Summary
הדמיה תא חי של נגיף alphaherpes מאפשרת ניתוח של האירועים הדינמיים של תחבורה בבימויו והתפשטות בין תאית. כאן, אנו מציגים מתודולוגיות לנצל זני נגיפי רקומביננטי המבטאים חלבוני היתוך ניאון כדי להקל על הדמיה של מכלולים במהלך הזיהום נגיפיים של נוירונים העיקרי.
Abstract
התקדמות בטכניקות תא חי הקרינה מיקרוסקופיה, כמו גם הבנייה של זני נגיפי רקומביננטי המבטאים חלבוני היתוך ניאון אפשרה להדמיה בזמן אמת של תעבורה והתפשטות של זיהום בנגיף alphaherpes של נוירונים. השירות של חלבוני היתוך ניאון רומן קרום ויראלי, קלפה, וcapsids, בשילוב עם הדמיה תא חי שנוצר על מכלולי חלקיקים נגיפיים העוברים תחבורה בתוך האקסונים. כלים דומים כבר מועסקים בהצלחה לניתוחים של תאי תאים פזורים של חלקיקים נגיפיים לכמת את המספר והמגוון של virions מועבר במגע בין תאים. חשוב לציין, בטכניקות של הדמיה תא החי של תחבורה והתפשטות אנטרוגדית לייצר שפע של מידע ובכלל מהירויות חלקיקי תחבורה, הפצות של חלקיקים, וניתוחים זמניים של לוקליזציה חלבון. לצד טכניקות גנטיות נגיפיות הקלסיים, מתודולוגיות אלה סיפקו תובנות קריטיותלשאלות מכניסטית חשובות. במאמר זה נתאר בפירוט את שיטות ההדמיה שפותחו כדי לענות על שאלות בסיסיות של תחבורה וירוס alphaherpes והתפשטות.
Introduction
זיהום של מערכת העצבים ההיקפית (PNS) על ידי וירוסי alphaherpes כגון נגיף הרפס סימפלקס (HSV) -1, -2, ונגיף pseudorabies (PRV) כולל מספר שלבים מורכבים ופיקוח הדוק לאורך כל מחזור החיים של הנגיף. תחבורה בתוך הנוירונים של PNS היא קריטית באירועים של שניהם זיהום ויראלי ראשוני והתפשטות בין מארח שלאחר מכן. המנגנונים המולקולריים המווסתים שני מרכיבים של מחזור החיים של הנגיפים; התחבורה בבימויו של מכלולים נגיפיים הרחק מגופי תא בתוך אקסונים (הובלת אנטרוגרדית) והשידור הבא של virions לתאים רגישים (התפשטות אנטרוגרדית) הם חשובים להבנת הפתוגנזה ההרפס.
התחבורה והיציאה של חלקיקים נגיפיים בתאי עצב תלוי בהרכבה של 1,2 virion זיהומית בוגר. מבחני בעבר קבועים, כולל immunofluorescence (IF) ומיקרוסקופ אלקטרונים (EM), שמשו כדי ללמוד את מדינת ההרכבה החלקיקים וprotאינטראקציות ein קשורות לתחבורת virion והתפשטות 3-6. עם זאת באופי הדינמי של virions ההובלה וממצאים ניסיוניים שהוצג על ידי קיבוע כימי מבולבל פרשנות קבועה תמונות 7,8. לאחרונה, מספר החלבונים נגיפיים היתוך-ניאון כבר תאר לHSV וPRV שיש השפעות זניחות על תפקוד חלבון. חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) וחלבוני ניאון אדומים (mCherry או mRFP) fluorophores הם לזווג לעתים קרובות כדי לאפשר הדמיה של שתיים משלושת הרכיבים המבניים של virion בוגר: קופסית, קלפה, וגליקופרוטאין 9-11. לחיות הדמיה תא של התחבורה אנטרוגדית באמצעות וירוסים כפול שכותרתו מדמיין את מדינת ההרכבה של חלקיקים נגיפיים במהלך הובלה. fluorophore הדומה הביע זני נגיפים המשמשים לדמיין מספר והמגוון של הגנום נגיפי בעקבות התפשטות 12,13. את המאפיינים של חלבוני הניאון (הנסקרת ב 14,15) להשפיע באופן משמעותיהיכולת לדמיין מכלולים נגיפיים או סלולריים. את המאפיינים המהותיים של החלבון פלואורסצנטי, כולל אינטראקציות עצמיות ויציבות, יש לשקול בעת תכנון ובדיקת החלבון fusions חדשני לשימור טבע מהסוג פונקציונלי.
בשיתוף עם איחודי חלבון פלואורסצנטי, שתי היטב מאופיינים במערכות תרבות תאים במבחנה מועסקים הדמיה תא חי של הידבקות בנגיף הרפס: 16 מנותקים וממודר 17 (איור 1 א) גרעיני עכברוש (SCG) נוירונים צוואר הרחם מעולים. בשתי המערכות, עוברי של SCG הם גזורים, ניתקו לגופי תא בודדים, ומצופה במבחנת culturing 18. נוירונים SCG הם חלק ממערכת העצבים האוטונומית ויכולים להיות מתורבתים בקלות ומובחן על ידי גורם גדילה עצבי (NGF) לvivo לשעבר המדינה מקוטבת בוגר. נוירונים SCG ניתקים יוצרים רשת מורחבת של האקסונים המאפשרת Fאו ההדמיה של חלקיקים נגיפיים כפי שהם עוברים הובלת אנטרוגרדית 6. תרבויות SCG ממודרים לספק בידוד fluidic של גוף התא העצבי (תא S) וTermini האקסון דיסטלי (תא N) 19. מספר הפרוטוקולים המפורטים לבנייה ולשימוש בתאי עצב ממודר באמצעות שונים Campenot תאי 17 או 20 מקורי כבר פורסם בעבר. בידוד Fluidic מאפשר לזיהום סלקטיבית של גופי תאים עצביים ואיתור של virions צאצאים לאחר ההובלה לטרמיני האקסון מבודד. ציפוי תאי האפיתל במשך טרמיני לפני ההדבקה מספק תאי נמען להתפשטות זיהום נגיפי.
