Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

إعداد الخلايا العصبية الأولية للتصور neurites التي في دولة مجمدة رطب عن طريق التصوير المقطعي البرد الإلكترون

Published: February 12, 2014 doi: 10.3791/50783
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 2, 3, 4
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, Baylor College of Medicine, 2Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine, 3Department of Neuroscience, University of California at San Diego, 4National Center for Macromolecular Imaging, Verna and Marrs McLean Department of Biochemistry and Molecular Biology, Baylor College of Medicine

Summary

للحفاظ على العمليات العصبية لتحليل التركيبية، ونحن تصف بروتوكول للتصفيح من الخلايا العصبية في المقام الأول على شبكات المجهر الإلكتروني تليها فلاش تجميد، مما أسفر عن عينات معلقة في طبقة من الجليد الزجاجي. يمكن فحص هذه العينات باستخدام المجهر البرد الإلكترون لتصور هياكل على مقياس متناهي الصغر.

Abstract

neurites التي، على حد سواء التشعبات والمحاوير، هي العمليات الخلوية العصبية التي تمكن من توصيل النبضات الكهربائية بين الخلايا العصبية. تحديد هيكل neurites التي أمر بالغ الأهمية لفهم كيفية نقل هذه المواد والعمليات التي تدعم إشارات الاتصالات متشابك. المجهر الإلكتروني (EM) وقد استخدمت تقليديا لتقييم ميزات التركيبية داخل neurites التي، إلا أن التعرض للمذيبات العضوية خلال الجفاف والراتنج التضمين يمكن أن تشوه الهياكل. هدف غير الملباة المهم هو صياغة الإجراءات التي تسمح للتقييمات الهيكلية لا تتأثر هذه القطع الأثرية. هنا، وضعنا بروتوكولا مفصلة وقابلة للتكرار لزراعة وتجميد فلاش neurites التي كاملة من الخلايا العصبية الأولية المختلفة على شبكات المجهر الإلكتروني تليها الفحص مع التصوير المقطعي البرد الإلكترون (البرد ET). هذا الأسلوب يسمح لل3-D التصور، neurites التي رطب مجمدة في القرار نانومتر، وتسهيل ASSEssment خلافاتها الشكلية. بروتوكول لدينا تعطي نظرة غير مسبوقة من الظهرية جذر عقدة (DRG) neurites التي، وتصور neurites التي الحصين في حالتها شبه الأم. على هذا النحو، وهذه الأساليب إنشاء مؤسسة للدراسات المستقبلية على neurites التي كل من الخلايا العصبية الطبيعية وتلك التي تأثرت الاضطرابات العصبية.

Introduction

الخلايا العصبية إنشاء مجمع الدوائر الأساسية لوظيفة الجهاز العصبي المركزي والمحيطي من خلال وضع التشعبات لتلقي المعلومات والمحاور، وغالبا ما تستغرق وقتا طويلا، وعلى التواصل مع الخلايا العصبية المصب. ثمرة neurite يلعب دورا أساسيا أثناء التطور الجنيني وتمايز الخلايا العصبية وصيانة neurites التي تدعم بشكل حاسم وظيفة الجهاز العصبي. عمليات التهاب الأعصاب أيضا ميزة بالغة في إصابة الخلايا العصبية والتجديد، فضلا عن اضطرابات الجهاز العصبي. دراسة الهندسة المعمارية العصبية أمر حاسم لفهم كل من المخ المعتادة والمريضة. لحسن الحظ، توجد نظم زراعة الخلايا العصبية ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية التي يمكن أن ألخص الهياكل الخلوية المعقدة وغير المتجانسة. استنادا إلى توضيح من المنصات التجريبية الصلبة والاستراتيجيات الفعالة التي تمكن التصور التحليلات الكمية والنوعية من مورفولوجيا الخلايا العصبية وهناك حاجة. سيكون مفيدا بشكل خاصتكون منهجية التفصيلية التي توفر منصة متسقة لتصور neurites التي، على حد سواء محاور عصبية والتشعبات على مقياس متناهي الصغر.

يتطلب المجهر الإلكتروني التقليدية استخدام المذيبات العضوية خلال الجفاف والراتنج التضمين، والتي يمكن أن تحدث تشوهات في عينات من الدولة الحقيقية. حتى الآن، وتستند معظم الأوصاف الهيكلية في مقياس متناهي الصغر على خلايا أكبر أو الأنسجة التي تتعرض لمثل هذه المواد الكيميائية القاسية - مما يحد من تفسير النتائج 4،9،25. علاوة على ذلك، لاختراق شعاع الالكترون، مطلوب باجتزاء للكائنات أو نتوءات الخلوية واظهار سمك أكبر من 1 ميكرون 12. أخيرا، مقطوع أو المضروب نتائج الأنسجة في مجموعة من مجموعات البيانات شريحة محددة منفصلة، ​​مما يجعل مرهقة تعريف ميزة ممدود من neurites التي. حتى لالبرد EM، التي باجتزاء عينة مجمدة رطب هو ممكن، وطريقة يدخل ضغط artifيتصرف 1.

في السنوات الأخيرة، عرف الباحثون كيفية زراعة الخلايا العصبية قرن آمون مباشرة على شبكات EM ولهم في الايثان السائل بعد ذلك لتصور neurites التي تستخدم البرد ET 8،10،18،23 تجميد فلاش. ومع ذلك، مثل هذه الدراسات إما استخدام جهاز حسب الطلب 10،23، أو عدم التفاصيل حول الخطوة النشاف لتوليد ما يكفي من الجليد رقيقة زجاجي لرؤية الروتينية 8،18. على سبيل المثال، توصي دراسة واحدة استخدام 30-40 ثانية لالنشاف الشبكة EM 10، ومع ذلك، تم تحسين هذه القيمة ليست للاستخدام العام ولكن هي محددة لهذا الجهاز تجميد يغرق حسب الطلب. يمكن استخدام الجهاز حسب الطلب بدلا من المتاحة تجاريا واحدة للحفاظ على الرطوبة 17 قبل العينة لتجميد يغرق-تشكل عقبة للاستنساخ على نطاق واسع.

في حين أن هذه الدراسات قد تم الرائدة في تصور neurites التي كتبها البرد ET، اتخذنا خطوة أخرى لاستكشاف ا ف بplicability من البرد ET إلى مجموعة متنوعة من العينات العصبية (قرن آمون والظهرية العقدة الجذر الخلايا العصبية). بالإضافة إلى ذلك، ونحن نناقش كل الأمثل والأمثل النتائج، فضلا عن القطع الأثرية المحتملة التي يمكن للمرء أن تواجه باستخدام البرد ET لمثل هذه العينات.

أن تعريف تقنية مفصلة للحفاظ على وتصور neurites التي كله على مقياس متناهي الصغر في حالة شبه الأصلي تعزيز قدرة لمزيد من الباحثين لإجراء دراسات التركيبية. تحقيقا لهذه الغاية، ونحن تصف بروتوكول فعالة ومفصلة باستخدام المعدات المتاحة تجاريا لإعداد غير المثبتة، الخلايا العصبية غير ملوثين لتصور neurites التي. هذا هو خطوة أولى مهمة نحو تفاصيل التركيب الدقيق للneurites التي صحية ووضع الأساس لفهم ما هي موجودة في نماذج المرض الجهاز العصبي الاختلافات الهيكلية. منذ البرد ET يمكن حل غير المثبتة، وميزات محوار غير ملوثين في 3-D على مقياس متناهي الصغر، فإن الطريقة تجعل من الممكن أبدا أن يكون كماالصدارة لتعريف العمارة التهاب الأعصاب 12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد أطباق مع EM شبكات لطلاء الخلايا العصبية الابتدائية

