ(ビデオ画面の上の2番目の選択肢)を開きます。図14Aは、魚の輪郭のみが見える理想的なケースを示しています。図 14B は、ノイズが大きすぎてタグが正しく割り当てられない場合を示しています。図14Aのように、ノイズのない魚の鮮明な画像が表示されるにもかかわらず、タグが正しく割り当てられることがまったくないか、めったにない場合は、最も可能性の高い理由は、キャリブレーションがオフになっていることです。パスの再構築を再調整してやり直します。キャリブレーション中にミラーとカメラが移動されない場合は、新しいキャリブレーションデータを以前に実行した録画に使用できます。
12. ノイズが大きすぎる場合(図14Bなど)は、メインメニューの[停止]を押して、新しい色とサイズのしきい値を選択します(手順3.2および3.3)。また、赤いボックス(ステップ3.9)を少し減らすことができるかどうかを確認します(たとえば、上部の水の動きによって発生するノイズを排除するため)。プログラムが「スタック」していることがあることに注意してください (タグをまったく割り当てることができなかった場合): この場合は、プログラムを再起動してください。
13. 3D画面(画面上の3番目の選択肢)で軌道を確認します。図 15.は、軌道の例を表します。マウスを右クリックして、3Dコンフィギュレーションの回転と平行移動のどちらかを選択します。
14. 軌道が完了したら、「保存」(軌道を削除する「停止」ではありません)、「軌道クリーンアップ」、および「軌道の平滑化」ボタンを順番に押します。新しいウィンドウが開き、平滑化のフィルターパラメータが表示されます(図 16)。システムの経験を積む前に、デフォルト値を変更しないでください。「OK」を押します。
15. ここまでで、録画(ステップ2.4-2.6を参照)の前に、適切なカメラ設定(魚と背景のコントラストが良い)を選択することがなぜそれほど重要だったのかは明らかです。データ処理に進みます。

