Pattedyr integument inneholder løsemiddel-uttrekkbar lipider som kan gi kjemisk komposisjoner karakteristisk for enkelte arter. Dette papir presenterer en rutinemetode for separering av brede lipidklasser isolert fra integumentary vev ved hjelp av tynnsjiktskromatografi og bestemmelse av triacylglyceride profil ved matriks-assistert laser desorpsjon / ionisering time-of-flight massespektrometri.
Den pattedyr integument omfatter talgkjertlene som skiller ut et oljeaktig materiale på overflaten av huden. Sebum produksjon er en del av det medfødte immunsystemet som er beskyttende mot sykdomsfremkallende mikrober. Unormal sebum produksjon og kjemisk sammensetning er også et klinisk symptom på spesifikke hudsykdommer. Sebum inneholder en kompleks blanding av lipider, inkludert triacylglycerides, som er artsspesifikke. Den brede kjemiske egenskaper utstilt ved ulike lipidklassene hindre den spesifikke bestemmelse av sebum sammensetning. Analytiske teknikker for lipider vanligvis krever kjemiske derivatizations som er arbeidskrevende og øke prøveopparbeidelse kostnader. Dette dokumentet beskriver hvordan å ekstrahere lipider fra pattedyr integument, separate brede lipidklasser ved tynnskiktkromatografi, og profilen til de triacylglyceride innholdet ved hjelp av matriks-assistert laser desorpsjon / ionisering time-of-flight massespektrometri. Denne robuste metoden muliggjør en direkte bestemmelseav triacylglyceride profiler blant arter og mennesker, og det kan lett anvendes på en hvilken som helst taksonomisk gruppe av pattedyr.
Pattedyr integumentary vev inkluderer epidermis, keratinous strukturer (f.eks hår og negler), og eksokrine kjertler. Talg-type eksokrine kjertler er forbundet med hårsekker, som er kollektivt referert til som pilosebaceous enhet 1. Talgkjertlene frigi en oljeaktig eksudat på hudoverflaten referert til som talg. Sebum er stort sett består av glycerolipids (f.eks triacylglycerides [-tags]), gratis fatty acyls (FFA), sterol / voks estere, og squalene. Sebum kjemiske sammensetning er artsspesifikk to. I tillegg til å være en del av det medfødte immunsystemet og gi antimikrobielle funksjon 3, talg lipider påvirker viktige fysiologiske prosesser, inkludert fordamping vanntap gjennom huden 4, cellular integritet og genregule 5, og absorpsjonen seks. Talg lipid komposisjoner kan også tjene som sykdomsmarkører. Endrede forhold og mengder av talg broad lipidklassene er kliniske tegn til sykdommer som akne vulgaris 7, flass 8, seboreisk eksem 8, asteatosis 9, blant annet 10. Epidermale og hår vev inkluderer variable profiler som inneholder sterol og derivater, koder, FFA, ceramider, fosfolipider og andre mindre fettkomponenter. Fordi integumentary lipider kan fungere i sykdomsprosesser, bestemme forskjeller i kjemiske sammensetninger av koder mellom friske og syke personer kan være nyttig for klinisk diagnose av sykdommen.
Lipider er generelt definert til å være vann-uløselige organiske forbindelser med enten ikke-polar eller ikke-polar-polare substituenter 11. Lipid strukturer kan være lange karbonkjeder, oksygenerte alkaner (inkludert voksestere, FFAs, alkoholer, ketoner og aldehyder), eller komplekse ringstrukturer slik som kolesterol 12.. Det er åtte store klasser av lipider basert på struktur (FFA, glycerolipids [GL], glycerophospholipids [GP], sfingolipider [SP], sterol lipider [ST], prenol lipider [PR], saccharolipids [SL] og polyketider [PK]), som oppviser et bredt spekter av kjemiske egenskaper avhengig klasse 13. På grunn av den store variasjonen i de kjemiske egenskaper av lipidklasser, er direkte profilering uten forutgående derivatisering av lipidmolekyler ønsket. En emergent Fremgangsmåte i lipid forskning er tynnsjikt-kromatografi (TLC) kombinert med matriks-assistert laser desorpsjon / ionisering time-of-flight massespektrometri (MALDI-TOF MS) 14.