  1. فحص سلامة من الكربون المخرمة على شبكات EM الذهب باستخدام مجهر الضوء في التكبير من 25X على الأقل. جعل متأكد من الثقوب الكربون هي> 98٪ سليمة.
  2. لتصفيح الخلايا العصبية الأولية، واستخدام الموقد بنسن للهب تعقيم شبكات EM وبالتزامن جعلها ماء. استخدام ملاقط لالتقاط الشبكة EM كتبها حافته، وليس منطقة الشبكية المركزية. تنبيه: لا تترك الموقد بنسن مضاءة دون مراقبة، وعدم استخدام قفازات أو ملاقط مع المكونات البلاستيكية أثناء تنفيذ هذه الخطوات:
    1. قبل إضاءة الموقد بنسن، تعيين تعديلات الهواء والغاز إلى موقف فتح الحد الأدنى.
    2. تضيء الموقد بنسن باستخدام الصوان المهاجم أو البوتان أخف وزنا.
    3. تعديل التعديلات الهواء والغاز لتحقيق ذلك، اللهب الأزرق الداخلية الصغيرة داخل طولا وأخف وزنا الأزرق / البنفسجي اللهب. غيض من اللهب الداخلي هو أهم جزء من اللهب. مقبض تحتنيث الموقد يضبط كمية من الغاز يدخل أنبوب الموقد، في حين أن سعر برميل الموقد يمكن أن تتحول إلى ضبط كمية الهواء التي تدخل الموقد. تحول في اتجاه عقارب الساعة التكيف الهواء يقلل من الهواء (مما أدى إلى اللهب الأرجواني) وعكس يزيد من الهواء (مما أدى إلى لهب أصفر).
    4. استخدام ملاقط معدنية (أي قطع من البلاستيك) لعقد الشبكة EM، تمريرها بسرعة من خلال الشعلة مرتين، التي تواجه الجانب الكربون تصل. سوف تظهر الجانب الكربون أكثر ماتي (أقل لامعة) ومع أكثر من لون رمادي من الجانب الآخر.
    5. ونقل على الفور الشبكة (الجانب الكربون متابعة) في وسط طبق من الزجاج السفلي وضعت داخل 10 سم من ناسخ بنسن. استخدام واحد لكل طبق الشبكة EM (الشكل 1). فقط استخدام الأطباق الزجاجية القاع التي presterilized، أي عن طريق أشعة جاما.
  3. استخدام المجهر الضوئي للتحقق من سلامة الشبكة (الثقوب الكربون سليمة)، في حين لا تزال تحتفظ الشبكة EM داخل الزجاج بوتطبق ام (لتجنب التلوث). عند تطبيق أي مادة على الشبكة أو أي شيء من شأنها أن تأتي في اتصال مع الخلايا العصبية، استخدم الإجراء معقمة ونصائح ماصة معقمة.
  4. في غطاء الثقافة الأنسجة باستخدام الإجراء العقيمة، وتطبيق 250 ميكرولتر من مادة الطلاء المناسب ببطء وبعناية إلى المنطقة المركزية من الزجاج طبق بيتري. تأكد يغطي مادة الطلاء المناسب الشبكة EM بأكمله.
    1. لالخلايا العصبية قرن آمون، استخدم بولي-L-يسين (PLL، 1 ملغ / مل) كمادة طلاء، أعد كما هو موضح سابقا 19. نلاحظ أن هناك حاجة إلى 250 ميكرولتر في الشبكة EM، لكل طبق، لذلك مقياس دفعة وفقا لذلك. لالعقدة الجذرية الظهرية (DRG) الخلايا العصبية، واستخدام خليط من البروتين هلامي يفرز من Engelbreth-هولم-سرب (الصحة والسلامة) خلايا فأر ساركوما (انظر الجدول المواد والكواشف) كمادة طلاء، وإعداد النحو التالي. نلاحظ أن هناك حاجة إلى 250 ميكرولتر في الشبكة EM، لكل طبق، لذلك مقياس دفعة وفقا لذلك.
      1. ذوبان الجليد زجاجة الأسهممن خليط من البروتين هلامي يفرز من Engelbreth-هولم-سرب (الصحة والسلامة) خلايا فأر ساركوما بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
      2. حفاظ على برودة الخليط البروتين هلامي يفرز من Engelbreth-هولم-سرب (الصحة والسلامة) خلايا فأر ساركوما، وجميع مكونات تستخدم في صنع الحل، أي من خلال ابقائها على الجليد.
      3. بينما على الجليد، وتمييع هذا الخليط البروتين هلامي في المتوسطة Neurobasal أن تسفر عن تخفيف 01:20 (أي تمييع 500 ميكرولتر من خليط من البروتين هلامي في 10 مل من Neurobasal).
      4. الفجوة المخفف هلامي خليط من البروتين في 1 مل مأخوذة، وتخزين على الفور أي مأخوذة إضافية في -20 درجة مئوية.
      5. تطبيق 250 ميكرولتر في الشبكة EM، لكل طبق، كما هو موضح في القسم 1.4.
  5. تغطية طبق بتري مع كبار واحتضان (إما مع PLL لعينات قرن آمون، أو مع خليط من البروتين هلامي لعينات DRG) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في نسيج الثقافة هود.
  6. ASPIتقييم جميع PLL (لعينات الحصين) أو خليط من البروتين هلامي (لعينات DRG) من الأطباق. للقيام بذلك، استخدم نظام الفراغ في نسيج الثقافة هود. استخدام غيض ماصة معقمة تعلق على أنبوب فراغ. تجنب الاتصال المباشر مع شبكة EM.
  7. استخدام ماصة الهواء التشريد قابل للتعديل لتطبيق بعناية 250 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمة (الفوسفات مخزنة المالحة) إلى شبكة EM في مجال الزجاج وسط كل طبق بيتري، مثل أن الشبكة EM مغطى بالكامل من قبل برنامج تلفزيوني. ثم، نضح في برنامج تلفزيوني من كل طبق. تكرار 3X.
  8. السماح للأطباق مع شبكات EM لتجف تحت غطاء الثقافة الأنسجة لمدة 15 دقيقة. تأكد من أنها جافة تماما عن طريق فحص تحت المجهر الضوء في غرفة زراعة الأنسجة. تأكد من عدم وجود فقاعات من الرطوبة في الشبكة. إذا كان الأمر كذلك، نضح بعناية بجانب الشبكة EM للقضاء على هذه الرطوبة الزائدة. وينبغي أن تستخدم الشبكة المغلفة على الفور لتصفيح الخلايا العصبية.