4. データ処理

1. まず、魚の記録に使用されたフォルダーを見てみましょう(図17)。これには、キャリブレーションフォルダ(ステップ2.10)からコピーされた「Animal container data」サブフォルダと「Correspondence data」サブフォルダ、魚の記録中に作成された「Time stamps」サブフォルダと「Raw data」サブフォルダ、パスの再構築中に作成された「Background data」サブフォルダと「Trajectories」サブフォルダが含まれています。
2. 図 17 は、'Trajectories' サブフォルダに 3 つのファイルが含まれていることも示しています。point.smoothed-file は、さらなるデータ処理に使用されるファイルです。複数の魚の記録(例:浅瀬実験)の場合、すべての魚に対して個別のpoint.smoothed-fileが生成されます。
3. 図 18 は、point.smoothed-file の例の上部を示しています。最初の行はサンプルまたはフレームの総数、2行目は記録時間(分単位)、3行目はカメラに対する水域の中心の座標(シーケンス:x、z、y)を示します。これに続いて、フレームごとに 1 行が続き、魚の x、y、z 座標 (mm) とそのサンプルの持続時間 (秒単位) を示します。
4. point.smoothed-filesで提供されるデータを処理するには、データ処理モジュールを使用するか、ExcelやMATLABなどの他のソフトウェアを使用して、データ処理モジュールに(まだ)組み込まれていない計算を行う方法があります。
5. Data Processing Moduleを開き、ツールバーの「Project」を選択し、プルダウンメニューから「New」を選択し、実験の名前を入力します。ツールバーの「プロジェクトの編集」を選択し、プルダウンメニューから「プロジェクトに追加」を選択し、続いて「新しいグループ」を選択して、グループの名前(例:「コントロール」)を入力します。現時点では、プロジェクト名とグループ名は実際には使用されていませんが、名前を埋める必要があることに注意してください。作成されたフォルダは、出力ファイルを保存するために使用できます(手順4.10を参照)。
6. 右側のウィンドウでグループ(「コントロール」など)を選択します(図19を参照)。ツールバーが変わります。「グループを編集」を選択し、プルダウンメニューから「グループに追加」を選択し、「新しい測定値」を選択します。これにより、ブラウザが開きます。記録中に作成したフォルダ(手順2.7)を開き、サブフォルダ「trajectories」を選択してから、point.smoothed-fileを選択します。図 19 に示す例では、グループ A では 6 つのファイルが読み込まれ、グループ B では 4 つのファイルが読み込まれました。(図の例では、スムージングされたファイルの拡張子が 0 と 1 であることに注意してください。これは、その実験で 2 匹の金魚が同時にテストされたためです)。
7. 分析には、右側のウィンドウでポイントスムージングファイルを選択し、[Data Processing]を選択し、プルダウンメニューから[Single Endpoints]を選択し、例として[Duration freezing]を選択します(図20)。ウィンドウが開き、速度のしきい値と期間のしきい値でフリーズを指定できます。この例では、魚は観測時間の25.86%を凍結に費やしています。
8. プログラムに慣れるために、移動距離、深度分布(深度レベルの数を決定可能)、バースト頻度などの他の例を試してみてください。
9. 例えば、加速度のz成分のスペクトル解析など、より高度な計算があります。この場合は「Time-series features」を選択し、次に「TD freq domain analysis」、「Spectral analysis」、「Z accele spectrum」を選択します。示されたパラメータに対してフーリエ解析が実行されます(説明⁷の場合)。メニューに表示されるすべてのオプションがまだ完全に実装されているわけではありません。たとえば、「Path tortuosity」は実験的に追加されただけです。
10. 「デフォルトのしきい値を使用したバッチ処理」オプションを選択すると、約 200 のエンドポイントが計算されます。このコンテキストでは、「デフォルト」は区切り文字が設定されていることを意味します。たとえば、現在、深度分布は 3 つの深度レベルに対して計算され、角度分布は 4 つのセクション (つまり、象限) に対して計算されます。パラメータを生成すると、新しいウィンドウが開き、作成するファイルの場所と名前を尋ねられます。これらはCSV形式で保存され、Excelなどの他のソフトウェアにインポートしてさらに処理することができます。
11. 記録モジュールや軌道モジュールとは対照的に、データ処理モジュールは、研究者の要件にさらに適応する進化するモジュールです。

Results

生後6ヶ月のメスのゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、不特定の('short-fin')野生型系統で、Aquatica Tropicals, Inc.から購入されました。ゼブラフィッシュは合計120匹使用されました。彼らは、実験を開始する前に、38L水槽で約8週間実験室の条件に順応しました。水温は室温(~23°C)と等しくなりました。照明療法:14時間点灯(6:00-20:00)、10時間消灯。ゼブラフィッシュには1日3回給餌されました:8:00テトラトロピカルフレーク。12:00生きたブラインシュリンプの幼虫。15:00テトラトロピカルフレーク。実験当日は、ゼブラフィッシュにフレークを与えたのは8:00だけでした。2回目の記録の直後に、ゼブラフィッシュは300 mg/Lのトリカインメタン硫酸塩(MS-222)で安楽死させました。

対照群では14個の四つ子(すなわち、4匹のゼブラフィッシュのグループ)が使用されました(n = 14)、MK-801グループでは16個の四つ子が使用されました(n = 16)。1Lコンテナで10μM MK-801(9:30開始)に1時間ばく露した後、四つ子を観測コンテナに移しました。録音はすぐに開始され(10:30)、20分間続きました。その後、ゼブラフィッシュを容器に3.5時間放置しました。この期間中、エアポンプに接続されたチューブを介して曝気が行われました。14:00に2回目の20分間の録音が行われました。2つの録音の目的は、薬物の慣れおよび/または減少効果の影響を研究することでした(ラットにおけるMK-801の半減期は約2^時間28です)。(1)社会的結束の尺度としての平均社会的距離(個人間距離^11,29とも呼ばれる)、(2)10の深さレベルにわたる垂直分布、(3)4つの放射状ゾーン(図24A、ゾーンの位置の挿入図を参照)および象限上の水平分布(図24B、象限の位置の挿入図を参照)、および(4)3つの成分(x、y、z) 移動距離のデータは浅瀬ごとに平均化されました。Shapiro-Wilkins検定ですべての変数が正規分布しているわけではないことが示された後、Mann-Whitney U検定をすべての変数に適用して、制御平均とMK-801グループを比較しました。これらの比較は、午前と午後のセッションで別々に行われました。α = 0.05/4 = 0.0125 としました。これは、4 つの (グループの) 変数が使用されたためです (上記参照)。