יש הרבה מרכיבים חיוניים חשובים לכל הניסויים ההדמיה התא חיים, אבל רלוונטי ביותר לפרוטוקולים שלנו הם: רכישה אוטומטית תמונה, תאורת ניאון, מהירות של הדמיה, ושליטה על הסביבה. עבור כל ניסויי ההדמיה, אנו משתמשים,, מיקרוסקופ הפוכה אוטומטית epifluorescence תאורה (איור 1). מיקרוסקופ בנוי סביב ניקון אקליפס טי הבסיס ומעסיק מספר מערכות מחשב שבשליטת ממונעת למהירות להגדיר מחדש את המיקרוסקופ במהלך רכישת תמונה אוטומטית. תאורה הקרינה, אנו משתמשים במנורת קשת ספקטרום רחב כספית שיכולה להיות מוחלש עם מסנני צפיפות ניטראליים לאורך נתיב ההארה. מסנני עירור להגביל את הספקטרום של תאורת ניאון וכאשר יחד עם מראות dichroic מרובות עוברות ומסנני פליטת הקרינה לדמיין תרכובות ניאון ספציפיות. את מסנני העירור ופליטה הם רכובים בגלגלים עצמאיים, מהר מיתוג סינון כדי לאפשר רכישה רציפה מהירה של ערוצי ניאון שונים. המהירות של רכישת תמונה עוד יותר משופרת עם מצלמת CCD EM-רגישה ומהירה, שימושית לזיהוי של אותות בעצימות נמוכים ותדמית קצרה לקרוא פעמים. שליטה בסביבת microscאופ מושגת עם למעלה שלב חממה מחומם ודוד עדשת מטרה לשמור על דגימות בטמפרטורות גבוהות תוך אווירה מועשרת 2 CO humidified והוא עבר לחממה. מיקרוסקופ נשמר בחדר חשוך עם טמפרטורת הסביבה נשמר קרוב ל 25 מעלות צלזיוס ואור בחוץ ממוזערים עם וילונות האפלה על כל החלונות. הפרוטוקולים הבאים לתאר את השימוש במערכת זו להובלת אנטרוגרדית ומבחנים להתפשט.
קיים מספר החלופות לשליטה למשתנים של הדמיה תא חי. השליטה על הגדרות מיקרוסקופיה יכולה להתבצע באופן ידני או באמצעות מערכות אוטומטיות תלויות בתוכנת קניינית. תאורת הקרינה ניתן להשיג עם ההלוגן, LED או מקורות לייזר. המהירות של הדמיה היא שונה על ידי המהירות של מיתוג מסנן ואת הזמן כדי להמחיש את האות עם מערכת זיהוי לזווג. בקרה סביבתית יכולה להיות מושגת באמצעות חומרה מיוחדת במיילשלב croscope, מתחם של חלק ממיקרוסקופ בתיבה מחוממת וhumidified או כל, או על ידי העלאת הטמפרטורה של החדר שבו מיקרוסקופיה תבוצע. כל אחת מחלופות אלה יש יתרונות וחסרונות הקשורים למחיר וביצועים.
בפרוטוקול שלאחר מכן, אנחנו פירוט השימוש בהדמית תא חי ללמוד תחבורה אנטרוגדית מהירה והתפשטות של וירוסי אנטרוגדית alphaherpes באמצעות השימוש בזני נגיפי רקומביננטי. הדמיה תא חי בזמן אמת visualizes קופסית, קלפה ו / או גליקופרוטאין שיתוף לוקליזציה על מבנים דינמיים העוברים תחבורה בתוך 11 אקסונים. ההדמיה timelapse הלילה של תרבויות העצביות הממודרות מדמיין יציאה virion axonal וזיהום של תאים רגישים 12. הפרוטוקולים שהוצגו כאן כבר מותאמים לשימוש עם מערכת ההדמיה המסוימת שלנו, אבל מוצגים במונחים רחבים ביחס לארבעה היסודות של הדמיה תא חי. בדיון שהיינויפרט עוד כמה אופטימיזציה כי הוא הכרחי לניסויים מוצלחים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
סעיף 1 - תנאי בקרה סביבתיים למיקרוסקופ פלואורסצנטי Live-תא
- 30 דקות לפני כל ניסוי הדמיה להתחבר ולהתחיל לחמם את המיקרוסקופ השלב העליון החממה.
- הפעל מיקרוסקופ, מקורות אור מועברים וepifluorescent, ופקדי חומרה אוטומטיים. פתח את תוכנת בקרת מיקרוסקופ, אלמנטי ש"ח, כדי להתחבר למיקרוסקופ ולהתחיל קירור המצלמה EM-CCD.
- צרף עדשות חמה יותר למטרה המתאימה (או 60x או טבילת שמן 100X). הערה: בחר עדשה אובייקטיבית המבוססת על סוג הניסוי. התערבות ההפרש לעומת זאת 100X (DIC) היא הטובה ביותר עבור מעקב של מכלולי virion הובלת אנטרוגרדית תוך מטרת שלב 60x מתאימה כדי להמחיש התפשטות אנטרוגדית. ההגדלה נמוכה, טבילה מטרות שאינן נפט אינן דורשות עדשה חמה יותר כמו שהם לא ליצור קשר ישיר עם המדגם.
- צרף שלב חממה עליונה על הבמה הממונעת של מייל croscope. להבטיח את התותב המתאים שיקיים המדגם נמצא במקום. צרף את קו אוויר humidified משליטת החממה ליציאת הקלט על הבמה העליונה החממה.
- הפעל חממה ועדשת פקדים חמים יותר ולהתאים את הגדרות לתנאי טמפרטורה מאומתים עבר ספציפיים למטרה והדוגמא שצלמה (ראה דיון).
- פתח את שסתום הבקרה על 5% CO 2/95% טנק אטמוספרי כדי לספק אוויר CO 2 בתוספת לשלב חממה עליונה. קצב הזרימה צריך להיות בין 60 ל 80 מ"ל של גז לדקה. שיעורים מהר יותר יגרמו להתייבשות מדגם נרחבת למרות קאמרי humidifying.
- הוסף שמן עדשה לעדשה אובייקטיבית ולמקם את התרבות שיהיה צילמו לשלב העליון החממה באופן מיידי.
- לאפשר איזון של טמפרטורה בתרבות למינימום של 10 דקות. שעה אחת עדיפה, במיוחד עבור ההדמיה הלילה המתוארת בסעיף 3.