2. إعداد وررating الخلايا العصبية الابتدائية على شبكات EM

  1. لوحة الخلايا العصبية الأولية، تشريح الأولى، يعرض للتريبسين (باستخدام التربسين 2.5٪) ويسحن أن يفرق بين الحصين (أو الظهرية العقدة الجذرية لأجنة الفئران 18 يوما من العمر) في الخلايا الفردية، كما هو موضح سابقا 19.
    1. يسحن هو مصطلح شائع يستخدمه بيولوجيا عصبية لوصف كتل الانفصال من الخلايا في الخلايا الفردية، ولا سيما عن طريق استخدام ماصة الزجاج مع طرف مصقول النار. يتم تحقيق النتيجة التي كتبها بعناية وببطء الرسم والافراج عن الخلايا، صعودا وهبوطا، عدة مرات (~ 30) من خلال ماصة.
  2. اتبع الإجراءات المذكورة كما سبق للتشريح DRG والعزلة خلية 24، مع ملاحظة أن استخدام 0.25٪ التربسين (في HBSS) لعزل الخلايا العصبية DRG الفئران، بدلا من استخدام الإنزيمات اقترح (غراء، كولاجيناز / dispase) التي هي أكثر ملاءمة للماوس الخلايا العصبية DRG.
  3. حساب عدد الخلايا العصبية معزولة (أي باستخدام عدادة الكريات)واستخدام هذه القيمة لحساب حجم مناسب من الخلايا لتنطبق على كل طبق لتحقيق تركيز من 50،000 خلية / مل لكل طبق. وأقصى حجم لتقديم الطلبات هو 250 ميكرولتر. لاحظ أن هذا يملأ فقط منطقة وسط الزجاج، وليس الطبق بأكمله.
  4. احتضان الأطباق لمدة 30 دقيقة في حاضنة CO 2 عند 37 درجة مئوية. تسمح للخلايا للتعافي والالتزام.
  5. ببطء إضافة 1.5 مل من وسائل الإعلام تحسنت إلى كل طبق، مع الحرص على عدم تعكير صفو الشبكة EM. نوع من وسائل الإعلام يعتمد على نوع من الخلايا (قرن آمون أو DRG).
    1. إعداد وسائل الإعلام المناسبة لأي الخلايا العصبية الحصين 19 أو الخلايا العصبية الظهرية العقدة الجذر 24، وهو أن تكون درجة حرارة في حمام مائي 37 ° C قبل استخدامها. احتضان الأطباق بين عشية وضحاها في حاضنة CO 2.
    2. لالخلايا العصبية قرن آمون، وتغيير وسائل الإعلام في اليوم التالي. تغيير نصف وسائل الإعلام كل يومين فصاعدا لمدة 14 يوما. الحارة وسائل الإعلام في 37 ° C حمام الماء قبل استخدامها. لDRG الخلايا العصبية، في اليوم التالي تشريح / الطلاء، وإعداد مخزون جديدة من وسائل الإعلام مع وكيل المضادة للالإنقسامية (يوريدين و5'-الفلورية 2'-deoxyuridine) جعل محلول المخزون 10 ملي لكل منها، على حدة؛ استخدام النهائي تركيز من 10 ميكرومتر لكل منهما. إزالة نصف وسائل الإعلام DRG (875 ميكرولتر) وإضافة 875 ميكرولتر من وسائل الإعلام الجديدة مع وكيل المضادة للالإنقسامية.
      1. لDRG الخلايا العصبية، كل يومين في الأسبوع الأول، البديل تغيير وسائل الاعلام بين وسائل الإعلام المضادة للالإنقسامية وسائل الإعلام DRG القياسية. للأسبوع الثاني، تغيير سائل الإعلام DRG معيار كل يومين.

3. التزجيج الخلايا العصبية على شبكات EM

  1. إعداد المعدات وجميع المواد لتجميد وتخزين شبكات EM الذهب في درجة حرارة المبردة: جهاز التزجيج مع غرفة الرطوبة 17، ملاقط المتخصصة غرامة نقطة للآلة التزجيج، ملاقط نقطة مسطحة طويلة، ديوار (ق) من النيتروجين السائل (LN 2)، جحاوية oolant، EM الشبكة مربع التخزين، ورقة الترشيح خالية من الكالسيوم.
  2. بدء تشغيل الجهاز التزجيج. تعيين الرطوبة إلى 100٪ ودرجة الحرارة إلى 32 درجة مئوية. في المقطع "وحدة التحكم"، ضبط الوقت وصمة عار لصفر ثانية. وهذا يسمح للدليل النشاف من خلال الجانب نافذة غرفة الرطوبة آلة التزجيج لل.
  3. التعامل مع ورقة الترشيح خالية من الكالسيوم مع القفازات، وطبقات منهم بحيث ثلاث ورقات مكدسة. قطع مكدس في 0.5 سم شرائح واسعة التي هي ~ 2 سم طويلة. ينحني لهم في زاوية 90 درجة بحيث جانب واحد من الورق لديها 0.5 سم × 0.5 سم الوجه (الشكل 2). باستخدام الملقط، وإزالة ورقة المتوسطة ووضعه على ورق الترشيح خالية من الكالسيوم أخرى حتى الاستخدام.
  4. وضع زر تخزين الشبكة في حامل زر داخل غرفة التزجيج. ملء الغرفة الداخلية للحاوية سائل التبريد بالنتروجين السائل وانتظر حتى التبخر كاملة. ملء الغرفة الخارجي من اله المبرد الحاويات مع النيتروجين السائل حتى يبلغ درجة حرارة ثابتة للمضي قدما إلى الخطوة التالية. ملء الغرفة الداخلية مع عالية النقاء الإيثان الغازية التي سوف تتكثف إلى حالة سائلة داخل غرفة تبريد.
  5. تحريك الطبق (عناوين) من الحاضنة إلى 100 مم طبق كبير البوليسترين لنقلها إلى غرفة التزجيج، إن لم يكن في المنطقة المجاورة مباشرة. استخدام ملاقط التزجيج المتخصصة لاختيار بعناية الشبكة EM من الطبق. ملاحظة أي جانب الخلايا العصبية تنمو على الشبكة EM؛ فإن موقف يهم لاتخاذ الخطوة التالية. استخدام قفل الانزلاق سوداء على ملاقط لقفل آمن ملاقط على الشبكة EM.
  6. إدراج ملاقط في الجهاز التزجيج مثل هذا الجانب من الشبكة EM التي يتم الالتزام الخلايا العصبية وجوه إلى اليسار، بعيدا عن حفرة جانبية افتتاح آلة التزجيج. التراجع عن ملاقط المتخصصة في آلة التزجيج.
  7. وضع الحاوية في المبرد صاحب المناسبةآلة التزجيج. يجب ملأها LN كافية (2) والإيثان السائل. باستخدام الأمر الشاشة المناسبة للآلة التزجيج، ورفع غرفة التبريد التصاعدي حتى يتم مسح مع الجزء السفلي من غرفة الرطوبة.
  8. مع ملاقط نقطة مسطحة، فهم حافة واحدة من ورقة الترشيح على ان يكون الجانب أقصر (0.5 سم × 0.5 سم الوجه) هو عمودي على ملاقط. وهذا الوجه تتلامس مباشرة مع الشبكة EM لالنشاف (الشكل 2B). إدراج بعناية ورقة الترشيح الى جانب حفرة من غرفة الرطوبة آلة التزجيج في (الشكل 2A). عقد ثابت ورقة ضد الشبكة EM (التي تواجه الجانب بعيدا عن العينة) لمدة 10 ثانية. تجاهل الورقة بعد ذلك وعلى الفور يغرق-تجميد العينة في الإيثان السائل باستخدام الأتمتة آلة التزجيج لل.
  9. نقل بعناية لديك شبكة EM-المجمدة رطب إلى واحدة من فتحات في واحدة منأزرار تخزين الشبكة. كرر العملية لشبكات إضافية EM في الأطباق. يمكن للأزرار التخزين الشبكة EM المستخدمة في هذه التجارب تخزين متعددة شبكات EM-المجمدة رطب.

4. جمع الصورة، تجهيز، والشرح

  1. الشروع في جمع 2-D الميكروسكوب الالكتروني و / أو 3-D الميل سلسلة 5 من neurites التي باستخدام المجهر البرد الإلكترون تحت شرط جرعة منخفضة. كان القصد من الصور 2-D لتقييم جودة الشبكة من حيث سماكة الجليد والمجالات التي يمكن أن تكون مفيدة لمدة 3-D سلسلة الميل.
    1. في هذه الحالة، تم جمع كافة الصور باستخدام كاميرا CCD 4K X 4K تعلق على المجهر 200 كيلو فولت الإلكترون مجهزة حامل الميل السائل النيتروجين بالتبريد نقل واحدة، في 20K المجهر التكبير على هدف underfocus من 7 ميكرون وأخذ العينات من 4.4 Å / بكسل.
    2. للحصول على صورة مقطعية 3D من العينة، واتخاذ سلسلة من الصور الإسقاط في حين يميل تدريجيا العينة آلأونج محور واحد من المجهر الإلكتروني النافذ (TEM). نظرا لزوايا الميل وإعدادات تجريبية أخرى، هناك العديد من البرمجيات المختلفة المتاحة لجمع تلقائيا سلسلة الميل 5. تم جمع سلسلة الميل 3-D المعروضة هنا على نفس المجهر باستخدام شبه الآلي برنامج الحصول على سلسلة الميل 26 على مجموعة من -60 ° إلى 60 ° في 5 ° الزيادات مع جرعة تراكمية من ~ 60 ه / 2.
  2. إعادة بناء سلسلة من الميل neurites التي تستخدم برامج معالجة الصور 21 كما هو موضح سابقا لعينات أخرى 5،29.
  3. لون الحواشي الميزات 3-D من neurites التي كتبها بتجزئة أولا مقطعية وخلق نموذج السطح باستخدام 3-D برامج معالجة الصور كما هو موضح سابقا 5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

قبل تجميد والتصوير عبر البرد ET، ينبغي أن تؤخذ صور المجهر الضوئي من الشبكة EM على الخلايا العصبية التي تنمو. وينبغي أن تكون واضحة للعيان neurites التي دون تداخل كبير مع بعضها البعض. مربع الملونة في الشكل 3A يمثل المنطقة التي يتم التكبير في لإظهار التكبير العالي في الشكل 3B، الذي neurites التي تمتد عبر التشبيك من الشبكة. وتتكون كل شبكة مربع من فيلم الكربون المخرمة التي تدعم الخلايا العصبية وneurites التي بهم. هذه الثقوب واضحة في جرعة منخفضة من البرد EM الصورة التي اتخذت في 4K التكبير، مما يدل على الجسم الخلايا العصبية كما الظلام، كائن كبير نسبيا، الإلكترون الكثيفة (الشكل 3C)، والتي من neurites التي المشروع إلى الخارج.