図2Aは制御ゼブラフィッシュの典型的な例示フレームを示し、図2BはMK-801で処理されたゼブラフィッシュの典型的な例フレームを示しており、どちらも午前中のセッション中に記録されています。対照ゼブラフィッシュは底部に近く、正面の壁(つまり、カメラに最も近い側)に近く、互いに密接に留まっていた(つまり、社会的結束が高かった)ことに注意してください。対照的に、MK-801で処理されたゼブラフィッシュは上部に近く、水平面では好みを示さず、互いにかなりの距離を泳いでいました(つまり、社会的結束が低かった)。図 21 に代表的な軌跡を示します。対照ゼブラフィッシュは、観測容器の前方に留まる傾向が明らかでした。さらに、彼らはほとんどの時間、底の近くにとどまっていました。一方、MK801で処理したゼブラフィッシュは、水平面上のどこにでも泳ぎました。しかし、彼らは10時30分の水深上部を明らかに好んでいました。14:00には、それらの垂直分布はより均質になりました。

データの定量分析により、私たちの説明が確認されました。図22Aは、平均社会的距離(すなわち、四つ子の4匹のゼブラフィッシュ間の平均個体間距離)が、午前中(10時30分)にMK-801ゼブラフィッシュの対照ゼブラフィッシュの3倍以上の大きさであり、U = 0、p<0.00001であったことを示しています。3.5時間の慣性化後(14:00)、対照ゼブラフィッシュの社会的距離は増加しましたが、MK-801ゼブラフィッシュではほぼ変化がありませんでした。しかし、それは両方のグループで有意に異なるままでした(U = 19、p<0.0005)図22Bは、10:30と14:00の両方の2つの実験グループの社会的距離のタイムラインを示しています。

垂直方向の分布も、両方のグループで非常に異なっていました。図23は、午前中(10:30)と午後(14:00)の両方で、ゼブラフィッシュがほとんどの時間を最も低い2〜3つの深さレベル(つまり、観測容器の底に最も近いレベル)で過ごしたことを示しています。一方、MK-801ゼブラフィッシュは、10時30分にほとんどの時間を水面近くで泳いでいました(図23A)。3.5時間の慣れの後、14:00には、それらはすべての深度レベルにほぼ均等に分布していました。

水平方向の分布も、両方の実験グループで非常に異なっていました。図24Aでは、MK-801ゼブラフィッシュは、対照ゼブラフィッシュよりも外側のゾーンで過ごす時間が短く、中央と中央のゾーンで過ごす時間が長かったことがわかります。象限に関するグループ間の違いはさらに明白でした(図24B)。コントロールゼブラフィッシュは、2つの前部象限(1と4)に非常に強い好みを持っていました。カメラに最も近いコンテナの側面。一方、MK-801ゼブラフィッシュは、4つの象限にほぼ均等に分布していました。

キネマティックパラメータに関しては、ここでの議論は移動距離に限定します(図25)。MK-801ゼブラフィッシュは、ゼブラフィッシュをコントロールする以上の動きをしました。興味深いことに、この差は移動距離のy成分で特に顕著でした。これがカメラの方向です (図 1 を参照)。実際、ゼブラフィッシュは、第1象限と第4象限の正面壁にほとんどの時間留まっていました(図24Aと図24Bに見られるように)。一方、MK-801ゼブラフィッシュは、コンテナの前半分と後ろ半分の間を行ったり来たりしていました。