- שש עד שמונה שעות לפני ההדמיה, להדביק צלחת 35 מ"מ coverslip התחתון של נוירונים SCG בוגרים, ניתק עם 1 x 10 6 יחידות פלאק להרכיב של הנגיף של עניין (ראה טבלת מס '1 לוירוסים לדוגמה), תוך שימוש בשיטה המתוארת בטיילור ואחרים אל. 2012a 11. אם בדיקת וירוס אחד או יותר, חיסונים קיזוז על ידי 30-60 דקות, כדי לאפשר הדמיה של דגימות רציפות בזיהום הודעה פעמים דומה.
- הכנס לתוך צלחת שלב העליונה חממה למינימום של 10 דקות לפני הפעלת כל ניסוי. בעוד טמפרטורת equilibrates, מישור המוקד עובר ויהיה להשפיע לרעה על כל ניסויי הדמיה.
- באמצעות אור מועבר והעינית של המיקרוסקופ, למצוא גוף תא עצבי שיש לו סיומת axonal בבירור מבודדת. לחלופין, השתמש בתאורה המתאימה לקרינה למצוא תא להביע detecכמויות טבלה של חלבוני ניאון. חשוב להגביל את החשיפה של מדגם לתאורת פלורסנט, בשלב זה והשלבים הבאים, בגלל נזק לתאים מושרה אור והלבנה של חלבוני ניאון.
- להחליש תאורת הקרינה כדי להפחית את עוצמת אור עירור לתאים שנחשפים. לעסוק אור הממתן צפיפות ניטרלי (ND) במסנני הקרינה נתיב אור התאורה. עבור סרטים שנמשכים יותר מ 1 דקות, מינימום של ND4 חייבים לשמש כדי למנוע צילום הלבנת של חלבוני ניאון ותמונות נזק של אקסונים נרחבים. מבנים מאוד ניאון בדרך כלל יכולים להיות דמיינו עם מסנן ND8 במקום.
- באמצעות תוכנת מיקרוסקופ (איור 2 ומשלימת הסרט 1A), להדליק את האור, הדרך למצלמה EM-CCD.
- לקבוע זמני הדמיה אופטימליים ותנאים לכל ערוץ ניאון.
- ליזום חלון תמונה חי באמצעות כפתור "הפעל". </ P>
- לקבוע את הגדרות חשיפת המצלמה האופטימליות עבור כל חלבון פלואורסצנטי. לא תעלה על 300 אלפית שנייה לכל ערוץ כסטיות motional של מבני virion זזו מהר יתרחש. לנצל את רווח EM של המצלמה להגדרה של 300 (יצרן הציע רווח מרבי), כדי לצמצם את זמן חשיפה ולשפר את זיהוי של אותות עמומים. זמני חשיפה נכונים צריכים לייצר תמונה עם רקע בעוצמה נמוכה ואותות ספציפיים גבוהים.
- לאחר הגדרת חשיפות ומציאת אזור מוגדר היטב של האקסון, יש להגדיר את התוכנה כדי לבצע רכישת תמונה אוטומטית. עצור את חלון ההדמיה לחיות כדי למנוע הלבנת מדגם.
- בתוכנת אלמנטי ש"ח, בחר 6 ד - הגדר / הפעלת יישום ניסוי מירידת "יישומים" למטה בתפריט.
- בחלון רכישת ND, לחץ על כרטיסיית הזמן שתקבע את תדירות רכישה של תמונה. הגדר את המרווח ל" אין עיכוב "ואת משך הזמן עד 5 דקות. הלאחר מכן תוכנת דואר תרכוש מסגרות תמונה בתדירות הגבוהה ביותר האפשרית עבור משך זמן של 5 דקות.
- בחר בכרטיסייה "למבדה", המאפשרת בחירה של תצורות החומרה שנקבעו מראש המשמשות לרכישת תמונת ניאון מרובה. לחץ על התיבה הראשונה ולאחר מכן בירידה למטה בתפריט כדי לבחור תצורת חומרה מתאימה. חזור על פעולה עבור כל חלבוני הניאון להיות צלמו.
- להבטיח את הכרטיסיות לפוזיציות "XY", "Z-סדרה" ו "תמונה גדולה" הן דה שנבחרה.
- מעל לכרטיסיות, בחר בתיבה המסומנת "שמור לקובץ" כדי לשמור את התמונות באופן אוטומטי לדיסק הקשיח במהלך רכישה. הגדר את המיקום ואת שם קובץ של קובץ פלט הניסוי. כניסויים רציפים מבוצעים, התוכנה תוסיף את מספר סידורי בסוף שם הקובץ המיועד.
- ברגע שכל הכרטיסיות שנבחרו. ליזום את הניסוי על ידי לחיצה על הכפתור "Run-עכשיו".
- לייעל את קצב רכישת התמונה דרך הגדרות חשיפה ומתאר לעצמיגודל דואר. שימוש באזור קטן של שטח תמונה, מסוגל לעתים קרובות להאיץ את שיעורי רכישת מסגרת. הגדר את האזור של עניין באמצעות כלי ההחזר על ההשקעה בש"ח-אלמנטים, בחירת אזור שבין 25% ל 50% משטח התמונה הכולל. לחלופין, זמני חשיפה קצרים יותר יגדילו את שיעורי רכישת מסגרת, אבל מקטין את איכות האות (ראה דיון).
סעיף 3 - זמן לשגות הדמיה של אירועי לילה מורחים אנטרוגדית
- ארבע שעות לפני הדמיה, להדביק תרבות עצבית ממודרת נבנתה על 35 מ"מ μ-תבשיל. לחסן גופי תאים עצביים עם 1 x 10 6 יחידות פלאק להרכיב של הנגיף של עניין (ראה טבלת מס '1 לוירוסים לדוגמה), תוך שימוש בשיטה המתוארת בטיילור et al. 2012b 12.
- מניח בעדינות צלחת התרבות לשלב העליונה החממה. ודא את המיקום של המטרה מוגדר לצד המנה. לאט לאט מביא את המטרה אל מוקד, ensuring האובייקטיבי לא לדחוף לתוך המדגם. ברגע ששדה המיקוד זוהה, לנוע באיטיות במטרה למרכז הצלחת, ליד המחסום הפנימי demarking הצד הפנימי של תא האקסון. במהלך תנועה, להבטיח את עומק המיקוד נשמר ולהימנע מלדחוף לתוך המדגם. סטייה של משטח הפלסטיק על ידי המטרה תגרום ניזק לאקסונים והפלסטיק.