يتم اختيار جزء من محوار يستريح فوق حفرة في الكربون في مربع ملون في الشكل 3C، وأسرع في في التكبير العالي (20K) في الشكل 3D. في هذا التكبير، ينبغي الهياكل الخلوية الداخلية واضحة بما في ذلك الأنابيب الدقيقة، حويصلات، والميتوكوندريا يكون واضحا بشكل واضح (الشكل 3D)، ولا سيما في الجليد رقيقة بالشكل الأمثل كما تم إنشاؤه باتباع هذا البروتوكول. هياكل سوداء مظلمة في وسط الصورة (الشكل 3D) هي جسيمات الجليد سداسية التي تعتبر التلوث ويجب تجنبها عادة، ولكن نظرا لأنها هي ضئيلة جدا وخارج neurites التي أنفسهم، فإنها لا تتداخل مع إعادة الإعمار والألوان الشرح من الهياكل الداخلية للتحليل والتفسير (الشكل 4). ويرد جرعة منخفضة، وانخفاض صورة أخرى التكبير في الشكل 5، والتي من محوار يمكن أن يكون موجودا، وبعد ذلك عدة صور 2-D يمكن اتخاذها ومخيط رقميا معا باستخدام برامج معالجة الصور لتوليد المونتاج (الشكل 6).

الأوليتركيز منخفض الطلاء (50،000 خلية / مل لكل لوحة) من الخلايا العصبية على شبكات EM يسمح للخلايا العصبية التي يتم متباعدة بعيدا بعيدا بما فيه الكفاية لضمان التصور واضحة من neurites التي لها (الشكل 3C)؛ تركيزات أعلى من الموصى بها (> 50،000 خلية / مل لكل لوحة ) يمكن أن يؤدي إلى الصور دون المستوى الأمثل من neurites التي المزدحمة التي يصعب تتبع السمة أو المكونات الخلوية (أرقام 7B و7C).

الشكل 1
الشكل 1. خطة لزراعة الخلايا العصبية على شبكات EM داخل الأطباق الزجاجية القاع. (A) وترد أطباق الزجاج السفلي، مملوءة جزئيا مع وسائل الاعلام الخلية (الوردي). (B) يحتوي كل طبق واحد الشبكة EM الذهب، كما يكشف عن وجهة نظر أقرب. (C) طلاء من Eويرد M الشبكة مع بولي يسين كما رسم كاريكاتوري الجانبية كوتاواي. يتكون الطبق أسفل الزجاج من الزجاج ساترة مربع التي يتم تركيبها في الجزء السفلي من صحن الثقافة البلاستيكية، وتغطي فتحة دائرية التي قطعت أصلا للخروج من القاع. هذه الأطباق أسفل الزجاج هي جاما تعقيمها وتجاريا كما اشترى ولم يضف. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

الرقم 2
الشكل 2. التخطيطي لالنشاف دليل EM شبكات الخلايا العصبية مع الالتزام. (A) عن قرب من انزلاق فتحة دخول آلة التزجيج في (السهم الأسود) إلى الرطوبة / النشاف الغرفة، التي سيتم إدراجها ملاقط لطخة العينة يدويا. (B)مخطط الكرتون تبين كيف ينبغي التعامل مع ورقة الترشيح خالية من الكالسيوم (0.5 سم × 0.5 سم الوجه) باستخدام ملاقط نقطة مسطحة وإدراجها من خلال فتحة دخول غرفة الرطوبة من الجهاز التزجيج للالنشاف الشبكة EM الذي الخلايا العصبية وانضمت (قطرة من وسائل الإعلام خلية الوردي معروضة). يقام الشبكة EM كتبها ملاقط غرامة نقطة المتخصصة داخل غرفة الرطوبة. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

الرقم 3
الرقم 3. تصور، الخلايا العصبية رطب مجمدة على الذهب المجهر الإلكتروني (EM) شبكات (أ) صورة المجهر الخفيفة في 10X التكبير من المنطقة الوسطى من الشبكة EM التي كانت الخلايا العصبية الفئران الأولية غروالجناح لمدة 2 اسابيع. (ب) تم تكبيره في ضوء مربع أكوا هو مبين في (A)، الذي الخلايا العصبية والتوقعات محوار هم مرئية (السهام الوردي). (C) الكترون مجهرية في 4K التكبير من محوار إسقاط الخارج من الجسم الخلايا العصبية (السهم الأحمر). يتوافق تخطيطي لمنطقة (أي مربع أحمر) ضمن واحدة من الساحات الشبكة هو مبين في (B). وينظر الصندوق الأزرق عن قرب في (D)، حيث الميزات الداخلية للمحوار هي واضحة للعيان في 20K التكبير (الأخضر السهم الميتوكوندريا؛ ميكروتثبول السهم البرتقالي؛ حويصلة السهم الأزرق). اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

الرقم 4
الشكل 4. إعادة الإعمار 3-D والشرح من الفئران DRG محوار مقطعية. (A) شريحة المقطعي من كومة بناؤها من الصور التي اتخذت في زوايا الميل مختلفة من واحد محوار DRG. (B) الموافق 3-D الشرح من نفس محور عصبي. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

الرقم 5
الرقم 5. 2-D صورة البرد EM من الخلايا العصبية DRG الفئران (يسار الوسط) مع التوقعات محور عصبي (مربع أحمر) في 4K التكبير. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

الرقم 6 الرقم 6. المونتاج من أربعة 2-D الصور البرد EM من واحد محوار DRG الفئران. اتخذ كل صورة في 20K التكبير. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

الرقم 7
الرقم 7. الصور 2-D البرد EM من neurites التي (أ) A محوار DRG الفئران تصويرها في أقرب القرب من سوما الخلية. (B، C) أمثلة على الإفراط في الزحام من neurites التي بسبب ارتفاع تركيز الطلاء من الخلايا العصبية على شبكات EM. كانت كل neurites التي فلاش المجمدة أسبوعين بعد الطلاء على شبكات EM الذهب. وقد اتخذت جميع الصور في 20K؛ التكبير اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

الرقم 8
الرقم 8. إعادة الإعمار 3-D والشرح من قرن آمون الفئران محوار مقطعية. (A) شريحة المقطعي من كومة بناؤها من الصور التي اتخذت في زوايا الميل مختلفة من واحد محوار الحصين. (B) الموافق 3-D الشرح من نفس محوار. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وتبين لنا أن الفئران الخلايا العصبية الجنينية (العقدة الجذرية الظهرية وقرن آمون) يمكن زراعتها على الذهب المجهر الإلكتروني (EM) شبكات ومجمدة في الجليد الزجاجي رقيقة بما يكفي لneurites التي ليمكن تصوير باستخدام 2-D البرد EM و 3-D البرد ET. في حين سبق تصويرها neurites التي الحصين باستخدام البرد ET 8،10،18،23، مفصل بروتوكول كافية للنسخ المتماثل ناجحة باستخدام الأجهزة المتوفرة تجاريا كان مفتقدا. وعلاوة على ذلك، في حين أبحاثهم رائدة في استخدام البرد ET لتصور neurites التي الحصين، دراساتنا استكشاف مدى انطباق البرد ET لأكثر من نوع واحد من عينة الخلايا العصبية.