ここでは、実験によって提供されたデータを分析するための可能な方法のサンプルのみを提示しました。この時点で、結果に特定の生物学的解釈を付けることは控えます。しかし、MK−801は、ラット³¹において社会的離脱³⁰を誘発し、社会的調査行動を減少させることがわかっており、統合失調症³⁰の陰性サンプトームのモデルとして研究されていることは言及する価値がある。また、哺乳動物において多動^性31、旋回行動³²、感覚障害³³、およびプレパルス阻害³⁴の低下を引き起こした。これらの障害について特にテストしたわけではありませんが、私たちの調査結果はそれらと一致しているようです。ゼブラフィッシュにおけるMK-801の記載された効果が哺乳類に記載されているものと同等であるかどうかを判断するには、より具体的な実験設定が必要です。不安、呼吸の問題、空間的見当識障害、注意欠陥、常同性などが、ゼブラフィッシュのMK-801によって誘発される行動の変化に重要な役割を果たしたかどうかを判断するには、さらなる分析と実験も必要になります。

図 1.装置の概略図。カメラは、観測水槽の正面図と上面図の両方を示すフレーム(静止画)をキャプチャします。フレームは、さらなる処理のためにコンピューターに保存されます。ゼブラフィッシュの動きと位置の 3D 特性を説明するために重要な xyz 次元の位置に注意してください。図の2つの影付きの壁(およびタンクの底)は、実験(代表的な結果を参照)では白く塗られていましたが、他の2つの壁は透明でした。拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

図 2.フレームの例。正面図または上面図だけでは、情報が失われるという特徴があることに注意してください。これは特にパネルBではっきりと見え、正面図を見ると左側の3匹のゼブラフィッシュが互いに近接しているように見えますが、上面図はそうではないことを示しています。一方、上面図では、下面からの距離は示されません。A) ゼブラフィッシュを防除する。B) ゼブラフィッシュを10 μM MK-801で処理。なお、背景の色(青)は記録ソフトで生成したもので、コントラストが良好なものとなるように選択されています。奥と右側、そして下部の壁の本当の色は白でした。拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

図 3.サイドミラーの位置合わせ。左の白い矢印は、サイドミラーの正面の壁(カメラに最も近い壁)を示しています。2本の線が見える場合は、1本の線だけが見えるまでサイドミラーの位置を修正します(手順1.2)。キャリブレーションパネルの5つのLEDは、3つのビューすべてではっきりと見えます。チャンバー内のライトがオンになっているため、LEDパネルには他の多くの反射が見られることに注意してください(ステップ1.4)。拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

図 4.LED のタグ付け。左側のパネルは、キャリブレーション手順によって識別された5つのタグ(0〜4の番号)が実際のLEDと一致していないことを示しています。LED以外にも、他の光点(実際には反射)が見られます。右側のパネルでは、ゲインとシャッターが縮小され、LEDのみが見えるようになりました。これで、5 つのタグが正しく割り当てられました (手順 1.7 から 1.10 で説明)。拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

図 5.コンテナ情報を収集します。(マウスの右クリックで)選択する6つのポイントの順序が表示されます。線は自動的に描画されます。ここに示されている番号は画面に表示されないことに注意してください。完了したら、[コンテナ情報の収集]を押します（ステップ1.12で説明しました）ここをクリックすると拡大画像が表示されます。

図 6.ボリュームを収集します。水域の角をマークする指定された位置でマウスを右クリックします:最初に正面図で角をマークし、次に上面図で角をマークします。次に、次のコーナー(1〜8)に移動します。8つの点は、タンクの輪郭ではなく、水域の輪郭を示していることに注意してください。また、マウスを右クリックすると「x0」のみが表示され、次の場所をクリックすると再び消えることに注意してください(したがって、1〜8の数字は実際には画面に表示されません)。手順については、ステップ 1.17 で説明します。拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

