Nous décrivons ici un test in vivo de mutagenèse dans des petits nombres de cellules hématopoïétiques purifiées en utilisant le modèle de souris transgénique LacI. Le gène Lacl peut être isolé afin de déterminer la fréquence, le lieu et le type de mutants d'ADN spontanément surgi ou après l'exposition à génotoxines.
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Article de méthode
Identifier ADN mutations dans purifié hématopoïétiques cellules souches / progénitrices
Dans cet article
Résumé
Résumé
Au cours des dernières années, il est devenu évident que l'instabilité génomique est étroitement liée à de nombreux troubles du développement, des cancers et de vieillissement. Étant donné que les cellules souches sont responsables d'assurer l'homéostasie tissulaire et la réparation tout au long de la vie, il est raisonnable d'émettre l'hypothèse que la population de cellules souches est essentielle pour la préservation de l'intégrité du génome de tissus. Par conséquent, beaucoup d'intérêt a été soulevée dans l'évaluation de l'impact des facteurs endogènes et environnementaux sur l'intégrité du génome dans les cellules souches et leur progéniture, visant à comprendre l'étiologie des maladies à base de cellules souches.
Souris transgéniques lacI portent un vecteur de phage λ recouvrable codant pour le système rapporteur LacI, dans lequel le gène LacI sert de rapporteur de mutation. Le résultat d'un gène muté LacI est la production de β-galactosidase qui clive un substrat chromogène, le tournant dans le bleu. Le système rapporteur Lad est réalisée in toutes les cellules, y compris les cellules souches / progénitrices et peuvent facilement être récupérés et utilisés pour infecter ensuite E. coli. Après incubation E. infectée coli sur agarose contenant le substrat correct, plaques peut être marqué; plaques bleues indiquent un gène mutant Lad, tandis que les plaques claires abritent de type sauvage. La fréquence de bleu (entre les plaques claires) indique la fréquence de mutation dans la population de cellules d'origine de l'ADN a été extrait à partir de. Le séquençage du gène mutant LacI affiche l'emplacement des mutations dans le gène et le type de mutation.
Le modèle de souris transgénique Lad est bien établi comme un test in vivo de mutagenèse. En outre, les souris et les réactifs pour le test sont disponibles dans le commerce. Nous décrivons ici en détail comment ce modèle peut être adapté pour mesurer la fréquence d'apparition spontanée de mutants d'ADN dans les cellules souches enrichie en cellules Lin - IL7R - Sca-1 + cKit + + (LSK) et d'autres sous-populations de cellules du système hématopoïétique.
Introduction
Dans la plupart des tissus, des cellules différenciées ont une durée de vie limitée. Afin de maintenir l'intégrité fonctionnelle, les cellules souches spécifiques de tissu à long terme produisent en continu des cellules souches qui à leur tour donnent naissance à des cellules complètement différenciées nécessaires à la fonction de ce tissu particulier. Les cellules souches reconstituer aussi leur propre compartiment par un processus appelé auto-renouvellement. Ainsi, les cellules souches sont responsables du maintien de l'intégrité fonctionnelle des tissus ils résident po Par conséquent, il est impératif qu'ils sont équipés de mécanismes solides pour déte....
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Protocole
Les leucocytes de souris transgéniques LacI sur un fond C57BL / 6 n'expriment pas Sca-1 (Figure 1). Par conséquent, si Sca-1 est un marqueur utilisé pour la purification de cellules, ces souris ont besoin d'être croisée avec une souche appropriée pour obtenir Sca-1 expression; dans ce protocole F1 d'un croisement entre des souris C57BL / 6 (B6) des souris normales et LacI (C57BL / 6) chez la souris transgénique (LacI) a été utilisé (figure 1). Des populations cellulaires utilisées dans ce protocole, LSKs et CMP représentent les plus petites populations dans la moelle osseuse. Afin de purifier au....
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Résultats
Le test in vivo de mutagenèse mesure un événement rare (mutant UFP) parmi beaucoup d'événements (UFP). En effectuant le dosage avec un petit nombre de cellules, il est possible que le résultat est considérablement influencée par des résultats faux-positifs et faux-négatifs. Pour répondre à cette question nous avons réalisé une expérience de dilution en série avec des cellules de moelle osseuse non fractionnées, récoltées à partir de trois animaux différents. Nous avons mesuré la proportion de mutants .......
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Discussion
Le test in vivo de mutagenèse in décrite ici est basée sur le modèle de souris transgénique LacI initialement généré par Kohler et al. 18 Ce modèle utilise un vecteur de phage λ portant un gène rapporteur lad. Les deux sites cos flanquant le vecteur permettre une relativement simple récupération et le conditionnement ultérieur en particules infectieuses de phages, utilisés pour infecter E. coli. Une plaque bleue sera généré par phage infectées
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents.
Remerciements
Nous tenons à remercier David R. Rodriguez, MA pour la conception graphique et la photographie dans ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par un financement de la GCCRI, NIH / NIA (5R21AG033339) et la subvention d'appui Cancer Center (P30CA054174) à l'installation UTHSCSA cytométrie de flux de base et le Fonds UTHSCSA avancée Nucleic Acids Core.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| LacI souris transgéniques ; | BioReliance Corporation | ||
| , comprenant le cocktail de ribonucléase RNace-It | Agilent Technologies (Stratagene) | 720202 | |
| l’extrait d’emballage Transpack, y compris les tubes de transpack orange et bleu et le SCS-8 E. coli | Agilent Technologies (Stratagene) | 200221 | |
| Normes de taille d’ADN &ndash ; échelle lambda | Bio Rad | 170-3635 | |
| 0,025 mM Membranes poreuses ; | Fisher (Millipore) | VSWP 025 00 | |
| 245 mm2 Boîtes d’essai biologique (plateaux) ; | Fisher (Corning) | 07-200-600 | |
| Bouillon NZY (poudre) | Fisher (Teknova) | N1144 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| Agarose | Fisher | E-3120-500 | |
| N,N-Dimethylformamide | Fisher | AC34843-5000 | |
| X-gal | Research Products Intl Corp (RPI) | B71800-10.0 | |
| Proteinase K | Roche | 3-115-852 | |
| Prolongateur PCR Taq Polimerase kit | 5 PRIME | 2200500 | |
| Agencourt AMPure XP kit de nettoyage | Beckman/Coulter | A63880 |
Références
- Maslov, A. Y., Vijg, J. Genome instability, cancer and aging. Biochim. Biophys. Acta. 1790 (10), 963-969 (2009).
- Aguilera, A., Gomez-Gonzalez, B. Genome instability: a mechanistic view of its causes and consequences. Nat. Rev. Genet. 9 (3), 204-217 (2008).
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Réimpressions et autorisations