هنا، نحن تصف بروتوكول مفصلة إعداد EM شبكات مع أي الحصين والظهرية جذر عقدة (DRG) الخلايا العصبية، النشاف لهم لتحقيق الجليد الرقيق على النحو الأمثل، ومنهم للتصوير بواسطة البرد ET تجميد يغرق. الوقت الأمثل النشاف واحد هو الذي لا يؤدي في الجليد السميك جدا لشعاع الالكترون لاختراق،ولا رقيقة جدا أن الجليد الزجاجي يظهر مع التدرج أبرزها مختلفة من حافة الكربون المخرمة إلى الأعمق من الكربون المخرمة. علاوة على ذلك، تحقيق الجليد الرقيق على النحو الأمثل من خلال استخدام آلة التزجيج 17 مايو يكون مختلفا بعض الشيء عن كل مشروع، وتجميد قوية باستخدام آلة التزجيج يتطلب منحنى التعلم.

في حين ركزت الأبحاث السابقة على الخلايا العصبية قرن آمون، وأيضا استكشاف هنا في دراستنا، ونحن قد ذهب إلى إظهار مزيد من الصور على مقياس متناهي الصغر من سليمة، والمحاور كلها مجمدة رطب من العقدة الجذرية الظهرية (DRG)، أبدا تصويرها قبل استخدام البرد EM أو البرد ET. وقد تم اختيار الخلايا DRG لأنها (على النقيض من الخلايا العصبية قرن آمون) تؤدي إلى محاور 34 حصرا. بروتوكول لتصوير لهم من قبل cryo-EM/cryo-ET يمكن أن تكون مفيدة للمهتمين التركيب الدقيق للاستدلال محور عصبي أي في الخلايا العصبية الحسية. نحن أيضا الحاضر ومناقشة نتائج كلا الأمثل والأمثل، فضلاكما القطع الأثرية المحتملة التي يمكن للمرء أن تواجه باستخدام البرد ET لمثل هذه العينات.

في تركيز الخلايا السليمة (50،000 خلية / مل لكل طبق)، والمباعدة بين الخلايا العصبية هو أن هذه neurites التي تسمح للوصول ممتازة باستخدام الضوء والمجهر الإلكتروني (أرقام 3A 3B و) مع واحد أو اثنين من الخلايا العصبية التي تظهر في شبكة مربع (الشكل 3B) . السماح يكفي الفصل بين الخلايا العصبية هو ضروري لرؤية واضحة من neurites التي عبر البرد EM (أرقام 3C و 3D). ويدعم الخلايا العصبية وneurites التي على فيلم الكربون المخرمة من الشبكة الذهب، كما رأينا بوضوح في الصور البرد EM (أرقام 3C و 3D). الهيئات الخلايا العصبية، والتي يمكن أن تختلف من 15-50 ميكرومتر ~ لالخلايا العصبية قرن آمون والعقدة الجذرية الظهرية (DRG) الخلايا العصبية 30،33 سميكة جدا للتصوير باستخدام البرد EM وتظهر سوداء تماما، كما هو الحال بالنسبة للتريها الكائنات الإلكترون كثيفة وسميكة العينات، بالمقارنة مع التوقعات أرق نسبيا من neurites التي (لا تزيد عن 1 ميكرون في القطر) يشع منها (أرقام 3C و 5).

3-D أنسجة المخ جزءا لا يتجزأ من الراتنج لا تكشف neurites التي التي هي دائرية تماما في المقطع العرضي 14، في الواقع، التشكل هو متغير. وبالتالي من غير المعروف ما إذا كان شكل noncircular من neurites التي من الطبيعي أو مستحضر قطعة أثرية العينة. سمك يقاس من محور عصبي DRG (الشكل 4) نمت على الشبكة TEM، نشف وتصويرها كما هو مبين في هذه الدراسة كان 0.32 ميكرومتر في اتجاه زي (في عمق الجليد الزجاجي) ومتوسط ​​عرضها 0.53 ميكرومتر في الطائرة س ص. سمك يقاس من محوار الحصين (الشكل 8) نمت على الشبكة TEM، نشف وتصويرها كما هو مبين في هذه الدراسة كان 0.50 ميكرومتر في اتجاه زي (في عمق الجليد الزجاجي) ومتوسط ​​0.72 ميكرومتر في الطائرة س ص. عملية النشاف كما هو موضح في هذه الوثيقة يمكن أن تتسطح neurites التي على الرغم من أنها لا تزال رطبة في المخزن الأصلية خلال العملية برمتها من النشاف وعملية تجميد يغرق.

لا يظهر تسطيح طفيف من neurites التي على الشبكة كما لوحظ من قبل cryoET أن تؤثر على بنية مكونات الداخلية مثل الحويصلات كما هو مبين في هذه الوثيقة، والتي هي تماما تقريبا دائرية وتظهر أي علامات الجفاف. على النقيض من ذلك، فإن العمليات الكيميائية التي يشيع استخدامها في الاستعدادات EM 'التقليدية'، وخاصة تثبيت الكيميائية مع غلوتارالدهيد بارافورمالدهيد وتليها الجفاف في الإيثانول، يؤدي إلى انكماش الأنسجة غير المنضبط. يتم التخلص من إمكانات مواجهة مثل هذا التأثير الخلوية الضارة في طريقة نقدم لcryoET في مخطوطة لدينا.

علاوة على ذلك، لدينا عينات neurites التي تم تجميدها على الفور يغرق في الإيثان السائل، مما أدى إلى طnstant 'التضمين' في الجليد الزجاجي. تظهر الأنسجة التي يتم تجميد في حالة زجاجي أكثر تشبه إلى حد كبير على الحالة الفسيولوجية من غيرها من التقنيات. مستوى التفاصيل التركيبية ليست الجانب الوحيد الذي يجعل هذه التقنية الموصوفة في البروتوكول أن يكون لدينا قيمة للباحثين الأعصاب. تقنية الخلايا العصبية المتزايدة على شبكات EM، النشاف فورا / للحفاظ عليها في حالة الزجاجي للفحص / التصوير بواسطة cryoET تجميد يغرق هو أسلوب جذاب لأنه يفتح إمكانية دراسة التركيب الدقيق للخلايا العصبية في إطار مختلف الوراثية أو الكيميائية أو البيئية ويؤكد دون القلق من التحف الجفاف المحتملة.

الشروط النشاف قبل التجميد، كما هو مفصل في هذا البروتوكول، ومهمة لتوليد ما يكفي من الجليد الرقيق لتصور من قبل البرد ET من الميزات التركيبية، بما في ذلك المكونات الداخلية مثل الميتوكوندريا، حويصلات والأنابيب الدقيقة (أرقام 4، 6، و7A). الميتوكوندريا، على سبيل المثال، يمكن تحديدها في تحضيراتنا لأنها تظهر مشابهة هيكليا ما كان ينظر في الخلايا (حواف الخلايا الليفية الماوس الجنينية) عن طريق التصوير المقطعي البرد الإلكترون 20. كما أنها تكشف أعراف، وهو ما يمكن ملاحظته في 3-D-المشروح لون الصور الموجودة في هذه المخطوطة. يمكن أن تنجم عن الصور الأمثل الجليد السميك الذي الصورة البرد EM يبدو مبهمة عموما، ومنع تحديد الناجح لميزات مثل الميتوكوندريا والأنابيب الدقيقة داخل محوار. وعدم وجود تفاصيل كافية لإعداد مثل هذه العينات، لا سيما فيما يتعلق بكيفية إنتاج الجليد الرقيق على النحو الأمثل، ساهم بالتأكيد إلى النجاح المحدود في تحديد التركيب الدقيق للneurites التي 8،10،17،23.