図 7.未補正のコントラスト。画像は露出オーバーで、魚と背景のコントラスト (特に正面図) は低くなっています。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

図 8.コントラストを修正しました。コントラストは、図 7 と比較して改善されています。画面上の色は偽色であることに注意してください。拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

図 9.[一般設定]。メインメニューの「カメラコントロール」を選択すると、「一般設定」ウィンドウが開きます。「シャッター」ボックスと「ゲイン」ボックスの選択を解除し、スライダーを使用して魚と背景の最適なコントラストを見つけます。拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

図 10.色の設定。「ホワイトバランス/カラー」ウィンドウで、「自動」ボックスの選択を解除し、「赤」と「青」のスライダーを使用して、魚と背景のコントラストが良好な最適な組み合わせを見つけます。パラメーター。Trajectoryモジュールを開いた後、「Data location」で実験ファイルを選択し、「System Setup」で「Parameters」ウィンドウを開きます。ここでは、適切な開始値がパラメーターに割り当てられます。拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

図 11. パラメーター。Trajectoryモジュールを開いた後、「Data location」で実験ファイルを選択し、「System Setup」で「Parameters」ウィンドウを開きます。ここでは、適切な開始値がパラメーターに割り当てられます。 で囲まれています。拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

図 12.ボックスの配置。上部と正面図の赤いボックスが、魚が見つかる可能性のある領域をどのように定義しているかに注目してください。左側のボックスは、この領域を検索から除外するために行に縮小されます。拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

図 13.タグの割り当て。「Start generating trajectories」ボタンを押して開始フレーム(通常はフレーム#0)を選択すると、「Tag assignments」ウィンドウが開きます。タグ(「X0」)が画面に表示されるまで「ステップフォワード」を押します。タグが魚の画像に配置されていない場合は、正しく配置されるまで「いいえ」を押してください。次に、「Go」を押します。拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

図 14.情報画面。パネル(A)は、正しいタグ割り当てを示しています。タグ ('X0') は、両方のビューで魚の画像に配置されます。通常、タグには線が通っています。パネル(B)は、過度のノイズとタグの割り当てがないことを示しています。フレームは、色とサイズのしきい値(ステップ2.2)をそれぞれ1,000-50と10-5に変更することにより、同じ記録から取得しました。拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

図 15.再構築されたパスの 3 次元表現。矢印の原点は、向きの目的でタンクの左前隅にあります(図1も参照)。したがって、この例では、魚は (カメラに対して) 左側の壁の近くに留まります。拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

図 16.軌道のスムージング。このウィンドウは、「軌道スムージング」ボタンを押すと開きます。当面は、「OK」を押してデフォルト値を受け入れます。拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

図 17.サブフォルダ。録音中に生成されたフォルダは上図の通りです。パスの再構築後、指定された 6 つのサブフォルダが含まれます。拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

図 18.スムージングされたファイル。サンプルのpoint.smoothed-fileの上部が表示され、フレーム数、記録時間(分単位)、カメラに対する水域の中心の座標、および各フレームの座標と期間を示します。拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

図 19.データ処理。分析するファイルの選択(右側のウィンドウ)。拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

図 20.分析の例。目的のエンドポイントは、メニューから選択することで計算できます。この例では、「Duration Freezezing」が選択されています。このプログラムでは、フリーズを定義する速度と期間のしきい値を指定するように求められます。結果は、記録の合計時間に対する割合で表されます。拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