MALDI-TOF MS brukes mye i proteomikk forskning for å identifisere proteiner og knytte dem til konkrete aminosyresekvenser på grunn av de svært nøyaktige peptid ion mass "fingeravtrykk" generert fra trypsinlignende fordøyd proteiner 15. MALDI-TOF MS kan også brukes til å profilere andre biomolekyl klasser, inkludert lipider som TAGs 16-18. MALDI krever bruk av en matriks, typmatisk en organisk forbindelse som inneholder aromatiske og konjugerte dobbeltobligasjonsstrukturer. De matriks-molekyler tjener til forsiktig å overføre energien fra laseren til analyttene, fremme protonoverføring, og produserer enkeltvis ladede gassfase ioner 19-21. Ioner er utsatt for en høy spenning felt under høyvakuum og akselerert i en TOF masse analysator hvor ioner blir deretter separert ved forskjeller i hastigheter som er proporsjonale med deres masse-til-charge-forhold. Selv svært store biomolekyler kan ionisert med litt fragmentering, produsere enkeltvis ladede molekylære ion arter for forenklet spektrum analyse. Evnen til å analysere lipidmolekyler direkte uten forutgående derivatisering har fremmet klar adopsjon av MALDI-TOF MS i lipidomiske forskning 18.
Dette notatet presenterer en rutinemessig metode for å isolere og analysere integumentary lipider fra håret, talg sekreter og plagiopatagium av Eastern red bat (Lasiurus borealis). Dette brukes til å bestemme interspesifikk variasjoner i bat integumentary lipider å belyse sykdomsprosessen av White-Nose Syndrome (WNS) 22. WNS er en soppsykdom av flaggermus og er forårsaket av den nylig beskrevet psychrophilic arter Geomyces destructans 23-25. WNS har forårsaket dødsfallet til over 5 millioner nordamerikanske hule flaggermus og truer utryddelse av sårbare flaggermusarter, med mulige økonomiske konsekvenser av milliarder av dollar i skader på landbruksnæringen 26,27. For å undersøke trinnene i G. destructans infeksjon, ble lipider hentet fra hår og vinge vev av Eastern røde flaggermus og delt opp i brede lipidklassene av TLC å isolere TAG brøkdel for påfølgende analyse av MALDI-TOF MS. Kodene inneholder korte acylkjedene og er lett oppdages av MALDI-TOF MS med lite matriksinterferens.
Dette papir presenterer en enkel og robust fremgangsmåte for separering av brede lipidklasser isolert fra pattedyr integument ved preparativ TLC og bestemmelse Tags profiler ved MALDI-TOF MS, uten tidkrevende derivatisering av lipidmolekyler. De kritiske trinn i å produsere kvalitet spektra av koder med MALDI-TOF MS inkluderer: 1) Vellykket utvinning av forbindelsen med minimal forurensning eller oksidasjon, 2) Tilstrekkelig separasjon og isolasjon av kromatografi, og høy oppløsning 3) og masse nøyaktighet ved MALDI-TOF MS.
Dette papiret demonstrerer metoden ved å trekke ut og skille den nøytrale lipidfraksjonen fra plagiopatagium av Eastern rød balltre for å få Tags MS profiler. Mens denne studien brukte en flaggermusarter (Mammalia: Chiroptera) disse metodene kan bli utvidet til å studere integumentary lipider av noen pattedyrarter. Bat integument kjennetegnes ved å være overveiende kolesterol, med lavere mengder av koder, FFA, squaLene og sterol / voksestere. Sebum lipidforhold i flaggermus forskjellig fra mennesker ved at squalen er til stede i små mengder (i motsetning til opptil 16% hos mennesker), mens kolesterol inntreffer i større forholdstall (1 – 7% hos mennesker, men 26-62% i flaggermus) 22 , 31. Menneskelig hår inneholder ca 3% koder, mens forholdstall opptil 28% er funnet i Øst rødt balltre hår. Utvinning av lipid prøver fra flaggermus er lik for andre arter. Mens det i denne studien bomullsdotter dynket i oppløsningsmiddel benyttes for å fjerne talg, kan man også invertere en ampulle eller prøverør inneholdende oppløsningsmiddel på overflaten av de integument flere ganger. Specialized tape produkter også gi alternative metoder for å trekke ut overflatelipider 32. En viktig del av et riktig lipid ekstraksjon, er å minimalisere forurensning fra hudfett. Dette gjør du enkelt ved å holde en klemme flaske med metanol og sprøyting glass og kjøkkenutstyr, tørke kasseroller med en vev mellom alle prøvene og iført undersøkelseshansker. Oksidasjon of flerumettede acyls forhindres ved tilsetning av BHT, og det bør brukes uavhengig av temperaturen prøvene lagres ved.