يمكن للصور الأمثل أيضا تنجم عن عدد كبير جدا من الخلايا العصبية الطلاء على الشبكة (> 50،000 خلية / مل لكل طبق)، والذي ينتج في اكتظاظ neurites التي (أرقام0؛ 7B و7C). قد تكون الصور ضبابية نتيجة ليزيل التباؤر غير صحيحة ويجب تعديلها؛ اتخذ يزيل التباؤر في الصور المعروضة هنا مع underfocus المستهدفة من 7 ميكرون. تم جمع الصور في ذلك يزيل التباؤر لضمان تباين أعلى وضوح ملامح التركيبية، ومع ذلك، يمكن أن تستخدم أيضا ليزيل التباؤر أقل (أي 2-3 ميكرون) للحصول على تفاصيل دقة أعلى من تلك الميزات.

ويمكن لعوامل أخرى تساهم في الصور دون المستوى الأمثل. على سبيل المثال، على الرغم من أنه قد يكون مغريا لاستخدام ميزات أخرى للآلة التزجيج، وخاصة ميزة النشاف شبه الآلي، بدلا من النشاف دليل الموصوفة هنا، وهذا أعطى نتائج غير مرغوب فيها. وقد حاول النشاف على الوجهين في البداية باستخدام هذه الميزة شبه الآلي، الذي آلة التزجيج (بدلا من المستخدم) البقع العينة مباشرة باستخدام البارامترات مثل النشاف الوقت وعدد من البقع على النحو المحدد من قبل المستخدم. ومع ذلك، AFمثل هذه العينات التصوير ثالثا، تبين أن جميع الخلايا العصبية هي lysed كان مفتوحا، وامتد من محتوياتها (الهيئات عديد الحويصلات، الخ). وبالتالي، يتم استخدام آلة التزجيج الأفضل في هذه الحالة لدرجات الحرارة يمكن السيطرة عليها الرطوبة في الغرفة التي نشف العينة قبل يغرق تجميد. الحفاظ على العينة في مثل هذه الحالة (مع الرطوبة تعيين ما يقرب من 100٪) يقلل من فقدان الماء أثناء إعداد ويساعد على ضمان الجليد الزجاجي الأمثل 3،7 تجميد آخر.

من الناحية المثالية، للحد من تعرض الخلايا العصبية للاضطرابات الخارجية، ينبغي أن تزرع في حاضنة CO 2 (درجة حرارة معينة إلى 37 درجة مئوية) على مقربة من الغرفة مع آلة التزجيج، ودرجة الحرارة لهذا الجهاز يجب تعيين ل 37 درجة مئوية قبل الخلايا العصبية على شبكات EM لتجميد فلاش. ينبغي للمرء تجنب تعريض الخلايا العصبية لتقلبات كبيرة في درجات الحرارة قبل النشاف. في هذا التقرير، تم تعيين درجة الحرارة إلى 32 درجة مئويةلأغراض النشاف؛ كانت تزرع الخلايا العصبية في مبنى مختلف ومرور الوقت من 10 دقيقة ~ وقعت بين تحمل لوحات من الخلايا العصبية من غرفة واحدة إلى أخرى. والحرص على حماية العينات في وعاء، شبه معزولة مقاومة للماء أثناء عملية النقل. تغيير مماثل في درجة الحرارة وثاني أكسيد الكربون 2 تركيز (كما حدث من قبل الخلايا العصبية قبل النشاف / يغرق تجميد) تحدث إلى الخلايا العصبية في كل أيام 2 ~ عندما تؤخذ الخلايا العصبية للخروج من غرفة الحضانة لوسائل الإعلام الخاصة إلى تغيير في إطار السلامة الأحيائية هود، ويتم ذلك عادة عن الثقافات العصبية. لا ينظر هذا أن يؤدي إلى آثار سامة على الخلايا.

وعن وجود ما يبدو أن حبيبات داخل الميتوكوندريا neurites التي 'الإلكترون الكثيفة، توجد عدة تقارير متضاربة. تم العثور على مثل هذه الحبيبات في مجموعة متنوعة من الأنسجة المختلفة، وليس الخلايا العصبية على وجه التحديد. وينظر على أنها بالوعة الكاتيونات التي تنظم الأيونية الداخلية ENvironment وللالحبيبات الخيطية. تظهر أيضا لإنشاء مواقع الاتصال بين الأغشية الداخلية والخارجية الميتوكوندريا التي يمكن أن تعمل بكفاءة الانزيمات 16.

الدراسات التجريبية تشير إلى أن الكالسيوم والكاتيونات ثنائي التكافؤ الأخرى تتراكم في الميتوكوندريا عندما تكون موجودة في الاستحمام السائل إما الميتوكوندريا المعزولة أو خلايا سليمة هذه الأيونات. يبدو من المرجح أن الأيونات وعضويا منضمة إلى حبيبات داخل الميتوكوندريا الموجودة من قبل. يقترح، بالتالي، أن هذه الحبيبات ترتبط تنظيم البيئة الداخلية للالأيونية الحبيبات الخيطية 31.

وعلاوة على ذلك، فإن الخلايا العصبية في إعداد لدينا مثقف على شبكات EM لمدة 14 يوما، توقيت الذي هو نموذجي لأغراض ثمرة neurite 15،36، قبل التصوير بواسطة cryoEM / ET. وقد أفيد أن هناك زيادة كبيرة في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا في الخلايا العصبية العمر بالمقارنة مع يون ز الخلايا العصبية 32. وبالتالي، فمن المعقول أن الميتوكوندريا في neurites التي تتراوح أعمارهم من هذه الخلايا العصبية من شأنه أن يعرض حبيبات الميتوكوندريا ليس بالضرورة علامة على التوتر، وإنما لأنها تمتلك حضورا أعلى من الكالسيوم داخل الخلايا.

كما تم الإبلاغ عن الإلكترون كثافة حبيبات الميتوكوندريا في الخلايا الليفية الماوس الجنينية المزروعة في الثقافة وتصويرها من قبل نفس التكنولوجيا (التصوير المقطعي البرد الإلكترون) كما هو مستخدم في مخطوطة لدينا 20. لم هذه الخلايا لا تظهر أنماط نموذجية من تغيير التركيبية المرتبطة إصابة الخلوية، مثل اختلال هيكل الخلية وتشكل الفجوات من السيتوبلازم. وبالمثل، في neurites التي لدينا كما تصور من قبل cryoET، ونحن لم نلاحظ الهيكل الخلوي تتعطل التي لولاها تترافق مع سمية الخلوية. بالنظر إلى الاعتبارات المذكورة أعلاه، فإننا نخلص إلى أن الخلايا العصبية في إعداد لدينا لم تظهر حبيبات الميتوكوندريا نتيجة الإجهاد أو سمية.

المحتويات "> لتعقيم سطح الشبكة EM لمنع التلوث إلى الخلايا العصبية، وأيضا لتوليد مواتية، سطح ماء على الشبكة EM التي يمكن للبولي-L-يسين الالتزام بها والمشتعلة شبكات EM قبل الطلاء الخلايا العصبية وجد ليكون من المفيد. لم يتم اختياره التعقيم بالأشعة فوق البنفسجية لأنه يتطلب التشعيع من الشبكة لفترة أطول (على سبيل المثال 20-30 دقيقة) في هود السلامة الأحيائية. ثم، سوف تحتاج شبكات ليعاد يتعرض مرة أخرى إلى البيئة عندما يجري توهج -تفريغها لأغراض hydrophilizing السطح في الشبكة. يتوهج أداء الشبكة يضمن أن لاحقة بولي يسين طلاء شأنه 'عصا' على نحو فعال إلى الشبكة. هذه التقنية من المشتعلة الشبكات هو مفيد لأنه يجمع بين كل خطوة hydrophilizing وخطوة التعقيم في واحدة. ومن المعروف الخلايا العصبية الابتدائية إلى أن تكون أكثر حساسية من خطوط الخلايا السرطانية والقائم على أنه أمر حاسم للحفاظ على بيئتهم (الشبكة، طبق بيتري) كما العقيمة ممكن.