図 21.代表的な軌跡。10:30から始まる午前のセッション(上段)と14:00から始まる午後のセッション(下段)について、10μM MK-801で処理したゼブラフィッシュの2つの代表的な軌跡とゼブラフィッシュの代表的な軌跡を示しています。四つ子ごとの個々のゼブラフィッシュの軌跡は、異なる色で示されます。ただし、タグの交換が行われた可能性があることに注意してください。個々の線をたどることが重要な場合は、手動修正が必要です。描かれているコンテナの左前側(挿入矢印の原点)は、カメラに最も近い側です(タンクの位置については図1を参照)。拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

図 22.魚の間の平均的な社会的距離。A) 対照ゼブラフィッシュと10μM MK-801で処理したゼブラフィッシュの平均ソーシャルディスタンスを午前と午後のセッションで提示します。MeanとS.E.M.が紹介されています。、p<0.001。B) 平均個人間のタイムラインは、両方のグループについて提示されます。拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

図 23.深さの分布。A) 午前中のセッションにおけるゼブラフィッシュの10の等しい深さのレベル(レベル1が底に最も近いレベル)に分布している。B) 午後のセッションのゼブラフィッシュの配布。MeanとS.E.M.が紹介されています。*、p<0.0125;**、p<0.005;、p<0.001。拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

図 24.水平方向の分布。(A)実験グループの4つの放射状ゾーンにわたる時間分布が示されています。挿入図は、中心から周辺までのゾーンの位置 (中心、中央、外側、および結合コーナー) を示しています。(B)実験グループの4つの象限にわたる時間分布が示されています。挿入図は、象限の位置を示しています。二重線で示された壁は白い壁を表し、一本線で示された壁は透明な壁を表しています。カメラはインセットの左側にあります。象限 1 と 4 に最も近い (図 1 も参照)。MeanとS.E.M.が紹介されています。黒いアスタリスクは午前中のセッションのグループ間の比較を示し、灰色のアスタリスクは午後のセッションのグループ間の比較を示します: *, p<0.0125;**、p<0.005;、p<0.001。拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

図 25.移動距離。午前と午後のセッションにおけるゼブラフィッシュの移動距離のxyz成分が示されています。MeanとS.E.M.が紹介されています。黒いアスタリスクは午前中のセッションのグループ間の比較を示し、灰色のアスタリスクは午後のセッションのグループ間の比較を示します: *, p<0.0125;、p<0.001。拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

Discussion

ここに示す実験手順では、個々のゼブラフィッシュ、ゼブラフィッシュのペア(例えば、 交尾や攻撃性を研究するため)、およびゼブラフィッシュの群れ(代表的な例に示すように)を記録することができます。このシステムは、3D(垂直方向と水平方向)の分布、運動学的特性(速度、加速度、旋回角など)、社会的パラメータ(社会的結束など )に関する情報を同時に取得するのに特に適しています。以下では、実験を計画する際に考慮すべき重要な問題をいくつか挙げます。

実験手順に応じて、さまざまな行動システムを研究できます。たとえば、ネオフォビア(つまり、新しい環境への恐怖)を調査するには、ゼブラフィッシュを観察水槽に導入した直後に(水が落ち着いてノイズを減少させるまで数秒間待った後)、事前の慣れなしに記録を開始する必要があります^11,17,37。一方、一部の研究テーマでは、たとえばアラームフェロモンの効果を研究する場合など、ゼブラフィッシュが十分に慣れている必要がある場合があります¹⁶。ゼブラフィッシュのグループを研究する場合、実験者は、ソフトウェアがタグの切り替えを最小限に抑えますが、現時点では個々のゼブラフィッシュを追跡することは不可能であることに注意する必要があります。これは、社会的結束に重点が置かれている浅瀬研究にとっても重要ではありませんが、攻撃性や交尾を探求する際には重要です。タグの手動再割り当てはオプションですが、非常に時間がかかる場合があります。