- הוסף כ -2 מ"ל של חם (~ 37 מעלות צלזיוס) בופר פוספט למנת התרבות חיצונית של טבעת הטפלון. זה מקיף את התרבות העצבית עם טבעת של PBS כדי למזער את ההתייבשות לדוגמה ומספקת בידוד תרמי.
- לאפשר טמפרטורה לאזן עבור מינימום של שעה 1 לפני ייזום רכישת תמונה אוטומטית (3.8). שלבים 3.5 עד 3.7 יכולים להיות מוגדרים בתקופה זו.
- להגביל את עוצמת התאורה לרמה הנמוכה ביותר האפשרית על ידי העוסק כל מסנני הצפיפות ניטראליים. זה יאפשר רכישת תמונה תכופה oveפרקי זמן ארוכים ללא תמונה r-נזק מוגזם. הפחתת תאורה תגרום לאות נמוכה, הדורשת חשיפה ארוכה יותר (ראה דיון).
- השתמש בהגדרות חשיפה היסטורי או לפני ניסיוני ההגדרה ליצור מנה מקבילה של תאי האפיתל נגועים להביע את חלבוני ניאון היעד להקים הגדרות חשיפה כמתואר בסעיף 2.5.
- לאחר הגדרת חשיפות לאפיקים הדרושים, זה זמן להגדיר את התוכנה לרכישת תמונה אוטומטית. עצור את חלון ההדמיה לחיות להגביל מדגם הלבנת.
- בתוכנת אלמנטים (איור 2 וסרט משלים 2), בחר 6 ד - הגדר / הפעלת יישום ניסוי מהירידה "יישומים" למטה בתפריט כדי להעלות את חלון רכישת ND.
- בחלון רכישת ND, לחץ על כרטיסיית השעה. הגדר את המרווח ל" 5 דקות ". הגדר את משך הזמן עד 20 שעות. שדה הלולאות יחושב באופן אוטומטי למספר חזרות prograמ 'יבצע.
- בחר בכרטיסייה "למבדה". לחץ על התיבה הראשונה ולאחר מכן בירידה למטה בתפריט בחר בתצורה המתאימה למבדה בניגוד שלב. חזור לעמדות שלאחר מכן, בחירת התצורות המתאימות לכל חלבון פלואורסצנטי להיות צילמו.
- בחר בכרטיסייה "התמונה גדולה", הקובעת את הפרמטרים של מספר רב של תמונות כדי להיות משולבים לתוך שדה אחד גדול של נוף. אזור טוב בגודל מורכב 5 תמונות x 2 באמצעות חפיפה תפרים 7%. זה יאפשר למספר המרבי של תאים לכל עמדה להיות צילמו מבלי להשפיע על התדר של רכישת תמונה. כמו כן, בטל את סימון התיבה עבור "תריס פעיל סגור במהלך תנועת הבמה". אפשרות זו משפרת את המהירות של רכישה על ידי לא סוגר תריסים בין תמונות.
- בחר בכרטיסייה "XY פוזיציות", כדי לזהות מספר רב של עמדות שיהיה צלמו ברצף במקביל במהלך הסרט בין לילה. בחר עמדות המגדירות את פו המרכזint עבור כל אזור בתמונה גדול. בחר 6-8 עמדות תמונה במדגם. שטח תמונה טוב יהיה אשכולות קטנים של תאים בפרד קרוב לאקסונים מוגדרים בבירור. תאים לא צריכים להיות נערם זו על גבי זו bundling האחרת והאקסון צריך להיות ממוזערים. נקודת המיקוד היא גרעין התא. מקם את המטרה כך שמעטפת גרעין מוגדר היטב נתפס עבור רוב התאים.
- להבטיח את הלשונית "Z-הסדרה" אינה מסומנת.
- הגדר את התכונה 'שמירה אוטומטית כאמור לעיל בסעיף 2.6.5.
- בדוק את החשיפה והגדרות מיקום על ידי לחיצה על "זמן הלולאה 1". להעריך את התמונות משודר לתאורת אור, מיקוד ומסגור כתוצאה מכך. אם המיקוד השתנה, לאפס את המוקד לכל עמדה תחת לשונית XY. חכה 10 דקות ולחזור על פעולה זו עד שהדגש הוא יציב.
- לאחר אומתו את כל ההגדרות ונבדקו, ליזום ניסוי האוטומטי על ידי לחיצה על הכפתור "הפעל כעת".
עיבוד תמונה ויצוא - סעיף 4
נתוני יצוא
- מערכי נתונים שהושגו במהלך לחיות תאי הדמיה של אירועי תחבורה או התפשטות צריכים להיות מיוצאים מהתוכנה שקל אלמנטים לסוגי קבצים בשימוש נפוצה לשימוש מאוחר יותר במצגות ופרסומים (משלימה סרט 3). כדי לייצא סרטים לפתוח את הקובץ המתאים nd2 הגלם. באלמנטי ש"ח ובחר את התצוגה "פיצול המרכיב" כדי להמחיש את ערוצי הניאון הרצויים. השמעת הקובץ במהירות מתאימה, 5 מסגרות לשנייה היא נקודת התחלה טובה להדמיה של תחבורה מהירה.
- כולל חותמת זמן כדי לייצג את שעון בזמן אמת בעת צפייה בסרט. לחץ לחיצה ימנית על התמונה ובחר, הוסף ND-מידע. מונה דיגיטלי יופיע בפינה השמאלית העליונה.
- ערוך את חותמת הזמן כדי להציג את המידע. לחץ לחיצה ימנית על הדלפק ובחר עריכת ND-מידע. בחלון הקופץ שלאחר מכן, ערוך את הטקסט כדי לשקף Imagiפרמטרים ng שחשובים. עריכת גופן, צבע וגודל לבהירות.
- לכו לתפריט "ערוך" ולמצוא את "יצירת תמונת מצב תצוגה" או לחץ על המקש "X". פקודה זו פותחת את החלון "תצוגת תמונת המצב". בחר "תחול על כל המסגרות" לייצר 8 סיביות, RGB, קובץ יצוא מוכן המכיל את ערוצי ניאון מכל הסרט.