> لتصور الميزات التي تمتد على طول طول محوار، فمن الأفضل أن تأخذ أول صورة التكبير أقل بسعر أقل جرعة الإلكترون (أرقام 3C و 5)، والتي تغطي أكثر من مجال الشبكة لأغراض اختيار الذي محوار إلى صورة . ثم، يمكن أن تؤخذ 2-D البرد EM الصور على فترات ومخيط رقميا معا في المونتاج (الشكل 6). قد تكون هذه التقنية مفيدة للميزات التركيبية، مثل منظمة أنيبيب، على مساحة أكبر من صورة واحدة البرد EM.

أخذ جرعة منخفضة، صور منخفضة التكبير (أرقام 3C و 5) مفيد أيضا في تحديد مناطق محوار التي تنسجم في قطر عبر فيلم الكربون المخرمة (سواء في الثقوب وعبر الكربون) وبالتالي أكثر مثالية للتصوير والتحليلات اللاحقة. وعادة ما ينظر إلى تضخيم من خلال الثقوب neurites التي من الفيلم الكربون في أكبر رجل أعمالخائبي (الشكل 5) مع المزيد من المواد الداخلية بشكل واضح من neurites التي أرق (الشكل 3C). ويعتقد أن هذه الظاهرة تحدث بسبب عدم وجود الدعم المادي في ثقوب الفيلم الكربون. عندما تتم إزالة الشبكة EM من الطبق الذي كانت تنمو الخلايا العصبية، وبعد ذلك نشف من المؤخر، neurites التي مع المزيد من كتلة الداخلية (الشكل 5) من غيرها (الشكل 3C) تميل إلى توسيع و / أو الترهل في الثقوب. على الرغم من هذا يبدو أن قطعة أثرية، ولها فائدة لتظهر بشكل أكثر وضوحا المكونات الداخلية للمحوار. باستخدام الكربون فيلم المستمر مضافين على هذا الفيلم الكربون المخرمة قد تساعد على التحايل على هذه المسألة في دراسات مستقبلية. وقد حاول هذا الإعداد في البداية ولكن نتج عنها الجليد زجاجي سميك جدا للتصوير. محاكمات لاحقة مع سمك مختلفة من الكربون المستمر مضافين على الشبكة EM قد تحتاج إلى مزيد من التحقيقات.

والمجمدةصالح تانت من الأسلوب الحالي هو أن التنظيم المكاني للمكونات الخلية داخل محوار يمكن تصور على مقياس متناهي الصغر من خلال اتخاذ عدة صور 2-D من محوار واحد في زوايا الميل المختلفة، وإعادة بناء هذا كومة من الصور في صورة مقطعية. ويمكن بعد ذلك أن السمات الهيكلية الفردية المشروح يدويا لكل شريحة 2-D من المكدس 3-D بألوان مختلفة باستخدام البرنامج المناسب (انظر الجدول المواد والكواشف) كما هو موضح لمحوار من الفئران E18 الظهرية العقدة الجذر (DRG) الخلايا العصبية (الشكل 4) ومحوار من الفئران E18 الخلايا العصبية قرن آمون (الشكل 8).

عن طريق اختيار لالتقاط صورة كل 5 درجات خلال سلسلة الميل، وبدلا من 1 أو 2 درجة مئوية، يتم جمع الصور ولكن أقل جرعة الإلكترون أعلى يمكن استخدامه في الصورة. هذه النتائج في تباين أعلى وأقل ضوضاء في الصور الخام. هذا هو أفضل لأغراض إعادة الإعمار (محاذاة بواسطة عبر علاقة واحدة الواحد الجيش الشعبي) واللاحقة الشرح مقطعية، والتي تتم عن طريق اليد لكل صورة مقطعية تضم مكدس في اتجاه زي. اختيار حجم الزيادة يعتمد أيضا على حجم العينة، وبين زوايا الميل المختلفة، وسوف لا تختلف العينات أكبر قدر. في هذه الحالة، وذلك باستخدام أكبر حجم الزيادة (5 °) وكان يعتقد أن تكون أكثر ملاءمة نظرا لحجم عينة كبيرة نسبيا من محوار.

علاوة على ذلك، مضيفا علامات إيمانية الذهب إلى الشبكة EM مساعدة لغرامة محاذاة الصورة اذا شئت. لم تستخدم علامات إيمانية لأن العينة كانت كبيرة نسبيا بالمقارنة مع غيرها من العينات البرد EM (الفيروسات أو البروتينات في عزلة) وأظهرت تباين عالية مع مجموعة متنوعة من الميزات الهيكلية التي يمكن استخدامها في المحاذاة الصحيحة من كل من الصور 2-D (تضم مكدس 3-D) من قبل عبر الارتباط. الصورة الناتجة مكدس كان الانحياز جيدا باستخدام هذا النهج، وصالحة للاستعمال لاحقا اللون 3-D الشرح.

الأنف والحنجرة "> للدراسات المستقبلية، وذلك باستخدام المجهر مع مرشح الطاقة يمكن أن تقلل من الضوضاء التي تسببها الإلكترونات متناثرة inelastically ولكن قد لا تكون هذه الميزة متوفرة في معظم المرافق المجهر الإلكتروني. الإجراء لدينا ما يكشف الصور يمكن أن تنجم عن مستوى 200 كيلو فولت المجهر مع عدم وجود مرشح الطاقة، والتي قد تكون أكثر شيوعا المتاحة للمجتمع علم الأعصاب ككل.

هو الأمثل لبروتوكول الموصوفة هنا لإعداد وتصور كل من الفئران الجنينية ومحاور DRG neurites التي الحصين باستخدام المعدات المتاحة تجاريا لالبرد EM والبرد ET. واحدة من المزايا الرئيسية لهذه التقنية هو أنه يعطي معلومات الهيكلية من neurites التي كلها، وليس مقطوع، المضروب أو المعالجة من قبل مختلف الكواشف الكيميائية من أجل عرض التركيب الدقيق الخاصة بهم. لقد أثبتنا كيف البرد ET هي طريقة ممتازة وخاصة للاستخدام في التحليلات التركيبية للخلايا العصبية في المستقبل في حالة مسافة قريبة لأصلي لدراسة تأثيرالأمراض العصبية محوار على هيكل.

الأرقام الانضمام الكترون بنك المعلومات المجهري للtomograms 3-D كما ورد في هذه الورقة هي كما يلي: للحصول على الفئران الحصين محوار كما هو موضح في الشكل 8 و في الفيديو الرئيسي (من 8:45 حتي 09:01)، وبنك المعلومات عدد الانضمام هو EMD-5887. لالفئران الظهرية جذر عقدة محوار كما هو مبين في الشكل 4 و في الفيديو الرئيسي (من 9:02 حتي 09:15)، وعدد انضمام بنك المعلومات هو EMD-5885.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

وقد تم دعم هذا البحث من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح (PN2EY016525 وP41GM103832). وأيد SHS من قبل الزمالة من برنامج تدريب الخريجين Nanobiology التخصصات من مركز WM كيك لتدريب التخصصات العلوم البيولوجية من اتحادات ساحل الخليج (NIH منحة رقم T32EB009379).

SHS تشريح، نما والمزجج DRG وخلايا قرن آمون؛ جمعها البرد EM والبيانات البرد ET من DRG ومحاور الحصين؛ بناؤها والمشروح لون سلسلة الميل. التجمع تشريح وقدمت خلايا قرن آمون في مختبر MNR ل. SC ساعدت في سلسلة الميل الشرح. تم تدريب SHS بواسطة CW حول كيفية تشريح وتنمو الخلايا العصبية. SHS، WCM ومرحاض تصور التجارب. أعد SHS المخطوطة مع مدخلات من مؤلفين آخرين.