観察容器と観察室の壁の色は、ゼブラフィッシュの行動に大きな影響を与える可能性があります。たとえば、白い壁は嫌悪反応を誘発することが説明されています^36、37。異なる色を試すときは、次の 2 つの点に留意してください: 1) 前面の壁 (つまり、カメラに最も近い壁) が透明なままであることと、蓋 (使用されている場合) も透明でなければならないことが重要です。2)これまで使用したことのない色を選択する場合は、まずゼブラフィッシュと背景のコントラストが記録に適しているかどうかを判断します。テスト実行を行います。録画用のカメラ設定(手順2.5および2.6で説明したようにゲイン、シャッター、赤、青)と軌道再構成の設定(手順3.3、3.5、3.11、3.12で説明した色とサイズのしきい値など)を変更すると、大きな違いが生まれます。繰り返しになりますが、システムの経験は、何が可能かを決定するのに大いに役立ちます。

実験の目的によっては、特性(スペクトル、強度など)の異なる光源が望ましい場合があります。LEDバーは簡単に交換できます。光が容器のあらゆる部分に届くようにしてください。

実験でゼブラフィッシュを観察容器に数時間留まらせる必要がある場合は、必ずエアレーションを行ってください。エアチューブはクリップを使用して右奥隅に取り付けることができます。クリップが録画の妨げにならない か、つまり、コンピューター画面で確認してください。ゼブラフィッシュは決して視界から隠されていないこと。 図2A と 図2B では、黒いクリップが上面図に見られます。理想的には、ノイズを防ぐために、レコーディングの前またはレコーディングの間にエアレーションを行う必要がありますが、レコーディング中は使用しないでください。また、強い通気のオン/オフを切り替えると、ゼブラフィッシュが驚く可能性があることに注意してください。

実験でゼブラフィッシュを容器の中に一晩保管する必要がある場合は、ゼブラフィッシュが飛び出すのを防ぐために、観察室を透明な蓋で覆うと便利です(これは非常に一般的なことです)。撮影前にカバーを外さない場合は(ゼブラフィッシュの邪魔をしないように)、次の2つの点を考慮してください:1)光源の鏡像が撮影を妨げないようにしてください(たとえば、 光源をずらしたり、光を最小限にしか反射しない蓋を選択したりします)。2)特にこの場合、通気も行う必要があるため、一晩使用すると蓋が曇る可能性があることに注意してください。これを減らす1つの方法は、小さな穴の開いた蓋を選ぶことです。

一部の実験では、薬物を投与する前にゼブラフィッシュのベースライン行動を決定することが不可欠かもしれません。この場合、薬物はチューブ(上記の曝気チューブと同様)を介してセッション間に追加できます。

ここではゼブラフィッシュ(ダニオレリオ)の記録に重点が置かれていましたが、もちろん他の魚種もこのシステムで記録できます。これは、(幼魚)金魚(Carassius auratus)、トラバーブ(Barbus tetrazona)、およびアオソードテール(Xiphophorus helleri)の行動を研究するために使用されています。

最後に、観測タンクの他の寸法は主に可能であることに注意する必要があります。ただし、はるかに大きな観測コンテナを使用する場合は、システムを再構成し、空間分解能と時間分解能の適切なバランスを見つける必要があります。さらに、容器の形状は直方体でなければなりません。ゼブラフィッシュまたは他の実験対象の数は理論的には無制限です。ただし、タグの入れ替わりは被験者の数とともに増加します。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AABT-3Dトラッキングハードウェア	xyZfish	AABT II	カメラ、ビデオカード、ミラーと照明付き観察コンパートメントが含まれています
AABT-3Dキャリブレーション機器	xyZfish	キャリブレーション	とサイドミラーが含まれています
AABT-3D観察コンテナ	xyZfish	キューブ
AABT-3Dトラッキングソフト	xyZfish	v.1.0
コンピュータ	オプション	N/A	Windows XP 以降
(+)-MK-801 マレイン酸水素	Σ	M107
エアポンプ	Fusion	500
エアラインチューブ3/16インチ	リー水族館およびペット用品	14508
ミディアムバインダークリップ	OfficeDepot	561339	観測コンテナに航空会社を取り付けるには