- שמור כקובץ. אבי עבור תאימות בין הפלטפורמה. קבע שיעור השמעה ב 200 אלפיות שנייה לכל מסגרת. את קבצי AVI. נוצרו על ידי אלמנטי ש"ח אז ניתן לדחוס עוד יותר עם תוכנת המרה אחרת לסוג הקובץ הרצוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התחבורה אנטרוגדית
יישום של פרוטוקול זה לזיהומים של תרבויות SCG ניתק עם PRV 348, זן PRV רקומביננטי לבטא חלבוני איחוי קרום GM-mCherry GFP-Us9 ו, יש להקל הדמיה של התחבורה אנטרוגדית של virions (איור 3 וסרט משלימה 4). שילוב של החלבונים האלה ההיתוך לתוך תוצאות נגיפיות חלקיקים באיתורם בהובלת puncta ותנאי ההדמיה האמורים למזער את הקיזוז של כל fluorophore על חלקיק בתנועה במהלך מיתוג מסנן. בחלון הדמיה של שלוש דקות, puncta הובלה רב הם נצפו בדרך כלל וגודל מדגם גדול עבור ניתוחי colocalization נוצרים במהירות. יש לנו לכמת colocalization של ה-GFP-Us9 בעבר, נגיף alphaherpes axonal מיקוד חלבון, עם חלבונים מבניים אחרים המשתמשים בגישה זו 11. ניתוח דומים של recombinan הכפול האחריםזני PRV t יש גם תאר 11, והעבודה האחרונה תעד שיתוף ההובלה של חלבוני PRV עם חלבון מנוע מארח מתויג fluorescently בהארכה נוספת של פרוטוקול זה 21. ניצול גלגלי סינון מיתוג מהירים ומראות dichroic מרובות עוברות לזווג מאפשר רכישה רציפה מהירה של שניים או יותר ערוצי ניאון. בשלב זה אנו יכולים להשיג רכישת שני ערוצים רציפים במהירויות של עד 0.8 פריימים לשנייה. למיקרוסקופיה וידאו הערוץ היחידה, אשר מוגבלת רק על ידי זמן חשיפת הקרינה וזמן קריאה של המצלמה, אנחנו יכולים להשיג שיעורי רכישה של יותר מ 6 פריימים לשנייה.
מורחים אנטרוגדית
כדי להמחיש את התפשטות אירועי אנטרוגדית, תחומי העניין הם דמיינו בכל 5 עד 10 דקות לתקופה של 20 שעות, שבמהלכו virions הזמן יעביר למטה ויציאה מהאקסונים, מדביק את תאי האפיתל בקרבת המקום. מסגרת נציג מהתמונה הגדולה הןמוצג באיור 4 א וסרט משלים 5. שים לב לטבע המופרד מרחבית של התאים לבטא חלבון פלואורסצנטי, המעידים על זיהום עיקרי מאקסונים. ניתן לעקוב בתאים נגועים אחורה במהלך הסרט כדי להמחיש את capsids הניאון שיזם את זיהום ויראלי. ניתן לבודד תאים בודדים אלו מהמסגרת הגדולה ולעקוב אחריו ללא אובדן משמעותי של פירוט. נציג המסגרת (איור 4) מסרט משלימה 6 מתארת פעם אחר virions הפקידו קופסית הניאון לציטופלסמה.
ניתוח נתונים
מגוון רחב של ניתוחים שונים יכול להתבצע על מערכי נתונים לחיות תאי הדמיה, כולל מעקב אחר חלקיקים, מחקרי colocalization, וכימות של אירועי התפשטות virion. לעתים קרובות אנו לבצע הניתוחים שלנו ישירות בתוכנת אלמנטי ש"ח או ניצול התוספת סיומת זמינה עבור אמאחבילת תוכנה המאפשרת GEJ. תמיכה בקבצים מסוג nd2. השערות שונות וsetups הניסיוני מחייבים שיטות אנליטיות ייחודיות. הקבוצה שלנו תאר את השיטות להערכת colocalization של חלבוני ניאון על מבנים דינמיים 11,21 וכימותים זמן לשגות של אירועי התפשטות חלקיקים בודדים 10,12,22. המתודולוגיות לתאר בכתב היד הזה והמחקרים הקודמים שלנו הם גמישים ויכולים להיות מיושמים על זיהומים נגיפיים שונים, כמו גם התחבורה של מבנים הסלולר, 23 המיטוכונדריה למשל.
איור 1. סכמטי של מיקרוסקופיה להגדיר עבור הדמיה תא חי. א) סוגי תרבות מועסקים למחקרים של תחבורה אנטרוגרדית (ניתק) והתפשטות אנטרוגרדית (בליעה), בהתאמה. לוח 1 הוא תמונה לעומת שלב של הגרעינים בוגרים, ניתקו Superior צוואר הרחם (SCG). לוח 2 הוא סכמטי של מערכת התרבות הממודרת, בתמונה בפנל 3, עם נוירונים SCG מצופים בתא השמאלי ותחזיות axonal הארכה מתחת למחסומים הפנימיים לתוך התא הימני רחוק. ב ') מיקרוסקופ epifluorescent ההפוך ותצורת חממה העליונה במה משמשת עבור ניסויים מיקרוסקופי וידאו. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 2. ש"ח-אלמנטי ממשק תוכנה. צילום מסך של ממשק משתמש סטנדרטי בש"ח-אלמנטים מוצג. שחק וחצני עצירה לשלוט חלון לחיות תמונה המתאר את תצורות החומרה הנוכחיות עבור הדמיה, כמו גם מה שנמצא כרגע בהדמיה. על פני הלוח העליון הן סדרה של תצורות אופטיות שנקבע מראש ליישם החומרה settings כדי להגדיר את המיקרוסקופ לזיהוי טרנס מואר או הקרינה. השליטה במצלמה והגדרות חשיפה לאפשר תצורה של זיהוי מצלמה כדי לייעל את איכות תמונה ומהירות. כל הניסויים מתואמים באמצעות פקדי רכישת ND. לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 3. לחיות הדמיה תא של האקסונים SCG בשעה 8 לאחר פגיעת HR עם PRV 348. 348 נוירונים נגועים PRV לבטא חלבוני איחוי קרום GM-mCherry GFP-Us9 ו. מבני ההובלה-אנטרוגדית בתוך האקסונים דיסטלי הם דמיינו בשני ערוצי ניאון, GFP וmCherry. מבנה הובלה-אנטרוגרדית (חץ לבן) מתקדם בתוך האקסון כמתואר בתמונות רציפות לקוחים מסרט משלים 4. שני חלבוני הניאון הם spatiברית קיזוז בשל רכישה רציפה של ערוצי ניאון והתנועה המהירה של מבנים ויראליות. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 4. הדמיה של אירועי לילה timelapse התפשטות אנטרוגדית מהאקסונים נגועים לצבירי תאי אפיתל במהלך זיהום צבע רב. נציג תמונות מעמדה אחת, סרט זמן לשגות שיש תמונה גדולה של שידור virion מPRV 427 האקסונים נגועים לתוך תאי האפיתל של נמענים.) תמונה ממוזגת של תמונות הניאון המשודר, וYFP RFP בזיהום שלאחר זמן שבו תאי נמען מתחילים לבטא חלבוני היתוך VP26-mRFP YFP-CAAX ו. בפנל השני, ערוצי YFP וRFP מוצגים יחד. שים לב למספר הגדול של mRFP puncta associated עם שטחי האקסון. אלה הם virions התאספו העוברים תחבורה למרחקים ארוכה בתוך אקסונים (משלימה סרט 2). הקופסה הלבנה מייצגת את תחום העניין המודגש בחלק ב 'ב') תמונת נציג של תאי האפיתל המכילים נמען רכבות capsid מדביק (ראה גם סרט משלים 3). לוח 1 הוא מיזוג של הערוצים המשודרים וRFP. לוח 2 הוא ערוץ RFP לבד. 3 פנל הוא ערוץ RFP עם ייצוג סכמטי של קווי המתאר התא (קו לבן מוצק), גרעין (קו לבן מרוסק), ואקסונים (קווים כחולים). לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
משלימה סרט 1. הגדרות תוכנה לרכישה מהירה ורציפה של virions axonal. את הצעדים הקשורים לקביעת הגדרות חשיפה, הגדרת בקרות רכישת ND, ורכישת מסגרת רכישה מהירה מוvie של virions ניאון העוברים תחבורה axonal מוצג. תרבות נוירון SCG הייתה נגועה בPRV 427 שמונה שעות לפני ההדמיה. לחץ כאן לצפייה בסרט.
משלימה סרט 2. הגדרות תוכנה להדמיה של התפשטות לילה האקסון אל תא. השלבים הקשורים לקביעת תצורה של פקדי רכישת ND הדמיה הלילה של אירועי התפשטות האקסון אל תא מוצגים. לחצו כאן לצפייה בסרט.
משלימה סרט 3. המרת. Nd2 קבצים לפורמטי סרט ייצוגיים. את הצעדים הקשורים להמרת הנתונים הגולמיים. Nd2 קבצים לתוך אחד. Avi או פורמטים של קבצים. Mov למצגת באמצעות נגני וידאו נפוצים. לחצודואר לצפייה בסרט.
סרט משלים 4. לחיות הדמיה תא של האקסונים בSCG 8 שעות שלאחר זיהום עם PRV 348. לחץ כאן לצפייה בסרט.
משלימה סרט 5. שטח תמונה גדול של הדמיה הלילה של האקסון אל תא התפשטות. לחץ כאן לצפייה בסרט.
משלימה סרט 6. אזור מוגדל של ההדמיה timelapse הלילה של האקסון אל תא התפשטות. לחץ כאן לצפייה בסרט.
| להתאמץ | גנוטיפ | תועלת |
| PRV 341 | GFP-Us9 (קרום) / mRFP-Vp26 (קופסית) Virion ניסויי תחבורה 11 | |
| PRV 348 | GFP-Us9 (קרום) / GM-mCherry (קרום) | Virion ניסויי תחבורה 11 |
| PRV 427 | mRFP-VP26 (קופסית) / YFP-CAAX (סלולרי פלזמה קרום) | התפשטות ניסויי אנטרוגדית 10 |
טבלת מס '1. זני PRV רקומביננטי שימושיים המבטאים חלבוני היתוך ניאון.
| שם | חברה | מספר קטלוג |
| 35 צלחת תרבות תחתית כוס מ"מ | חברת MatTek; אשלנד, MA | P35G-1.5-20-C |
| 35 מ"מ μ-Dish | Ibidi ארה"ב LLC, ורונה, WI | 81,156 |
| גוף מיקרוסקופ | ניקון מכשירים בע"מ | Niקון אקליפס טי |
| שלב XY מיקרוסקופ ממונע | לפני מדעי; רוקלנד, MA | H117 למעלה Proscan שטוח |
| גלגלים ממונעים סינון | לפני מדעי | HF110 גלגל 10 עמדת מסנן |
| מקור תאורת פלורסנט | הלום Dynamics; מיסיסאוגה, אונטריו קנדה | X-Cite 120Q |
| להקה מרובה מסנן הקרינה קובע | Chroma הטכנולוגיה קורפ; מפוח פולס, VT | 89000 Sedat Quad - ET 89,006 ECFP / EYFP / mCherry - ET |
| EM-מצלמת CCD | אנדור הטכנולוגיה ארה"ב; דרום וינדזור, CT | iXon3 897 |
| Chamlide שלב עליון חממה סביבתית | לחיות מכשירים סלולריים; סיאול, דרום קוריאה | TC-L-10 |
| דוד עדשה אובייקטיבי | Bioptecs; באטלר, הרשות הפלסטינית | 150,803 בקר150819-12-08 מחמם |
| תוכנת ניתוח | ניקון מכשירים בע"מ; מלוויל, ניו יורק | אלמנטי ש"ח |
טבלת 2. חומרים כימיים וציוד ספציפיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המטרה של הדמיה תא החי היא התבוננות בתהליכים ביולוגיים כפי שהם מתרחשים ללא שינוי משמעותי על ידי הפעולה של התבוננות. מטרה זו מושגת על ידי אופטימיזציה של שלוש משתנה: איכות סביבה, מהירות של הדמיה, ותאורת פלואורסצנטי. משתני היתר תלויים אלה חייבים להיות מאוזנת כדי להשיג תנאי הדמיה קיימא. הפרוטוקולים שהוצגו לנצל תנאים מסוימים כדי להפיק את התוצאות המייצגות. אנו נדון באיכות הסביבה ונזק תצפיתי בקצרה לפני מפרט את השיטות הספציפיות שהוצגו.