تم تصوير هذا الفيديو في مركز التصوير الخلوية وNanoAnalytics (C-سينا) من Biozentrum رانه جامعة بازل. تم دمج C-سينا في إدارة النظم البيولوجية للعلوم والهندسة (D-BSSE) ETH زيورخ لل، وتقع في بازل، سويسرا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dumont #7 Tweezers Electron Microscopy Sciences 72803-01 For handling EM grids
Glass bottom dishes MatTek Corp. P35G-1.5-10C For growing sample
Electron microscopy grids Quantifoil Holey Carbon, Au 200, R 2/2 For growing sample
Calcium-free filter paper Whatman 1541-055 For blotting sample
Large flat point long tweezers Excelta Corporation E003-000590, 25-SA For blotting sample 
Vitrification device and tweezers FEI Vitrobot Mark III For freezing sample
Minigrid storage boxes Ted Pella, Inc. 160-40 For storing EM grids
Cryo transfer holder Gatan 626 Single Tilt Liquid Nitrogen Cryo Transfer Holder For imaging samples
Semiautomated tilt series acquisition software SerialEM http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ For imaging samples
Image processing software IMOD eTomo http://bio3d.colorado.edu/imod/ For image processing
Transmission electron microscope for cryoEM JEOL, Tokyo 200-kV JEM2100 LaB6 electron microscope For imaging samples
4k x 4k CCD camera Gatan N/A For imaging samples
3-D annotation software Visage Imaging GmbH Amira/Avizo For processing 3-D data
Software for digitally stitching 2-D images Adobe Adobe Photoshop For processing 2-D data
DMEM, High Glucose Invitrogen 11965-118 For hippocampal culture
Boric acid Sigma Aldrich B-0252 For hippocampal culture
Sodium tetraborate Sigma Aldrich B-9876 For hippocampal culture
Poly-L-lysine  Sigma Aldrich P2636-500MG For hippocampal culture
Filter system Corning 430758 For hippocampal culture
Neurobasal medium Invitrogen 21103-049 For DRG culture
B-27 supplement Invitrogen 17504-044 For DRG culture
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122 For DRG culture
GlutaMAX Invitrogen 35050-061 For DRG culture
Recombinant rat b-NGF R&D Systems 556-NG For DRG culture
Uridine Sigma U3003-5G For DRG culture
5'-Fluoro-2'-deoxyuridine Sigma F0503-100MG For DRG culture
Matrigel BD Biosciences 356234 For DRG culture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. EMBO J. 23, 3583-3588 (2004).
  2. Benzing, W. C., Mufson, E. J., Armstrong, D. M. Alzheimer's disease-like dystrophic neurites characteristically associated with senile plaques are not found within other neurodegenerative diseases unless amyloid beta-protein deposition is present. Brain Res. 606, 10-18 (1993).
  3. Binks, B. P. Modern characterization methods of surfactant systems. , Marcel Dekker. New York, New York, USA. (1999).
  4. Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr. Opin. Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
  5. Chen, S., et al. Electron cryotomography of bacterial cells. J. Vis. Exp. (39), e1943 (2010).
  6. DiFiglia, M., et al. Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions and dystrophic neurites in brain. Science. 277, 1990-1993 (1997).
  7. Dubochet, J., Chang, J. J., Freeman, R., Lepault, J., McDowall, A. W. Frozen aqueous suspensions. Ultramicroscopy. 10, 55-61 (1982).
  8. Fernández-Busnadiego, R., et al. Insights into the molecular organization of the neuron by cryo-electron tomography. J. Electron Microsc. 60, 137-148 (2011).
  9. Frey, T. G., Perkins, G. A., Ellisman, M. H. Electron tomography of membrane-bound cellular organelles. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 199-224 (2006).
  10. Garvalov, B. K., et al. Luminal particles within cellular microtubules. J. Cell. Biol. 174, 759-765 (2006).
  11. Grünewald, K., Cyrklaff, M. Structure of complex viruses and virus-infected cells by electron cryo tomography. Curr. Opin. Microbiol. 9, 437-442 (2006).
  12. Gu, J., Bourne, P. E. Structural bioinformatics. , Wiley-Blackwell. Hoboken, New Jersey, USA. (2009).
  13. De Hoop, M. J., Meyn, L., Dotti, C. G. Culturing hippocampal neurons and astrocytes from fetal rodent brain. Cell Biology: A Laboratory Handbook. 1, W.H. Freeman. New York, New York, USA. (1998).
  14. Denk, W., Horstmann, H. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Reconstruct Three-Dimensional Tissue Nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
  15. Fink, C. C., et al. Selective regulation of neurite extension and synapse formation by the beta but not the alpha isoform of CaMKII. Neuron. 39, 283-297 (2003).
  16. Jacob, W. A., et al. Mitochondrial matrix granules: their behavior during changing metabolic situations and their relationship to contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Microsc. Res. Tech. 27, 307-318 (1994).
  17. Jensen, G. J., Briegel, A. How electron cryotomography is opening a new window onto prokaryotic ultrastructure. Curr. Opin. Struct. Biol. 17, 260-267 (2007).
  18. Ibiricu, I., et al. Cryo Electron Tomography of Herpes Simplex Virus during Axonal Transport and Secondary Envelopment in Primary Neurons. PLoS Pathog. 7, e1002406 (2011).
  19. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  20. Koning, R. I., et al. Cryo electron tomography of vitrified fibroblasts: microtubule plus ends in situ. J. Struct. Biol. 161, 459-468 (2008).
  21. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).
  22. Lotharius, J., Brundin, P. Pathogenesis of Parkinson's disease: dopamine, vesicles and alpha-synuclein. Nat. Rev. Neurosci. 3, 932-942 (2002).
  23. Lucić, V., et al. Multiscale imaging of neurons grown in culture: from light microscopy to cryo-electron tomography. J. Struct. Biol. 160, 146 (2007).
  24. Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and. 2, 152-160 (2007).
  25. Marsh, B. J. Lessons from tomographic studies of the mammalian Golgi. Biochim. Biophys. Acta. 1744, 273-292 (2005).
  26. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J. Struct. Biol. 152, 36-51 (2005).
  27. Medalia, O., et al. Organization of actin networks in intact filopodia. Curr. Biol. 17, 79-84 (2007).
  28. Medalia, O., et al. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298, 1209-1213 (2002).
  29. Meyerson, J. R., et al. Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging. J. Vis. Exp. (58), e2770 (2011).
  30. Nakatomi, H., et al. Regeneration of Hippocampal Pyramidal Neurons after Ischemic Brain Injury by Recruitment of Endogenous Neural Progenitors. Cell. 110, 429-441 (2002).
  31. Peachey, L. D. Electron Microscopic Observations on the Accumulation of Divalent Cations in Intramitochondrial Granules. J. Cell. Biol. 20, 95-111 (1964).
  32. Raza, M., et al. Aging is associated with elevated intracellular calcium levels and altered calcium homeostatic mechanisms in hippocampal neurons. Neurosci. Lett. 418, 77-81 (2007).
  33. Scroggs, R. S., Fox, A. P. Calcium current variation between acutely isolated adult rat dorsal root ganglion neurons of different size. J. Physiol. 445, 639-658 (1992).
  34. Squire, L. R. Fundamental neuroscience. , Academic Press. Amsterdam; Boston. (2003).
  35. Sulzer, D. Multiple hit hypotheses for dopamine neuron loss in Parkinson's disease. Trends Neurosci. 30, 244-250 (2007).
  36. Tapia, J. C., et al. Early expression of glycine and GABA(A) receptors in developing spinal cord neurons. Effects on neurite outgrowth. Neuroscience. 108, 493-506 (2001).

Tags

علم الأعصاب، العدد 84، الخلايا العصبية، البرد المجهر الإلكتروني، المجهر الإلكتروني المقطعي، الدماغ، الفئران، والثقافة الخلايا العصبية الأولية، والفحص المورفولوجية
إعداد الخلايا العصبية الأولية للتصور neurites التي في دولة مجمدة رطب عن طريق التصوير المقطعي البرد الإلكترون
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shahmoradian, S. H., Galiano, M. R., … More

Shahmoradian, S. H., Galiano, M. R., Wu, C., Chen, S., Rasband, M. N., Mobley, W. C., Chiu, W. Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography. J. Vis. Exp. (84), e50783, doi:10.3791/50783 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter