Entérico invasão bacteriana de células epiteliais intestinais In Vitro É dramaticamente aumentada usando um Vertical Modelo câmara de difusão

Summary

Realizando experimentos de cultura celular para investigar a adesão bacteriana e invasão em condições aeróbias é geralmente representativa do In vivo Ambiente. Um modelo de câmara de difusão vertical permite estudo das interações do patógeno humano Campylobacter jejuni Com células epiteliais intestinais em mais In vivo Condições semelhantes, resultando na invasão bacteriana melhorada.

Abstract

As interacções dos agentes patogénicos bacterianos com células hospedeiras têm sido investigados extensivamente usando métodos de cultura de células in vitro. No entanto, como estes ensaios de cultura de células são realizadas em condições aeróbias, estes modelos in vitro não pode representar exactamente o ambiente in vivo nas quais as interacções hospedeiro-agente patogénico a ter lugar. Nós desenvolvemos um modelo in vitro de infecção que permite a co-cultura de bactérias e células hospedeiras diferentes meios e sob condições de gás. A Câmara de difusão vertical (VDC) modelo imita as condições do intestino humano, onde as bactérias estarão em condições de muito baixo do tecido, enquanto o oxigênio será fornecido com o oxigênio do sangue. Colocação de células (IEC) monocamadas epiteliais intestinais polarizadas crescidas em Snapwell insere um VCC cria compartimentos separados apical e basolateral. O compartimento basolateral é preenchido com meio de cultura de células, selado e perfundido com oxigénio wHilst o compartimento apical é enchido com caldo, mantida aberta e incubados sob condições microaeróbias. Tanto as células Caco-2 e T84 IECs pode ser mantida na VCC sob estas condições sem quaisquer efeitos nocivos aparentes na sobrevivência celular ou a integridade monocamada. Coculturing experimentos realizados com diferentes C. as estirpes de tipo selvagem jejuni e diferentes linhas IEC no modelo VCC com condições microaeróbias no compartimento apical reprodutivelmente resultar num aumento do número de interagir (quase 10 vezes) e bactérias intracelulares (quase 100 vezes) em comparação com as condições de cultura aeróbias ^1. O ambiente criado no modelo VCC imita mais de perto o ambiente encontrado por C. jejuni no intestino humano e destaca a importância da realização de ensaios de infecção in vitro em condições que mais de perto imitar a realidade em vivo. Propomos que o uso do modelo VDC permite novas interpretações das interações apostarween agentes patogénicos bacterianos e as células hospedeiras.

Introduction

As interacções dos agentes patogénicos bacterianos com células hospedeiras têm sido investigados extensivamente usando métodos de cultura de células in vitro. Usando estes ensaios de cultura celular, a adesão bacteriana a células hospedeiras, a identificação de receptores de células hospedeiras, células do hospedeiro vias de sinalização e invasão bacteriana de células hospedeiras têm sido estudadas em pormenor, resultando em muitas observações importantes. No entanto, tais ensaios de cultura de células são realizadas em condições aeróbias, que podem não ser representativas do ambiente in vivo. Uma grande limitação de modelos in....

Protocol

1. Crescimento do IEC Monolayers em especial Filtros 0,4 mM

1. Culturas células Caco-2 em meio essencial modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro (v / v) de vitela fetal, 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina e 1% (v / v) de aminoácidos não essenciais em um cultura de tecido padrão incubadora a 37 ° C em 5% de CO ₂ e 95% de ar. Semente de 4 x 10 ⁵ células Caco-2 IECs por 0,4 um filtro de polarização e crescer para mais de 21 dias, passando os meios de comunicação a cada 2-3 dias.
2. Medir a TEER para confirmar o estado de polarização da monocamada utilizando um medidor de resistência de volt-oh....

Results

Coculturing experimentos realizados com um C. jejuni estirpe de tipo selvagem e IECs no modelo VCC com condições microaeróbias no compartimento apical demonstraram um aumento no número de interagir (quase 10 vezes) e bactérias intracelulares (quase 100 vezes) em comparação com as condições de cultura aeróbias em um tempo maneira dependente da ^1. Esta observação foi reprodutível usando duas C. diferente jejuni do tipo selvagem (11168H e 81-176) e duas linhas IEC diferentes (Caco-2 e .......

Discussion

A utilização de métodos de cultura de células in vitro para estudar as interacções dos agentes patogénicos bacterianos com células hospedeiras é uma técnica amplamente utilizada em muitos laboratórios de investigação. No entanto, como estes ensaios de cultura de células são realizadas em condições aeróbias, estes modelos in vitro não pode representar exactamente o ambiente in vivo nas quais as interacções hospedeiro-agente patogénico a ter lugar. A amplamente utilizada em mod.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sistema de difusão vertical especial para uso com insertos Snapwell	Aparelho Harvard	66-0001	Coletor e seis câmaras Snapwell
Tampas Aparelho	Harvard	66-0020
O-rings	Aparelho Harvard	66-0007
Grampos	Aparelho Harvard	66-0012
Filtros Snapwell (tamanho dos poros 0,4 μ m)	Corning Costar	3407
Millicell ERS-2 Volt-Ohm medidor de resistência	Millipore	MERS00002
WPA Lightwave II espectrofotômetro	Biochrom	80-3003-72