ההקמה ותחזוקה של תנאים ביולוגיים רלוונטיים על המיקרוסקופ היא קריטית לניטור המוצלח של אירועים הסלולר. השגת תנאי היעד תלוי במספר המשתנים הספציפיים למיקרוסקופ ותצורת חממה. כל הגדרות החממה צריכה להיות מאומתת באמצעות מדידת טמפרטורה עצמאית של מדגם מדומה בחממה נלקחהבתפקידים רבים, כולל; נקודת המגע אובייקטיבי, באמצע צלחת התרבות, ואת הקצה של צלחת התרבות. הגדרות צריכה להיות מותאמות כדי למזער את האזורים שבם יותר מ 1 מעלות צלזיוס חמה יותר מ 37 מעלות צלזיוס, כמו גם שמירה על טמפרטורה הקרובה ל 37 מעלות צלזיוס בנקודת מגע אובייקטיבי. כל מנה תרבות ותצורה אובייקטיבית המשמשת להדמיה חייבות להיבדק ומאומתים לפני הניסויים. באופן אידיאלי, כל הדגימות היינו להיות פיקוח על הטמפרטורה במהלך הדמיה, אבל זה מוכיח מעשי עבור מספר המערכות ומסובך, כאשר סוכנים ביולוגיים מסוכנים הם מועסקים. אישור בתנאי דגירה חשוב, כמו דוגרים דגימות נמוכות מדי או גבוה מדי של טמפרטורה יכול לגרום לתוצאות artifactual או השפלה סלולרית מהירה.
זיהוי ומזעור תוצאות הנובעות מנזק תצפיתי הוא חשוב לפיתוח פרוטוקול. תכופה תאורה יכולה לשנות תהליכים ביולוגיים, IRReversibly להשבית מולקולות ניאון, או לגרום למספר מסלולי מוות התאיים. אימות טמפרטורה היא חשובה כדי לשחזר תנאים ביולוגיים דומים בחלק העליון השלב המקביל לאלה של תרבות תקן רקמות חממה. שליטה על ההשפעות של תאורה תכופה היא קשה יותר ולעתים קרובות דורש איטרטיבי ניסוי ושיטות שגיאה. השוואה בין דגימות במקביל המשיכו בחממות תרבית רקמה להבדלים מורפולוגיים או שינויים רלוונטיים מבחינה ביולוגית יכולה לקבוע אם תוצאות תנאי הדמיה לחיות תאים ברעילות סלולרית משמעותית. בניסויים שתוארו כאן, יש לנו לנטר את הפרודוקטיביות של זיהום ויראלי בכייל נגיף, כמו גם מידת ההתפשטות נגיפית בין תאים.
השגת בזמן אמת הדמיה של תחבורה מהירה בתוך האקסונים דורשת אופטימיזציה של מהירות רכישת תמונה לצד עוצמת הארת פלואורסצנטי. המהירות של רכישת תמונה נקבעת על ידי camerבהגדרות וחומרת מיקרוסקופ, במיוחד כאשר איסוף ניאון ערוצים מרובים ברצף. עוצמת הארה משפיעה על איכות אותות ניאון וקצב הרכישה. עוצמת תאורה גדולה יותר מאפשרת הדמיה קלה יותר של חלבוני ניאון, במיוחד עבור אלה שמשלבים לתוך חלקיקים בכמויות קטנות. עם זאת, מדגם אקונומיקה מהר יותר וסובל מנזק phototoxic משופר. הפחתת תאורה באמצעות מסנני צפיפות ניטראליים דורשת זמני חשיפה ארוכות יותר, הפחתת תדירות רכישה של תמונה ואפשרות גרימת עיוות המרחבי של מבני ניאון בשל תנועתם במהלך איתור. מציאת האיזון הנכון של עוצמת תאורה בתדירות רכישת תמונה תלויה במידה רבה באות חלבון פלואורסצנטי ושיעור תנועתיות של המבנה הנלמד. זה הכרחי רק כדי לרכוש מספיק אות כדי להבדיל את מבני הניאון מעל רקע, ולאלייצר תמונות עם ניגודיות גבוהה שדורשות זמני חשיפה ארוכות יותר.
ההדמיה timelapse הלילה מנצלת תצורת חומרה דומה כמו לחיות תאי הדמיה בזמן אמת, אבל הוא השפיע באופן משמעותי על ידי צבר צילום נזק קשור לטווח ארוך, תאורת הקרינה תכופה. בניגוד להדמיה בזמן אמת, את הצורך להגביל את עוצמת תאורת הקרינה הוא בעל חשיבות עליונה, וכל המשתנים האחרים הותאמו לחשבון להגבלה זו. הגבלת עוצמת החשיפה מאפשרת לתאורה תכופה יותר של ערוצי ניאון מרובים מבלי לפגוע באופן משמעותי את תאי ההדמיה. אירועים התפשטו האקסון אל תא אנטרוגרדית הם באופן זמני ומרחבית נבדלת, ולכן הדמיה שטח גדול הוא חיוני כדי ללכוד כמה שיותר מאירועים אלו נדירים ככל האפשר.
מספר הפרסומים סיפקו סקירות והמלצות לשיטות עבודה יסודיות הדמיה תא חיות 24-26. הפרוטוקולים המפורטים כאן represאף אוזן גרון הניסיונות הכי טובים שלנו כדי למזער את ההשפעה של דימות פלואורסצנטי על שכפול נגיפי, תחבורה, והתפשטות, תוך השמירה על התכונות המהותיות של זיהום ויראלי. שילוב של פרוטוקולים אלה עם הפיתוח זהיר של חלבוני היתוך ניאון ותרבויות עצביות החזקות שענה על השאלות הבסיסיות שלי של זיהום ההרפס ופתוגנזה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש לנו מה למסור.