Biomolekyl analyse krever vanligvis et kromatografisk trinn å separere molekyler av interesse fra forurensninger. TLC brukes i denne fremgangsmåte, noe som unngår instrumenterings krav til gass-eller væske-kromatografi, og krever mindre teknisk erfaring for å oppnå robust og repeterbare resultater. Avhengig av lipid-klasse av interesse, kan mange forskjellige mobile faser innarbeides. Videre kan bruk av HPTLC-plater og scanning densitometry brukes for å oppnå kvantitative resultater. Mens de variantene av TLC metoder er altfor mange til å liste her, noen vanlige mobilfaser som brukes i lipid TLC inkluderer kloroform: metanol: vann for separasjon av fosfolipider og glykolipider eller isooktan: ethylether for separering av ikke-polare lipider 28. I forhold til å skille tagger fra andre lipid klasser, H: E: En sliklvent systemet fungerer konsekvent og gir sammenlignbare resultater.
En annen fordel ved bruk av TLC, er at båndene av interesse kan bli raskt profilert ved hjelp av MALDI-TOF MS uten forutgående derivatisering av analyttene. I denne studien var silisiumdioksyd fjernes fra TLC-plate, og analytten elueres fra det ved sonikering i et løsningsmiddel og etterfølgende sentrifugering for å separere adsorbenten og inndampning av eluerende løsningsmiddel. Alternativt kan matrisen bli anvendt direkte på analysebånd separert på TLC-plater og deretter direkte analysert ved MALDI-TOF MS 33. Vellykket profilering av MALDI-TOF MS er avhengig av tilstrekkelig prøveopparbeidelse og operatørens ferdigheter med tuning og kalibrering av instrumentet. Instrumentet bør kalibreres daglig med standarder som dekker molekylvekt område som tilsvarer molekyler av interesse. Den passende følsomhet og oppløsning (f.eks ≥ 10 000) av utstyret bør også confirmeD daglig med ACTH.
Talg lipide bestanddeler som finnes på overflaten av pattedyr integument kan spille en rolle i kolonisering av bakterielle / sopp-patogener. Derfor kunnskap om den kjemiske sammensetningen mellom arter og individer kan gi hint om prosesser av menneskelige og dyreliv sykdommer. Intraspecific forskjeller mellom syke og friske personer kan representere kliniske tegn som hjelpemiddel i sykdom deteksjon og diagnose. Videre, hvis spesifikke forbindelser som hemmer vekst av mikroorganismer er til stede, disse kan identifiseres for bruk i sykdommer behandling og forebygging.
The authors have nothing to disclose.
Assistanse ble gitt av Scott Treece, Katelyn Arter, Jeremy Ragsdell, Tony Lamark James, Amy Fischer, Hannah Blair, og Cheyenne Gerdes under utviklingen av laboratoriemetoder. Vi vil gjerne takke Medina-Bolivar Laboratory (Luis H. Nopo-Olazábal, Arkansas Biosciences Institute) for å få hjelp med TLC skanning densitometry. MALDI-TOF MS brukes til dette prosjektet ble gitt gjennom NSF EPSCoR, RII: Arkansas ASSET Initiative P3 Center (EPS-0701890) i Arkansas Biosciences Institute. Finansieringen ble gitt av en amerikansk Fiskeri og Wildlife Service / Arkansas State Wildlife Grant, National Grotteforbund, og Senter for nordamerikanske Bat Forskning og konservering ved Indiana State University.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Butylated Hydroxytoluene | MP Biomedicals, LLC | 101162 | www.mpbio.com |
TLC Flexible Plates | Whatman | 4410-222 | www.whatman.com |
ACTH | Sigma-Aldrich Chem. Co. | A8346-5X1VL | www.sigmaaldrich.com |
Triolein | Sigma-Aldrich Chem. Co. | 44895-U | |
TLC Lipid Standard | TLC 18-1 | www.nu-chekprep.com | |
MALDI TAG Standard | Nu-Check Prep., Inc. | NIH Code 53B | |
MALDI TAG Standard | Sigma-Aldrich Chem. Co. | 17810-1AMP-S | |
Glass Vials with Teflon Cap | U.S. National Scientific Co. | B7800-2 | www.nationalscientific.com/ |
DHB | Sigma-Aldrich Chem. Co. | 50862-1G-F | |
CHCA | Sigma-Aldrich Chem. Co. | C8982-10X10 mg | |
Sebutape | CuDerm | S100 |