Acknowledgments
LWE ור.ק. נתמכים על ידי המוסד האמריקאי הלאומי לבריאות מענקי R37 NS033506-16 ו R01 NS060699-03. MPT נתמכה על ידי מלגת אגודת אמריקנית לסרטן דוקטורים מחקר (PF-10-057-01-MPC). העצות והידע של ד"ר מתיו ויימן ד"ר אורן Kobiler סייעו בעיצוב תצורת המיקרוסקופ ושיטות הדמיה תא חיות. אנחנו גם להרחיב בזכות בארלו ניל ובריאן קין ט של ניקון מכשירים לסיוע הטכני שלהם ברכישה, ההתקנה והביצוע של המיקרוסקופ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm glass bottom culture dish | MatTek Corporation; Ashland, MA | P35G-1.5-20-C | |
| 35 mm μ-Dish | Ibidi USA LLC, Verona, WI | 81156 | |
| Microscope body | Nikon Instruments Inc. | Nikon Eclipse Ti | |
| Motorized microscope X-Y stage | Prior Scientific; Rockland, MA | H117 ProScan Flat Top | |
| Motorized filter wheels | Prior Scientific | HF110 10 position filter wheel | |
| Fluorescent illumination source | Lumen Dynamics; Mississauga, Ontario Canada | X-Cite 120Q | |
| Multi-band Fluorescence filter sets | Chroma Technology Corp.; Bellows Falls, VT | 89000 Sedat Quad - ET 89006 ECFP/EYFP/mCherry - ET | |
| EM-CCD camera | Andor Technology USA; South Windsor, CT | iXon3 897 | |
| Chamlide stage top environmental incubator | Live Cell Instruments; Seoul, South Korea | TC-L-10 | |
| Objective lens heater | Bioptecs; Butler, PA | 150803 Controller 150819-12-08 Heater | |
| Analysis software | Nikon Instruments Inc.; Melville, NY | NIS Elements |
References
- Johnson, D. C., Baines, J. D. Herpesviruses remodel host membranes for virus egress. Nature reviews. Microbiology. 9 (5), 382-394 (2011).
- Mettenleiter, T. C., Klupp, B. G., Granzow, H. Herpesvirus assembly: a tale of two membranes. Current Opinion in Microbiology. 9 (4), 423-429 (2006).
- Saksena, M. M., Wakisaka, H., et al. Herpes simplex virus type 1 accumulation, envelopment, and exit in growth cones and varicosities in mid-distal regions of axons. Journal of Virology. 80 (7), 3592-3606 (2006).
- Snyder, A., Wisner, T. W., Johnson, D. C. Herpes Simplex Virus Capsids Are Transported in Neuronal Axons without an Envelope Containing the Viral Glycoproteins. Journal of Virology. 80 (22), 11165-11177 (2006).
- Snyder, A., Polcicova, K., Johnson, D. C. Herpes simplex virus gE/gI and US9 proteins promote transport of both capsids and virion glycoproteins in neuronal axons. Journal of Virology. 82 (21), 10613-10624 (2008).
- Tomishima, M. J. A conserved alpha-herpesvirus protein necessary for axonal localization of viral membrane proteins. The Journal of Cell Biology. 154 (4), 741-752 (2001).
- Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. G. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).
- Kratchmarov, R., Taylor, M. P., Enquist, L. W. Making the case: Married versus Separate models of alphaherpes virus anterograde transport in axons. Reviews in Medical Virology. 22 (6), 378-391 (2012).
- Antinone, S. E., Smith, G. A. Two modes of herpesvirus trafficking in neurons: membrane acquisition directs motion. Journal of Virology. 80 (22), 11235-11240 (2006).
- Del Rio, T., Ch'ng, T. H., Flood, E. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. Heterogeneity of a fluorescent tegument component in single pseudorabies virus virions and enveloped axonal assemblies. Journal of Virology. 79 (7), 3903-3919 (2005).
- Taylor, M. P., Kramer, T., Lyman, M. G., Kratchmarov, R., Enquist, L. W. Visualization of an alphaherpesvirus membrane protein that is essential for anterograde axonal spread of infection in neurons. mBio. 3 (2), (2012).
- Taylor, M. P., Kobiler, O. Alphaherpesvirus axon-to-cell spread involves limited virion transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2012).
- Kobiler, O., Brodersen, P., Taylor, M. P., Ludmir, E. B., Enquist, L. W. Herpesvirus replication compartments originate with single incoming viral genomes. mBio. 2 (6), (2011).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).
- Ch'ng, T. H., Flood, E. A., Enquist, L. W. Culturing primary and transformed neuronal cells for studying pseudorabies virus infection. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). , 292-299 (2005).
- Curanovic, D., Ch'ng, T. H., Szpara, M., Enquist, L. Compartmented neuron cultures for directional infection by alpha herpesviruses. Current protocols in cell biology. Chapter 26 (Unit 26.4), (2009).
- Zareen, N., Greene, L. A. Protocol for culturing sympathetic neurons from rat superior cervical ganglia (SCG). J. Vis. Exp. (23), e988 (2009).
- Ch'ng, T. H., Enquist, L. W. Neuron-to-Cell Spread of Pseudorabies Virus in a Compartmented Neuronal Culture System. Journal of Virology. 79 (17), 10875-10889 (2005).
- Campenot, R. B., Lund, K., Mok, S. -A. Production of compartmented cultures of rat sympathetic neurons. Nature Protocols. 4 (12), 1869-1887 (2009).
- Kramer, T., Greco, T. M., Taylor, M. P., Ambrosini, A. E., Cristea, I. M., Enquist, L. W. Kinesin-3 Mediates Axonal Sorting and Directional Transport of Alphaherpesvirus Particles in Neurons. Cell Host & Microbe. 12 (6), 806-814 (2012).
- Smith, G. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. Herpesviruses use bidirectional fast-axonal transport to spread in sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3466 (2001).
- Kramer, T., Enquist, L. W. Alphaherpesvirus Infection Disrupts Mitochondrial Transport in Neurons. Cell Host & Microbe. 11 (5), 504-514 (2012).
- Swedlow, J. R., Platani, M. Live cell imaging using wide-field microscopy and deconvolution. Cell Structure and Function. 27 (5), 335-341 (2002).
- Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. Short-Term High-Resolution Imaging of Developing Hippocampal Neurons in Culture. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (3), (2012).
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy - tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
